質(zhì)粒DNA限制性酶切圖譜分析.ppt

1、一、DNA的限制性酶切實驗原理,實驗三 質(zhì)粒DNA限制性酶切圖譜分析,核酸限制性內(nèi)切酶是一類能識別雙鏈中特定堿基順序的核酸水解酶，這些酶都是從原核生物中發(fā)現(xiàn)，它們的功能猶似高等功物的免疫系統(tǒng)， 用于抗擊外來的侵襲。 限制性內(nèi)切酶以內(nèi)切方式水解核酸鏈中的磷酸二酯鍵， 產(chǎn)生的片段端為，端為。,根據(jù)限制酶的識別切割特性， 催化條件及是否具有修飾酶活性可分為、型三大類。 第一類（I型）限制性內(nèi)切酶能識別專一的核苷酸順序，它們在識別位點很遠的地方任意切割DNA鏈，但是切割的核苷酸順序沒有專一性，是隨機的。這類限制性內(nèi)切酶在DNA重組技術或基因工程中用處不大，無法用于分析DNA結(jié)構(gòu)或克隆基因。這類酶如Ec

2、oB、EcoK等。,1. 限制性內(nèi)切酶的類型,一、DNA的限制性酶切實驗原理,第三類（III型）限制性內(nèi)切酶也有專一的識別順序，在識別順序旁邊幾個核苷酸對的固定位置上切割雙鏈。但這幾個核苷酸對也不是特異性的。因此，這種限制性內(nèi)切酶切割后產(chǎn)生的一定長度DNA片段，具有各種單鏈末端。因此也不能應用于基因克隆。,1. 限制性內(nèi)切酶的類型,一、DNA的限制性酶切實驗原理,第三類（型）限制性內(nèi)切酶就是通常指的限制性內(nèi)切酶. 它們能識別雙鏈的特異順序，并在這個順序內(nèi)進行切割，產(chǎn)生特異的片段； 型酶分子量較小，僅需Mg2+作為催化反應的輔助因子，識別順序一般為個堿基對的反轉(zhuǎn)重復順序； 型內(nèi)切酶切割雙鏈產(chǎn)生種

3、不同的切口端突出；端突出和平末端。 正是得益于限制性的內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)和應用， 才使得人們能在體外有目的地對遺傳物質(zhì)進行改造，從而極大地推動了分子生物學的興旺和發(fā)展。,1. 限制性內(nèi)切酶的類型,一、DNA的限制性酶切實驗原理,粘性末端：是交錯切割，結(jié)果形成兩條單鏈末端，這種末端的核苷酸順序是互補的，可形成氫鍵，所以稱為粘性末端。 如EcoRI的識別順序為： 5 G|AATTC 3 3 CTTAA|G 5 在雙鏈上交錯切割的位置切割后生成 5G AATTC3 3CTTAA G5 各有一個單鏈末端，二條單鏈是互補的，其斷裂的磷酸二酯鍵以及氫鍵可通過DNA連接酶的作用而“粘合”。,II型酶切割方式的另一

4、種是在同一位置上切割雙鏈，產(chǎn)生平頭末端。例如EcoRV 的識別位置是： 5 GAT|ATC 3 3 CTA|TAG 5 切割后形成 5 GAT ATC 3 3 CTA TAG 5 這種末端同樣可以通過DNA連接酶連接起來。,平頭末端：,用屬名的頭一個字母和種名的頭兩個字母表示寄主菌的物種名稱，如E. coli 用Eco表示，所以用斜體字。 用一個字母代表菌株或型，如流感嗜血菌(Heamophilus influenzae)Rd菌株用d，即Hind。 如果一種特殊的寄主菌株，具有幾個不同的限制與修飾酶，則以羅馬數(shù)字表示，如Hind, Hind，Hind等。,2. 限制性核酸內(nèi)切酶的命名法,一、D

5、NA的限制性酶切實驗原理,由 pUC18改造而來，大小為 3162bp 。相當于在 pUC18中增加了帶有 M13 噬菌體 DNA 合成的起始與終止以及包裝進入噬菌體顆粒所必需的順式序列。,瓊脂糖是一種天然聚合長鏈狀分子，可以形成具有剛性的濾孔，凝膠孔徑的大小決定于瓊脂糖的濃度。 DNA分子在堿性緩沖液中帶負電荷，在外加電場作用下向正極泳動。 DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時，有電荷效應與分子篩效應。不同DNA的分子量大小及構(gòu)型不同，電泳時的泳動率就不同，從而分出不同的區(qū)帶。,二、瓊脂糖凝膠電泳實驗原理,瓊脂糖凝膠電泳法分離DNA，主要是利用分子篩效應，遷移速度與分子量的對數(shù)值成反比關系。因而就

