殺菌劑生物測(cè)定技術(shù).ppt

1、第三章殺菌劑的生物測(cè)定技術(shù)、殺菌劑的生物測(cè)定方法、供試菌株線蟲的生物測(cè)定方法、殺菌劑的盆栽試驗(yàn)、殺菌劑的田間藥效試驗(yàn)。殺菌劑室內(nèi)生物測(cè)定的主要內(nèi)容是作用于細(xì)菌、真菌或其他病原微生物，并根據(jù)其效果判斷殺菌劑的毒性?；?qū)χ参锸┯脷⒕镔|(zhì)，觀察和比較疾病的發(fā)生或嚴(yán)重程度來判斷藥物的效果。供試病原菌應(yīng)具有分類代表性，應(yīng)是易培養(yǎng)、多代繁殖不易產(chǎn)生變異的重要農(nóng)業(yè)植物病害的病原菌。1.待測(cè)菌株，番茄灰霉病菌、番茄早疫病菌、辣椒炭疽病菌、玉米輪紋病菌、蘋果潰瘍病菌、二倍體分生孢子菌、普通待測(cè)菌株、稻瘟病菌、玉米赤霉病菌、玉米赤霉病菌、玉米大斑病菌、棉花枯萎病菌、枯草芽孢桿菌、大白菜1從大量合成化合物2中篩選出

2、可用作殺菌劑的化合物，以尋找治療特定植物病害的有效藥物，因此有必要比較殺菌劑3的毒性，研究殺菌劑2的作用方式和機(jī)理。殺菌劑生物測(cè)定法的應(yīng)用，4殺菌劑抗性研究，5殺菌劑復(fù)配與配方研究，6殺菌劑抗雨水沖刷能力及殘留效應(yīng)研究，7部分殺菌劑(特別是農(nóng)用抗生素)的微量分析，孢子萌發(fā)法，管碟法，有毒培養(yǎng)基培養(yǎng)法，濾紙法，抑菌圈法，孔板法，生長(zhǎng)率法，最小濃度法，葉碟法，第三，室內(nèi)殺菌劑的主要生物測(cè)定方法，孢子萌發(fā)法是測(cè)定殺菌劑毒性最古老、應(yīng)用最廣泛的方法。早在1807年。Prevost采用了這種方法，經(jīng)過許多學(xué)者的改進(jìn)，使其更加規(guī)范和合理。1。孢子萌發(fā)法，原理：將待測(cè)藥物附著在載玻片或其他平面上，然后將待測(cè)

3、病原體的孢子懸液滴在其上(或?qū)乙号c藥液混合后滴在載玻片上)，在保溫條件下培養(yǎng)一定時(shí)間，然后在顯微鏡下觀察，根據(jù)孢子萌發(fā)率判斷殺菌劑的毒力。孢子萌發(fā)法的突出優(yōu)點(diǎn)是速度快，當(dāng)天即可獲得結(jié)果，特別適合篩選保護(hù)劑。以病原菌孢子為指標(biāo)測(cè)定殺菌劑的毒力。孢子溶液與不同濃度的藥液混合，恒溫恒濕培養(yǎng)一定時(shí)間后，即可檢查孢子的發(fā)芽率。一般來說，在低倍顯微鏡下隨機(jī)檢查200個(gè)孢子。孢子萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)，孢子萌發(fā)率(%)，萌發(fā)孢子數(shù)/檢驗(yàn)孢子數(shù)X100。如果對(duì)照組中超過20%的孢子不能發(fā)芽，應(yīng)該重做。對(duì)照發(fā)芽率處理的發(fā)芽率抑制孢子發(fā)芽率(%)X100對(duì)照發(fā)芽率，并計(jì)算抑制率，將孢子發(fā)芽抑制率轉(zhuǎn)化為概率值y；藥物濃度用對(duì)數(shù)

