熒光染料選擇和數(shù)據(jù)分析

1、熒光染料的選擇和數(shù)據(jù)分析，張辛梅From BD Biosciences，熒光染料的選擇，在流動狀態(tài)下檢測顆粒性物質(zhì)的各種物理和生物特性的儀器。流式細(xì)胞儀原理、傳感信號散射光信號前向散射光信號(FSC)側(cè)散射光信號(SSC)熒光信號、流式細(xì)胞儀原理、散射光信號粒子通過聚集的激光束時，激光向各個方向散射。與激光束方向同軸的正向角度散射信號(FSC)。垂直于激光束的橫向角度散射信號(SSC)。流式細(xì)胞術(shù)原理，前角散射信號(FSC) FSC反映細(xì)胞大小，一般細(xì)胞越大，前角散射信號越強。FSC信號與細(xì)胞的折射率有關(guān)?？梢杂脕肀硎炯?xì)胞凋亡?？梢杂脕碓趨^(qū)分死/活細(xì)胞時設(shè)置門。流式細(xì)胞術(shù)原理，側(cè)角散射光信號(

2、SSC) SSC信號主要反映細(xì)胞的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，內(nèi)部結(jié)構(gòu)越復(fù)雜，SSC信號越強。流式細(xì)胞術(shù)原理，F(xiàn)SC和SSC信號用于檢測和顯示細(xì)胞的物理特性。流式細(xì)胞術(shù)、熒光信號熒光抗體或其他染料染色的粒子通過激光束時，染料吸收光子，轉(zhuǎn)移到這里，返回紀(jì)寧狀態(tài)時，染料釋放能量，大部分以光的形式釋放。這種發(fā)射的光稱為熒光。流式細(xì)胞術(shù)原理、流式細(xì)胞術(shù)原理、流式細(xì)胞術(shù)特性和檢測標(biāo)本，可進(jìn)行特異性、高靈敏度、速度和多參數(shù)分析?？蓹z測的樣本種類包括：(1)外周血、骨髓、細(xì)針穿刺、洗滌劑、實體組織、培養(yǎng)細(xì)胞(2)新！血清、血漿、培養(yǎng)相青、細(xì)胞分裂液、熒光染料選擇的必要性、多色流式細(xì)胞儀的開發(fā)促進(jìn)了新熒光染料的發(fā)現(xiàn)和抗體標(biāo)記物

3、的發(fā)展，但抗體組合選擇非常復(fù)雜。如果隨意選擇熒光素配制的抗體，就不能得到適當(dāng)?shù)慕Y(jié)果。進(jìn)一步考慮熒光染料的選擇，可以避免重復(fù)實驗和錯誤的結(jié)果。流式細(xì)胞術(shù)原理，熒光信號，這里波長，熒光素，發(fā)射波長，了解你的儀器，基本要求-了解你的儀器，試劑選擇從了解你的儀器配置開始激光，但更多的干擾光，熒光染料，488納米激光刺激的染料，熒光染料，633nm了解熒光素的性質(zhì)，了解熒光素的相對熒光強度，了解熒光素/單抗結(jié)合物的亮度，了解各種熒光素對BD LSRII流式細(xì)胞系的染色指數(shù)，了解熒光素的相對熒光強度，各熒光素的相對熒光強度對確定的單抗劑有所不同。由于組合的熒光素不同，陽性/陰性細(xì)胞的S/N比率可能相差4-

4、6倍，了解熒光素的相對熒光強度，每個熒光素的相對熒光強度不同。熒光素的相對熒光強度也不同。了解熒光素的相對熒光強度，F(xiàn)/P比抗體中熒光素分子的數(shù)量(F/P)也影響相對熒光強度。FITC和PerCP的結(jié)合物通常在一個抗體分子中結(jié)合幾個(2-9個，取決于抗體)熒光素分子。APC與PE和抗體的結(jié)合通常為1: 1。復(fù)合染料PE-CY7和APC-CY7通常由PE/APC分子結(jié)合多個CY7分子，PE/APC分子與抗體1: 1結(jié)合，而復(fù)合染料PerCP-CY5.5、PerCP和CY5.5的比例為1: 1。因為熒光，復(fù)合熒光染料-tandem dye，isolated Donor，donor distance

5、 too great，donor distance correct條件需要提供高S/N比率的熒光素，例如PE/APC。選擇熒光素時要考慮。自發(fā)熒光角細(xì)胞群有徐璐不同水平的自發(fā)熒光。所有熒光通道都能觀察到自發(fā)熒光，但是自發(fā)熒光強度隨著波長的延長而迅速降低。對于自發(fā)熒光強的細(xì)胞，如果選擇波長長的熒光素(例如APC)，S/N比率更好。對于自發(fā)熒光弱的細(xì)胞，發(fā)射波長長的熒光素對S/N的提高沒有明顯的改善。FITC是可選的。熒光素選擇要考慮非特異性地結(jié)合大量熒光抗體會產(chǎn)生低水平的非特異性結(jié)合，導(dǎo)致女性細(xì)胞群的熒光超出自發(fā)熒光。非特異性結(jié)合引起單克隆抗體的同型抗體。一些IgG同型抗體可能與某些細(xì)胞的Fc受