6、可依據(jù)DNA分子的大小使其分離。該過程可以通過把分子量標準參照物和樣品一起進行電泳而得到檢測。 溴化乙錠（EB）為扁平狀分子，在紫外光照射下發(fā)射熒光。EB可與DNA分子形成EB-DNA復合物，其熒光強度與DNA的含量成正比。據(jù)此可粗略估計樣品DNA濃度。,二、瓊脂糖凝膠電泳實驗原理,（1）瓊脂糖含液體量大，可達98-99%，近似自由電泳，但是樣品的擴散度比自由電泳小。 （2）電泳速度快。 （3）透明而不吸收紫外線，可以直接用紫外檢測儀作定量測定。 （4）樣品易回收，常用于制備。,瓊脂糖電泳的優(yōu)點,配制多大濃度的瓊脂糖凝膠，要根據(jù)被檢的DNA分子大小來確定。,瓊脂糖凝膠濃度與線性DNA分辨范圍,

7、常用的電泳緩沖液,4 保存?zhèn)溆?,常用的6X載樣緩沖液, 0.25%溴酚藍 ，0.25%二甲苯青 ，40%蔗糖水溶液 0.25%溴酚藍 ，0.25%二甲苯青 ，30%甘油水溶液,三 材料、設備及試劑,質(zhì)粒 ：pUC118、pEGFP 設備 ：eppendorf管、微量取液器，臺式高速離心機，電泳儀、電泳槽、UVP凝膠成像系統(tǒng)、微波爐 試劑：瓊脂糖 、TAE電極緩沖液、Lamdar DNA EcoR I/Hind、 EB、加樣緩沖液,四、操作步驟,1、質(zhì)粒DNA的限制性酶切反應 （1）、將清潔干燥并經(jīng)滅菌的eppendorf管編號,用微量移液槍分別加入DNA 5l， 10緩沖液2l,BSA 2u

8、l，EcoRI 1ul，ddH2O 10ul，用微量離心機甩一下,使溶液集中在管底。此步操作是整個實驗成敗的關鍵,要防止錯加，漏加。使用限制性內(nèi)切酶時應盡量減少其離開冰箱的時間，以免活性降低。 （2）、混勻反應體系后,將eppendorf管置于適當?shù)闹С治锷希ㄈ绮逶谂菽芰习迳希?37水浴保溫1小時,使酶切反應完全。 （3）、每管加入2l 0.1mol/L EDTA(pH8.0),混勻,以停止反應,置于冰箱中保存?zhèn)溆谩?2、瓊脂糖凝膠電泳 (1)稱取0.25g瓊脂糖，置25ml電泳緩沖液中，加熱使瓊脂糖溶解； (2)待溶液冷至60，加入2ul SYBR Green I。 (3)在距離膠模底板0

9、.5-1mm處放置電泳梳，將瓊脂糖溶液倒入膠模中，厚度約3-5mm，注意避免產(chǎn)生氣泡； (4)凝膠完全凝固后，移去梳子和擋板，將凝膠放入電泳槽。加入TAE緩沖液使恰好沒過膠面約1mm； (5)將DNA樣品與1/6體積加樣緩沖液混合后，加入樣品槽中； (6)接通電源，使樣品槽在負極端，用80V的電壓，至溴酚藍到膠前沿時，停止電泳。 (7)凝膠自動處理系統(tǒng)（UVP）觀察和拍照，記錄結(jié)果。 樣品：DNA5ul、6X點樣液2 ul，電極緩沖液5ul pUC118、pEGFP、 pUC118/ EcoRI 、 pEGFP/ EcoRI 、細菌基因組DNA DNA Marker (2ul，6X點樣液2 u

