遺傳學(xué)經(jīng)典課件第15章基因工程導(dǎo)論

1、第十九章 基因工程導(dǎo)論,本章學(xué)時(shí)數(shù)：3-4學(xué)時(shí) 本章重點(diǎn)：1.基因工程原理和方法 2.轉(zhuǎn)基因技術(shù)及應(yīng)用,遺傳工程,廣義的遺傳工程 指的是用遺傳學(xué)手段來改造或重組生物的遺傳特性的技術(shù)，包括雜交、細(xì)胞工程、染色體工程、蛋白質(zhì)工程和基因工程等。 狹義的遺傳工程 僅指基因工程。,基因工程,Gene engineering 指用類似工程設(shè)計(jì)的方法，人為地在體外將核酸分子插入質(zhì)粒、病毒或其他載體中，構(gòu)成遺傳物質(zhì)的新組合，并將它轉(zhuǎn)移到原先沒有這類分子的寄主細(xì)胞中擴(kuò)增和表達(dá)。 DNA重組技術(shù)是基因工程的基礎(chǔ)。,重組DNA技術(shù),Recombinant DNA technology,1972年，Berg發(fā)明。 定

2、義：指在體外將不同來源的DNA進(jìn)行剪切和重組，形成嵌合DNA分子，通過載體系統(tǒng)，將之導(dǎo)入宿主細(xì)胞，使其擴(kuò)增表達(dá)從而使宿主細(xì)胞獲得新的遺傳性狀。 步驟：1. 分離制備目的基因或特定的DNA片段 2. 目的基因與載體連接，構(gòu)建重組DNA分子 3.重組DNA分子引入宿主并擴(kuò)增表達(dá)。,質(zhì)粒DNA,提取,酶切,細(xì)胞,連接，形成嵌合質(zhì)粒,在大腸桿菌中擴(kuò)增,DNA重組技術(shù),基因工程的基本內(nèi)容和技術(shù),基因工程的核心技術(shù)是分子克隆 主要內(nèi)容： 從復(fù)雜生物體基因組中，分離帶有目的基因的DNA片段或用化學(xué)方法合成基因。 將目的DNA片段與能夠自我復(fù)制并具有選擇標(biāo)記的載體分子在體外連接，形成重組DNA分子 將重組的D

3、NA分子引入到適宜的受體細(xì)胞中進(jìn)行擴(kuò)增 從繁殖的大量細(xì)胞群體中篩選和鑒定，以獲得重組DNA分子的受體細(xì)胞的克隆 從所篩選的受體細(xì)胞克隆提取已擴(kuò)增的目的基因后，或再將其克隆到表達(dá)載體上，導(dǎo)入寄主細(xì)胞，以便在新的背景下實(shí)現(xiàn)功能表達(dá)，生產(chǎn)人們所需的物質(zhì)，或?qū)⒁褦U(kuò)增的目的基因作進(jìn)一步的分析研究。,基因工程的基本技術(shù),核酸研究技術(shù) 核酸提取技術(shù) 核酸鑒定技術(shù) 核酸測序技術(shù) 核酸人工合成技術(shù)等 培養(yǎng)技術(shù) 微生物培養(yǎng)技術(shù) 動(dòng)植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) 轉(zhuǎn)化技術(shù) 篩選技術(shù)等等,限制性核酸內(nèi)切酶,限制性內(nèi)切核酸酶restriction endonuclease，簡稱限制酶restriction enzyme 可識(shí)別DNA

4、鏈的特定堿基順序并在特定位置將DNA鏈切斷，形成平切或錯(cuò)切端口的水解酶。 限制酶的命名規(guī)則： 通常用細(xì)菌學(xué)名（屬名和種名）、菌株名、特征和發(fā)現(xiàn)的順序縮寫表示。如EcoRI是從含R質(zhì)粒的大腸桿菌中分離的第一個(gè)限制性內(nèi)切酶。,三類限制酶的主要特性,限制酶的共性：只降解雙鏈DNA分子；各有特定的核苷酸序列識(shí)別特異性；酶活性需要鎂離子的激活 根據(jù)結(jié)構(gòu)、切割位點(diǎn)和識(shí)別序列間的距離不同和酶激活所需輔助因子的差異等，可以將限制酶分為三類,II型限制酶的基本性質(zhì),R=A 或 G Y=C 或 T M=A 或 C K=G 或 T S=C 或 G W=A 或 T H=A 或 C 或 T B=C 或 G 或 T V=