6、體結(jié)合，熒光素羰基化染料(如CY3，CY5，CY5.5，CY7)和Tex-Red直接抗體以及一些復(fù)合染料標(biāo)記的抗體在顯示特定子集的細(xì)胞時，有時會提高結(jié)合率。因為在CY5的情況下，這種染料與低親和性FC受體的極低親和性相互作用。這也是復(fù)合染料PE-CY5的特性。選擇熒光素時要考慮的復(fù)合染料：信號衰減復(fù)合染料由于光、固定劑或溫度上升，信號衰減，復(fù)合染料在上層染料中發(fā)光。這種現(xiàn)象從一小部分開始，導(dǎo)致APC或PE染色細(xì)胞群的假陽性。減少樣品暴露在光、高溫或固定劑下，可以大大避免這個問題。選擇染料的注意事項：復(fù)合染料的信號衰減不會降低APC或PE的靈敏度。如果是這樣，就應(yīng)該選擇其他試劑組合。如果需要固定

7、樣品，選擇穩(wěn)定的固定劑可以有效地防止復(fù)合染料的信號衰減。BD: 338036，熒光素選擇，儀器配置的差異，多色分析不能同時選擇“最亮”熒光素，但對于特定儀器，可以根據(jù)熒光的強弱列出可選染料亮度的判斷。熒光染料的靈敏度是區(qū)分背景和弱陽性信號的能力影響背景的因素包括探測器的電子噪聲、細(xì)胞自發(fā)熒光，這些因素還增加了語音熒光棒的寬度(標(biāo)準(zhǔn)偏差)，靈敏度好的標(biāo)準(zhǔn)是染色指數(shù)。DW，D是指兩性桿和陰性桿的平均熒光強度差異。w是女性棒的2SD。熒光素選擇應(yīng)考慮熒光信號之間的干擾。信號檢測背景熒光信號強的細(xì)胞群的SD大于熒光信號弱的細(xì)胞群。多色分析時，熒光素(如FITC)的光泄漏到相鄰熒光素(如PE)的探測器上

8、。漏出的光線越多，需要校準(zhǔn)的東西越多，對分辨率的影響就越大。特別是弱表示的信號。，考慮熒光素選擇，多色熒光信號之間的干涉，考慮熒光素選擇，多色熒光信號之間的干涉IFN APC CD8 APC-CY7 CD4 PE IL-2PE-CY7，考慮熒光素選擇，多色熒光信號之間的干涉IFN APC CD4 PE IL-2PE多色熒光信號組合熒光素選擇，一般6，8試劑組合有效且真實控制：比較單熒光抗體染色和試劑組合染色結(jié)果，防止試劑組合中的其他試劑影響結(jié)果。 熒光控制(fluorescence-MINUS-one control，F(xiàn)MO):移除一個熒光抗體，組合所有其他試劑。熒光素選擇原則，上述原則可能會

9、徐璐沖突，但為了獲得最佳結(jié)果，必須實現(xiàn)平衡。原則1:選擇最適合儀器配置的“亮”熒光染料的原則2:選擇光譜重疊最小的熒光素的原則3:為最暗的抗體選擇最亮的熒光素，反之亦然、數(shù)據(jù)分析、數(shù)據(jù)分析、測試指標(biāo)陽性百分比(%)絕對數(shù)量(g/L)平均熒光強度(MFI)、數(shù)據(jù)分析、直方圖和點圖、數(shù)據(jù)分析、限制感興趣細(xì)胞群的語句設(shè)置FSC到SSC點圖是傳統(tǒng)上用于設(shè)置語句的圖。分析淋巴細(xì)胞群時，CD45 vs SSC粘度設(shè)計語句優(yōu)于FSC vs SSC粘度設(shè)置語句。數(shù)據(jù)分析，語句設(shè)置-確定要分析的目標(biāo)細(xì)胞系列，數(shù)據(jù)分析，語句設(shè)置，數(shù)據(jù)分析，語句設(shè)置，數(shù)據(jù)分析，樣本比較，樣本測試，數(shù)據(jù)分析，直方圖統(tǒng)計表，數(shù)據(jù)分析，

10、樣本測試，數(shù)據(jù)分析，樣本比較，樣本測試，樣本測試圖1，數(shù)據(jù)分析中出現(xiàn)的問題，對照管直方圖左側(cè)與檢查員重疊。但是檢查員直方圖右側(cè)是肩峰，兩條曲線分開。正曲線減去語音曲線的假陽性率陽性率(近似值)和平均熒光強度或弱陽性，圖2，數(shù)據(jù)分析中出現(xiàn)的問題，比較官與檢查官直方圖形狀相同，但是檢查官直方圖的右移無法記錄該結(jié)果。除平均熒光強度外，非特異性染色曹征抗體效價確認(rèn)，圖3，數(shù)據(jù)分析中出現(xiàn)的問題，組合圖形需要設(shè)置邊界。邊界右側(cè)是強陽性，是可報告的百分比。弱陽性分析見上述原則3，圖4。數(shù)據(jù)分析中出現(xiàn)的問題，陽性細(xì)胞群和女性細(xì)胞群明顯分開，在該象限內(nèi)以女性對比線定位，使其他3個象限內(nèi)的假陽性率小于2%。陽性率，強陽性或平均熒光強度，圖5，數(shù)據(jù)分析中出現(xiàn)的問題，陽性組和女性組的區(qū)分明顯，但陽性組部分通過2象限單陽性部分使用圖5原則雙陽性部分，根據(jù)細(xì)胞組方向使用圖7/圖8原則，圖6，數(shù)據(jù)分析中出現(xiàn)的問題，使用陽性組左側(cè)對比，陽性樣本的比例減去假陽性；陽性百分比(近似值)，弱陽性或平均熒光強度，圖7，數(shù)據(jù)分析時出現(xiàn)的問題，陽性群體與對比度一致，部分重疊，但轉(zhuǎn)換為陽性象限