10、l，電極緩沖液5ul ),內(nèi)切酶： 不應混有其它雜蛋白特別是其它內(nèi)切酶或外切酶的污染；注意內(nèi)切酶的識別位點及形成的粘性末端； 內(nèi)切酶的用量：根據(jù)內(nèi)切酶單位和用量而定，通常 1u指在適當條件下，1小時內(nèi)完全酶解ug特定底物所需要的限制性內(nèi)切酶量，使用中一般以ug DNA對u酶短時間為宜。 同時內(nèi)切酶體積不能超過反應體系，因內(nèi)切酶中含甘油，體系中甘油超過會抑制內(nèi)切酶活力； 內(nèi)切酶操作應在低溫下進行（冰上）；使用時防止操作中對內(nèi)切酶的污染。,五、注意事項限制性內(nèi)切酶酶切,作為內(nèi)切酶底物，應該具備一定的純度，其溶液中不 能含酚、氯仿、乙醚、SDS、EDTA、高鹽濃度、酒精等，這些因素的存在均不同程度影

11、響限制性內(nèi)切酶的活力。 這種抑制可通過： 增加酶作用單位數(shù)（1020U/ug DNA）、 增大反應體積以稀釋可能的抑制劑 或延長反應時間加以克服。,五、注意事項限制性內(nèi)切酶酶切,：,反應緩沖液主要由TrisHCl、NaCl、Mg2+組成，其中Mg2+為內(nèi)切酶輔基； TrisHCl維持反應體系pH值在7.2-7.6之間； NaCl濃度不同形成種級別的離子強度： 低鹽（10mM NaCl) 中鹽（50mM NaCl） 高鹽（100mM NaCl） 不同的內(nèi)切酶選擇特定的反應緩沖液。,五、注意事項限制性內(nèi)切酶酶切,反應緩沖液：,大多數(shù)限制酶反應溫度為，如EcoR, Hind, BamH, Pst等，

12、也有如Bcl需在下進行反應， 反應時間根據(jù)酶的單位與用量之比來定，原則是酶：=：,五、注意事項限制性內(nèi)切酶酶切,酶解溫度與時間：,小時即可，充分酶解。,五、注意事項DNA凝膠電泳,1.瓊脂糖：不同廠家、不同批號的瓊脂糖，其雜質(zhì)含量不同，影響DNA的遷移及熒光背景的強度，應有選擇地使用。 2.凝膠的制備：凝膠中所加緩沖液應與電泳槽中的相一致，溶解的凝膠應及時倒入板中，避免倒入前凝固結(jié)塊。倒入板中的凝膠應避免出現(xiàn)氣泡，以免影響電泳結(jié)果。 3.電泳緩沖液：為保持電泳所需的離子強度和pH，應常更新電泳緩沖液。,4. 樣品加入量：一般情況下，0.5cm寬的梳子可加0.5g的DNA量，加樣量的多少依據(jù)加樣

13、孔的大小及DNA中片段的數(shù)量和大小而定。當加樣孔大時，樣品上樣量應相應加大，否則會造成條帶淺甚至辯認不清；反之則應適當減少加樣量，但是上樣量過多會造成加樣孔超載，從而導致拖尾和彌散，對于較大的DNA此現(xiàn)象更明顯。 5. DNA樣品中鹽濃度會影響DNA的遷移率，平行對照樣品應使用同樣的緩沖條件以消除這種影響。DNA遷移率取決于瓊脂糖凝膠的濃度，遷移分子的形狀及大小。采用不同濃度的凝膠有可能分辨范圍廣泛的DNA分子，制備瓊脂糖凝膠可根據(jù)DNA分子的范圍來決定凝膠的濃度。小片段的DNA電泳應采用聚丙烯酰胺凝膠電泳以提高分辨率。,五、注意事項DNA凝膠電泳,內(nèi)切酶失活 DNA不純，含有SDS，酚，ED

14、TA等內(nèi)切酶抑制因子 條件不適（試劑、溫度） DNA酶切位點上的堿基被甲基化 DNA酶切位點上沒有甲基化（如Dpn I） DNA位點上存在其它修飾 DNA不存在該酶識別順序,標準底物檢測酶活性 將DNA過柱純化，乙醇沉淀DNA 檢查反應系統(tǒng)是否最佳 換用對DNA甲基化不敏感的同裂酶酶解，重新將質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化至dcm-，dam-基因型的細菌菌株 換用不同切割非甲基化位點的同裂酶消化DNA（如San3A I代替Dpn I)，重新將質(zhì)粒轉(zhuǎn)至dcm+ dam+菌株中擴增 將DNA底物與DAN混勻進行切割驗證 換用其它的酶切割DNA或過量酶消化進行驗證,六、限制性內(nèi)切酶酶切常見問題分析,問題一：DNA完