4、表示為x，線性回歸得到回歸方程Ya bx，可得到LC50和LC95。LC50和LC95，孢子萌發(fā)法只適用于產(chǎn)孢真菌。一般檢測(cè)的病原菌有晚疫病菌、稻瘟病菌、玉米赤霉病菌、玉米大斑病菌，孢子萌發(fā)法的適用范圍為2。有毒培養(yǎng)基培養(yǎng)法，有三種方法：(1)抑菌圈法，(2)生長(zhǎng)率法，(3)最小濃度法?；驹硎峭ㄟ^各種方法(管碟法、濾紙片法和孔碟法)使液體藥物與培養(yǎng)基在接種了測(cè)試細(xì)菌的卷心菜培養(yǎng)基(通常在培養(yǎng)皿中)的表面接觸。經(jīng)過一定時(shí)間的恒溫培養(yǎng)，由于藥物的滲透和擴(kuò)散，使施藥部位周圍的細(xì)菌被殺死或生長(zhǎng)受到抑制，根據(jù)抑菌圈的大小，比較了不同殺菌劑的毒力。(1)抑菌圈法的原理，抑菌圈法的優(yōu)點(diǎn)，準(zhǔn)確度高，操作簡(jiǎn)

5、單，抑菌圈法的缺點(diǎn)，溶解度擴(kuò)散，抑菌圈法的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)，抑菌圈法示意圖，含孢子培養(yǎng)基，不同濃度的藥液，根據(jù)在甘藍(lán)培養(yǎng)基表面施藥的方式，抑菌圈法，(1)將供試品用無菌蒸餾水配制成一系列梯度濃度，一般為57個(gè)濃度。(2)配制一定“濃度”的試驗(yàn)菌懸液(孢子懸液適用于真菌)，在低倍放大(15X10倍)下，濃度約為每視野80-100個(gè)孢子。管碟法也被稱為牛津杯。(3)當(dāng)培養(yǎng)基冷卻至50左右(根據(jù)經(jīng)驗(yàn)估算)時(shí)，迅速吸收10毫升菌液并加入培養(yǎng)基中。充分混合后，將其倒入已滅菌的培養(yǎng)皿中，準(zhǔn)備一個(gè)含有細(xì)菌的培養(yǎng)皿。(4)在每盤培養(yǎng)基上以適當(dāng)?shù)拈g隔放置6個(gè)不銹鋼細(xì)管(牛津杯，外徑8.00.1毫米)。內(nèi)徑為6.00.

6、1毫米，高度為10.00.1毫米)，其中一管作為對(duì)照，另外五管由五種不同濃度的藥液制成，在合適的溫度下培養(yǎng)一段時(shí)間，然后取出用十字法測(cè)量抑菌圈的直徑。抑菌圈法的示意圖，上述操作應(yīng)盡可能在無菌條件下進(jìn)行，以防污染。手術(shù)室的溫度應(yīng)該在2628左右。如果室溫太低，約50的培養(yǎng)基在操作過程中會(huì)迅速凝結(jié)，不可能用平交法測(cè)量抑菌圈直徑并消除誤差。注意事項(xiàng)：(1)準(zhǔn)備不同濃度的藥液；(2)制備孢子懸浮液；(3)制作含孢子平板，濾紙法，前三步與上述管碟法完全相同。(4)將滅菌后的圓形濾紙片(直徑為0.6或0.8厘米)放入不同濃度的藥液中，1分鐘后取出，放在含有真菌孢子的培養(yǎng)基上，每盤放6片(五種濃度各一片，另

7、一片為對(duì)照照片)，恒溫培養(yǎng)一定時(shí)間，測(cè)量抑菌直徑。每張濾紙片的間距應(yīng)合適，以防止形成的抑菌圈水平放置，更快更準(zhǔn)確，放下后不能再移動(dòng)。用十字法測(cè)量抑菌圈的直徑。注意事項(xiàng)：用無菌打孔機(jī)在固化的含孢子培養(yǎng)基上直接打一個(gè)圓孔，在圓孔中滴入一定量的藥液，恒溫培養(yǎng)后測(cè)量抑菌圈的大小，比較殺菌劑的毒性。平板法，主要有以下幾個(gè)方面：1 .對(duì)測(cè)試細(xì)菌的要求。在更廣泛的殺菌劑毒性測(cè)定中，對(duì)菌株的要求不必太嚴(yán)格，只要它們易于在培養(yǎng)基中培養(yǎng)且抑菌圈清晰，就可以使用。影響抑菌圈法檢測(cè)結(jié)果的因素，特別是在尋找特定疾病的有效控制藥物時(shí)，實(shí)際上不可能選擇被測(cè)細(xì)菌，但如果采用水平擴(kuò)散法進(jìn)行生物定量測(cè)定，如抗生素效價(jià)測(cè)定，則被測(cè)