5、A 或 C 或 G D=A 或 G 或 T N=A 或 C 或 G 或 T,修飾酶,修飾酶 內(nèi)切酶對(duì)自身的DNA也有可能的破壞。 修飾酶識(shí)別特定的順序并將其甲基化，保護(hù)不被限制性內(nèi)切酶作用。,DNA的限制酶分析和物理圖譜,DNA連接酶,DNA連接酶(ligase)是一種能夠催化DNA中相鄰的3OH和5磷酸基末端之間形成磷酸二酯鍵并把兩段DNA拼接起來的核酸酶。 連接酶催化反應(yīng)的最適溫度是37。 連接酶把兩個(gè)具有粘性末端的DNA分子連接在一起的方式稱作“粘接”，而使平末端的雙鏈DNA分子彼此連接的方式則稱為“端接”。連接酶也用于連接化學(xué)合成的銜接物(linker)，這有助于體外合成人造基因。,反

6、轉(zhuǎn)錄酶,反轉(zhuǎn)錄酶（reverse transcriptase,RT）是一類很獨(dú)特的DNA聚合酶，以RNA為模板來指導(dǎo)DNA的合成。 1970年首先在RNA病毒中發(fā)現(xiàn)，由反轉(zhuǎn)錄病毒的pol基因編碼。 現(xiàn)在常用的反轉(zhuǎn)錄酶由和兩條多肽鏈組成， 肽鏈的羧基端具有反轉(zhuǎn)錄酶活性，而氨基端有RNaseH活性； 肽鏈具有以RNA-DNA雜種分子為底物的53脫氧核酸外切酶活性。,反轉(zhuǎn)錄酶的應(yīng)用,以mRNA為模板合成cDNA 克隆基因 制備探針,目的基因的分離或制備,人工合成目的基因 當(dāng)RNA的堿基順序或蛋白質(zhì)的氨基酸順序已知時(shí)，用特定的儀器進(jìn)行合成。 目的基因分離 富含G/C對(duì)的基因 加熱后用SI核酸酶切除單鏈

7、，離心得到雙鏈片段。 易得到mRNA的基因 用polyT柱分離mRNA，在反轉(zhuǎn)錄酶作用下合成cDNA，除去RNA，用DNA聚合酶下合成雙鏈。 并非嚴(yán)格意義上的基因。 PCR擴(kuò)增 進(jìn)化中DNA保守性很強(qiáng)，不同生物同一功能基因的順序大部分相同，設(shè)計(jì)引物PCR擴(kuò)增。,目的基因的獲得,PCR擴(kuò)增獲得目的基因,/sites/entrez?db=Nucleotide,載體 vector,分子克隆的載體應(yīng)具備的條件： 在細(xì)菌中增殖，可以在菌株間傳遞，也可以轉(zhuǎn)化菌株。 含有酶切位點(diǎn)，最好是對(duì)多種限制酶都有單一切點(diǎn)，切點(diǎn)不在復(fù)制原點(diǎn)內(nèi)。 含有抗性基因（具備對(duì)重

8、組體容易檢測的選擇性遺傳標(biāo)記）。 其他 包括質(zhì)粒、噬菌體和病毒,載體 vector,分類： 克隆載體，以繁殖DNA片段為目的的載體。如pBR322及其衍生質(zhì)粒。 穿梭載體，既能在真核細(xì)胞中復(fù)制又能在原核細(xì)胞中復(fù)制的載體。 表達(dá)載體，用于使克隆的外源基因在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的載體。需要有強(qiáng)啟動(dòng)子和終止子；轉(zhuǎn)錄在誘導(dǎo)時(shí)進(jìn)行，產(chǎn)生的mRNA具有AUG和SD。,構(gòu)建重組DNA,質(zhì)粒載體,基本性質(zhì) 共價(jià)閉合的環(huán)狀雙鏈DNA分子，大小從1kb到200kb不等，常帶有特殊的基因。 含有復(fù)制子，可獨(dú)立復(fù)制但依賴宿主的酶系 松弛型復(fù)制質(zhì)粒和嚴(yán)緊型復(fù)制質(zhì)粒 具有轉(zhuǎn)移特性，接合型質(zhì)粒（自主轉(zhuǎn)移質(zhì)粒）和非接合型質(zhì)粒 具有