15、全沒有被內(nèi)切酶切割,原 因,對 策,內(nèi)切酶活性下降 內(nèi)切酶稀釋不正確 DNA不純，反應條件不佳 內(nèi)切酶識別的DNA位點上的堿基被甲基化或存在其它修飾 部分DNA溶液粘在管壁上 內(nèi)切酶溶液粘度大，取樣不準 酶切后DNA粘末端退火 由于反應溶液、溫度、強烈振蕩使內(nèi)切酶變性 過度稀釋使酶活性降低 反應條件不適 識別位點兩側(cè)插入了可影響酶切效率的核酸順序,用5-10倍量過量消化 用酶貯藏液或反應緩沖液稀釋酶 同上 同上 反應前離心數(shù)秒 將內(nèi)切酶稀釋，增大取樣體積 電泳前將樣品置65保溫5-10分鐘，取出后置冰浴驟冷 使用標準反應緩沖液及溫度，避免強烈振蕩 適當稀釋酶液，反應液稀釋的酶不能貯藏 使用最佳

16、反應體系 加大酶量5-10倍,問題二：DNA切割不完全,原因,對 策,六、限制性內(nèi)切酶酶切常見問題分析,內(nèi)切酶星狀活性 其它內(nèi)切酶污染 底物中含其它DNA雜質(zhì),檢查反應條件：甘油濃度大于12%，鹽度過低，Mn2+的存在及酶：DNA值過大均均可導致星狀活性，降低酶的用量 用DNA作底物檢查酶切結(jié)果 電泳檢查DNA，換用其它酶切，純化DNA片段,問題三：DNA片段數(shù)目多于理論值,原因,對 策,六、限制性內(nèi)切酶酶切常見問題分析,DNA定量錯誤（如RNA含量較高） 在酶切反應液中形成非特異的沉淀,用RNA酶A（無DNA酶）100ug/ml消化DNA樣，酚抽提后沉淀溶解，定量 在反應前透析DNA樣品或用

17、酒精沉淀二次,問題四：酶切后沒有觀察到DNA片段的存在,原因,對 策,五、限制性內(nèi)切酶酶切常見問題分析,保存溫度不合適 以稀釋形式保存 貯藏緩沖液不適當 低蛋白濃度,內(nèi)切酶貯藏在含50%甘油的貯藏液中，應在-20低溫保存 稀釋酶液不宜長期存放，應一次使用 使用廠家推薦的貯藏緩沖液 內(nèi)切酶與500ug/ml的BSA一起保存,問題五：內(nèi)切酶保存期內(nèi)快速失活,原因,對 策,五、限制性內(nèi)切酶酶切常見問題分析,DNA上結(jié)合有蛋白質(zhì) 內(nèi)切酶中含有DNA外切酶,減少酶用量或消化時間，換用新包裝的酶 減少酶用量或消化時間，換用新包裝的酶,問題六：電泳后DNA片段的帶型彌散，不均一,原因,對 策,五、限制性內(nèi)切

18、酶酶切常見問題分析,含磷酸鹽的濃度高 內(nèi)切酶失活不全或含有ATP酶 平末端連接 外切酶污染 連接緩沖液不合適,透析，乙醇沉淀去除磷酸鹽 延長滅活時間或用酚抽提，乙醇沉淀回收DNA 加大T4 DNA Ligase用量 減少酶用量，縮短保溫時間，酚抽提回收DNA 重新配制連接緩沖液,七、DNA電泳常見問題分析,問題七：酶切后的DNA片段連接效率低,原因,對 策,DNA降解 電泳緩沖液陳舊 所用電泳條件不合適 DNA上樣量過多 DNA樣含鹽過高 有蛋白污染 DNA變性,避免核酸酶污染 電泳緩沖液多次使用后，離子強度降低，pH值上升，緩沖能力減弱，從而影響電泳效果。建議經(jīng)常更換電泳緩沖液 電泳時電壓不應超過20V/cm，溫度30；巨大DNA鏈電泳，溫度應15；核查所用電泳緩沖液是否有足夠的緩沖能力 減少凝膠中DNA上樣量 電泳前通過乙醇沉淀去除過多的鹽 電泳前酚抽提去除蛋白 電泳前勿加熱，用20mM NaCl緩沖液稀釋DNA,七、DNA電泳常見問題分析,問題一：DNA帶模糊,原因,對