8、細(xì)菌必須滿足以下要求：合適的敏感物質(zhì)例如，由于大多數(shù)抗生素具有一定的水溶性，抑菌圈法被廣泛應(yīng)用于抗生素的研究和生產(chǎn)中。然而，相當(dāng)多的殺菌劑不溶于水，所以它們的擴(kuò)散性不好。要使用這種方法，必須用適量的乙醇或丙酮溶解它們，然后用水稀釋至所需濃度。有效且水溶性好，將不同濃度的藥液與熱培養(yǎng)基混合，用該有毒培養(yǎng)基培養(yǎng)疾病，并根據(jù)病原菌的生長(zhǎng)進(jìn)程判斷藥物的毒力。(2)生長(zhǎng)率法有兩個(gè)原則：菌落達(dá)到一定大小所需的時(shí)間和一定時(shí)間內(nèi)菌落的直徑。病原菌生長(zhǎng)的表達(dá)方法，優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單，適用范圍廣，對(duì)乳油、水劑、可濕性粉劑等有良好的重復(fù)性。只要操作仔細(xì)，就能獲得可靠的結(jié)果。生長(zhǎng)率法的優(yōu)缺點(diǎn)：對(duì)供試菌株要求嚴(yán)格，易培養(yǎng)，

9、生長(zhǎng)快，邊緣整齊，產(chǎn)孢慢，是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的重要致病菌。要求被測(cè)試劑具有一定的耐熱性，受熱不易分解。(1)制備菌餅：在無菌條件下，用無菌打孔機(jī)將被測(cè)菌株邊緣的菌塊切掉；(2)制備有毒培養(yǎng)基：將被測(cè)藥物稀釋到一系列梯度濃度后，準(zhǔn)確取一定量的藥液加入到熱培養(yǎng)基中，混合均勻濃縮后是有毒的培養(yǎng)基。生長(zhǎng)速率法：(3)菌餅的移植將菌餅的反面(有菌絲的一面向下附著在培養(yǎng)基上)移植到有毒的培養(yǎng)基平板上，一個(gè)培養(yǎng)皿最好連接一個(gè)菌餅。(4)測(cè)量菌落直徑，恒溫培養(yǎng)預(yù)定時(shí)間，取出培養(yǎng)皿測(cè)量菌落直徑。每個(gè)菌落的直徑在十字架上測(cè)量?jī)纱?。生長(zhǎng)速率法示意圖、菌餅、含藥培養(yǎng)基、菌餅、毒性培養(yǎng)基、純生長(zhǎng)菌落直徑、菌餅直徑控制的純生長(zhǎng)

10、處理的生長(zhǎng)抑制率、X100控制的純生長(zhǎng)抑制率、計(jì)算公式，將計(jì)算出的EC95處理的抑制率(濃度)轉(zhuǎn)化為概率值，并以對(duì)數(shù)表示濃度為圖。在廣泛比較幾種殺菌劑的毒性時(shí)，可采用最低抑制濃度法計(jì)算毒性方程。(3)最小抑制濃度法。最小濃度法的基本原理是將藥物與培養(yǎng)基按等比或等差級(jí)數(shù)濃度混合，然后接種到試驗(yàn)菌中。經(jīng)過一定時(shí)間的恒溫培養(yǎng)，找到了“終點(diǎn)”(明顯抑制試驗(yàn)菌生長(zhǎng)發(fā)育的最高稀釋倍數(shù)，即最低抑制濃度)的濃度。通過比較幾種不同藥物的最佳抑制濃度，我們可以比較它們的毒性。顯然，最低的抑制濃度具有最大的毒性。根據(jù)培養(yǎng)基是固體還是液體，最小抑菌濃度法分為液體培養(yǎng)基稀釋法和固體培養(yǎng)基稀釋法。取幾個(gè)已滅菌的試管，按順

11、序編號(hào)，在每個(gè)試管中加入適合被測(cè)細(xì)菌生長(zhǎng)的液體培養(yǎng)基Nml，然后在第一個(gè)試管中加入一定濃度的測(cè)試液Xml，充分混合后將第一個(gè)試管中的Nml放入第二個(gè)試管中，充分混合后將Xml加入第三個(gè)試管中，直到最后一個(gè)試管沒有加入藥液作為對(duì)照。從倒數(shù)第二個(gè)試管中取出Xml并丟棄，這樣就可以將一系列濃度的順序加倍。液體培養(yǎng)基稀釋法，在每個(gè)試管中加入一滴試驗(yàn)菌懸液，在最佳溫度下培養(yǎng)一定時(shí)間，并取出觀察“終點(diǎn)”,該點(diǎn)一般以濁度為準(zhǔn)，即在一定數(shù)量的試管以下沒有出現(xiàn)明顯的濁度將每種濃度的Xml分離到50毫升滅菌三角瓶中，加入滅菌冷卻的培養(yǎng)基Yml至60左右，立即搖勻，倒入培養(yǎng)皿中凝固。用接種環(huán)蘸試驗(yàn)菌液進(jìn)行劃線培養(yǎng)，