9、不相容性,質(zhì)粒載體的構(gòu)建,早期用天然質(zhì)粒，有局限性 改造 改變大小 引入適當(dāng)?shù)倪x擇標(biāo)記 改變限制酶的切割位置 增加合適的酶切位點(diǎn),pBR322的結(jié)構(gòu),4362kb 有HindIII、BamHI、Sal I、Pvu II、Cal I、AvaI和EcoR1單一切點(diǎn) 有Ampr和Tetr基因,pBR322的構(gòu)建,噬菌體載體,噬菌體是迄今為止研究得最為詳盡的一種大腸桿菌雙鏈DNA噬菌體。它的DNA分子兩端各有由12個(gè)核苷酸組成的粘性末端，兩者互補(bǔ)可形成COS位點(diǎn)(cohesiveendsite)。,柯斯質(zhì)粒載體,柯斯質(zhì)粒(cosmid)是人工構(gòu)建的帶有粘性末端cos的一類質(zhì)粒，其主要組成有質(zhì)粒的復(fù)制起

10、始區(qū)和抗藥標(biāo)記、一種或多種限制酶的單一切點(diǎn)以及DNA的COS區(qū)小片段(約20至數(shù)百個(gè)堿基對(duì))。 因而這類質(zhì)粒兼具噬菌體和質(zhì)粒的優(yōu)越性，又具有高容量的克隆能力，容納外源DNA的長度可達(dá)45kb左右。,單鏈DNA噬菌體載體,真核基因克隆的載體,植物 用于植物基因轉(zhuǎn)移的病毒載體 質(zhì)粒載體 動(dòng)物 病毒載體 人工染色體,用于植物基因轉(zhuǎn)移的病毒載體,多種植物病毒經(jīng)過改造后可用作載體。,質(zhì)粒載體,Ti 和Ri等,動(dòng)物病毒載體,改造后失去毒性的動(dòng)物病毒,人工染色體,artificialchromosome 一些真核基因過于龐大不能作為單一片段克隆到噬菌體載體或質(zhì)粒中 P1噬菌體人工染色體(p1artifici

11、alchromosome，PAC) 細(xì)菌人工染色體(bacterialartificialchromosome，BAC) 酵母人工染色體(yeastartificialchromosome，YAC),酵母人工染色體YAC,以酵母作為構(gòu)建人工染色體的材料，是由于其基因組很小，約為114mb，且其中極少內(nèi)含子，沒有重復(fù)序列和假基因。其基因行為和表達(dá)方式基本上與高等生物類似，如復(fù)制、重組、染色體分離等等，因而是研究真核生物分子遺傳學(xué)的重要實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?近年對(duì)有關(guān)酵母染色體的主要組分：著絲粒、自主復(fù)制序列(autonomouslyreplicatingsequence，ARS)及端粒的研究又較清楚，并被

12、分離和克隆出來，其功能區(qū)已縮小到數(shù)百堿基對(duì)，這些對(duì)研究高等生物染色體的結(jié)構(gòu)與功能也是極為有利的。,基因組克隆,用限制性內(nèi)切酶切割整個(gè)基因組DNA，把所得的大量基因組DNA片段與載體連接，然后轉(zhuǎn)化到細(xì)菌中去，讓宿主菌長成克隆。由此而得的克隆中每個(gè)細(xì)胞的載體上都包含有特定的基因組DNA片段。這樣的一套克隆便稱作基因組克隆，而這些克隆中的一套基因組DNA片段則叫做基因組文庫(genomiclibrary)。,基因組文庫 genome library,將某種生物的基因組DNA用限制性內(nèi)切酶切割后分別與載體組合構(gòu)建一系列重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)移到細(xì)菌中，通過細(xì)菌增殖保存基因片段，形成多個(gè)基因克隆。 在得到的克隆數(shù)

13、目多到可以把該生物的全部遺傳信息都包含在內(nèi)時(shí)，這些克隆的總體就稱為基因組文庫。,基因文庫,cDNA文庫的構(gòu)建和應(yīng)用,cDNA基因文庫(cDNAlibrary)是指以mRNA為模板，在反轉(zhuǎn)錄酶及其他一系列酶的催化作用下所獲得的雙鏈cDNA，經(jīng)與適當(dāng)載體連接并轉(zhuǎn)化到寄主細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)增，由此而構(gòu)成包含著相應(yīng)基因編碼序列的一群克隆。 與基因組DNA克隆不同，用作cDNA克隆的真核mRNA，其間隔序列早已在拼接過程中被刪除，而由這種成熟mRNA為模板轉(zhuǎn)變而來的DNA基因，自然也不含有非編碼序列。 cDNA克隆除以mRNA為起始材料這一優(yōu)點(diǎn)外，其構(gòu)建比較簡易可行，而且由于每一個(gè)cDNA克隆都只含有一種mR

14、NA序列，這樣在選擇中出現(xiàn)假陽性的概率也就較低,基因工程技術(shù)的應(yīng)用,基因工程技術(shù)的應(yīng)用,生物合成 基因結(jié)構(gòu)與定位 RFLP 基因治療 環(huán)境治理 分子標(biāo)記,生物合成,目的基因在細(xì)菌中的表達(dá)，產(chǎn)生人們需要的蛋白質(zhì)。 1977，Boyer將編碼人體腦激素的基因轉(zhuǎn)移到大腸桿菌中，使細(xì)菌合成了人體生長激素釋放抑制因子。 發(fā)酵法生產(chǎn)的成本得到大大降低,植物基因工程與農(nóng)作物育種,動(dòng)物基因工程與畜禽品種改良,借助基因工程技術(shù)把外源目的基因?qū)肷臣?xì)胞、胚胎干細(xì)胞和早期胚胎，并在受體染色體上穩(wěn)定整合，使之經(jīng)過各種發(fā)育途徑得到能把外源目的基因傳給子代的個(gè)體，即轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(transgenicanimal)。,基因

15、工程技術(shù)與醫(yī)學(xué)研究,基因治療,1990年，首例基因治療 將有功能的基因插入病毒基因組中，感染體外培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞，篩選轉(zhuǎn)基因表達(dá)細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增，然后注回患者體內(nèi)，可以保持一段時(shí)間的效果，達(dá)到目的。,轉(zhuǎn)基因技術(shù)及應(yīng)用,農(nóng)桿菌介導(dǎo)法,根癌農(nóng)桿菌含有致瘤質(zhì)粒（Ti質(zhì)粒），在T-DNA區(qū)有反向重復(fù)順序，可以與宿主相應(yīng)區(qū)域發(fā)生重組整合。 步驟： 1.構(gòu)建重組Ti質(zhì)粒，導(dǎo)入農(nóng)桿菌 2.農(nóng)桿菌與受體植物共培養(yǎng) 3.篩選轉(zhuǎn)化后代 4.分子檢測,其他轉(zhuǎn)化方法,植物病毒介導(dǎo)法 種質(zhì)系統(tǒng)介導(dǎo)法 花粉管通道法 生殖細(xì)胞浸泡法 子房注射法 ,其他轉(zhuǎn)化方法,物理的方法 電激法 基因槍法 超聲波法 激光微束法 顯微注射法 化學(xué)

16、的方法 PEG法 脂質(zhì)體介導(dǎo)法,動(dòng)物轉(zhuǎn)基因技術(shù)及應(yīng)用,1.受精卵原核顯微注射法 2.胚胎干細(xì)胞介導(dǎo)法 3.反轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)移基因,基因分離新技術(shù),轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽技術(shù) 轉(zhuǎn)座子插入引起突變，表明插入位點(diǎn)的基因發(fā)生變化。tagging 基因組消減技術(shù) 基因敲除技術(shù),分子標(biāo)記,又稱遺傳標(biāo)記（genetic marker），指可以追蹤染色體、染色體的某一片段、某個(gè)基因或某一特定DNA序列在家系中傳遞軌跡的任何一種遺傳特性。 包括： RFLPs RAPD AFLP SNP VNTR、STS、EST,限制性片段長度多態(tài)性RFLP,Restrict fragment length polymerphism 進(jìn)化過程中

17、堿基突變導(dǎo)致酶切位點(diǎn)變化，從而產(chǎn)生限制性片段（RF）在長度和多少上的差異，反映了不同個(gè)體在DNA上的差異。 RF以共顯性方式遺傳，沒有表型效應(yīng)，如果知道某種性狀與一定限制性片段連鎖，則可以判斷后代中該性狀的有無。,RFLP,產(chǎn)前診斷,對(duì)于某些先天性遺傳疾病，嚴(yán)重影響人的生活，可以通過RFLP的產(chǎn)前診斷避免畸形兒或患病兒的出生。 從羊水細(xì)胞或絨毛膜細(xì)胞提取DNA，進(jìn)行酶切和電泳、與父母的RFLP進(jìn)行比較分析，確定。,親子鑒定和犯罪證據(jù),子女獲得來自父母的特異性RFLP，通過比較可以判定子女與成年人（父母）的血緣關(guān)系。 RFLP的個(gè)體差異性，通過犯罪嫌疑人的DNA與犯罪現(xiàn)場得到的樣品DNA的比較，從