12、觀察一定時(shí)間后最高稀釋倍數(shù)，即最低抑制濃度。固體培養(yǎng)基稀釋法、接種餅，如果它不能生長(zhǎng)，這個(gè)濃度是最低的抑制濃度、交叉接種細(xì)菌，它就不能生長(zhǎng)，這個(gè)濃度是最低的抑制濃度，葉盤法相對(duì)簡(jiǎn)單，可以在室內(nèi)進(jìn)行，這比孢子萌發(fā)法和有毒培養(yǎng)基培養(yǎng)法更接近實(shí)際生產(chǎn)，并可視為盆栽試驗(yàn)的過渡階段。3.葉碟法，葉碟法的基本原理是用不同濃度的化學(xué)物質(zhì)處理易感染試驗(yàn)菌的植物葉片(如蠶豆葉片)，然后將一片培養(yǎng)好的試驗(yàn)菌菌絲體(如立枯絲核菌)放在葉片上，保持一定時(shí)間的濕潤(rùn)，檢查病斑面積，從而測(cè)出試驗(yàn)化學(xué)物質(zhì)的毒性。還有一種葉盤漂浮法，其原理是將易感染被測(cè)細(xì)菌的植物葉片(如黃瓜葉)制成直徑為1.5厘米的葉盤，將它們漂浮在不同濃度

13、的藥液中，將被測(cè)細(xì)菌(如黃瓜霜霉病)的孢子懸液定量滴在葉盤上，在光照下培養(yǎng)一定時(shí)間，調(diào)查病斑面積。葉盤浮動(dòng)法，4。殺線蟲劑生物測(cè)定技術(shù)，被測(cè)線蟲：番茄根結(jié)線蟲，南方根結(jié)線蟲，馬鈴薯莖線蟲，破壞線蟲。然而，如果為某種線蟲選擇了合適的殺線蟲劑，它只能用作指示生物。殺線蟲劑的生物測(cè)定方法根據(jù)制劑的性質(zhì)可分為兩類：(1)非熏蒸劑測(cè)定方法(2)熏蒸劑測(cè)定方法：將蒸餾水稀釋至57個(gè)梯度濃度，將1.5毫升上述藥液加入一個(gè)小玻璃皿(高1厘米，直徑2厘米)，每種濃度重復(fù)3個(gè)皿，然后加入1.5毫升蒸餾水，用清水沖洗分離出的線蟲，并將其挑入小皿。1520皿/皿將盛有藥液和線蟲的小皿放入襯有濕濾紙的大培養(yǎng)皿中，在24

14、25培養(yǎng)箱中放置24小時(shí)或48小時(shí)，然后取出，在雙目顯微鏡下觀察線蟲的存活情況。在非熏蒸劑的生物測(cè)定中，不動(dòng)的、細(xì)長(zhǎng)的線蟲或帶有彎曲的骨狀和黑色顆粒的蠕蟲通常被認(rèn)為是死線蟲。1.觸摸方法2。染色方法、線蟲死亡判斷標(biāo)準(zhǔn)、12345CK、線蟲死亡率X100。濃度作為對(duì)數(shù)值，線蟲死亡率轉(zhuǎn)化為概率值。用農(nóng)藥毒性試驗(yàn)方法計(jì)算LC50或LC95，然后進(jìn)行毒性比較。根據(jù)計(jì)算公式，基于熏蒸的殺線蟲劑毒性試驗(yàn)與農(nóng)藥相似。將濾紙貼在0.33升熏蒸瓶的瓶壁上，在瓶底放一個(gè)小玻璃皿(高1厘米，直徑2厘米)，向皿內(nèi)注入蒸餾水使水位達(dá)到2毫米左右，放入1520只待測(cè)線蟲，在瓶底放一張濾紙片(1X 3毫米)，用微型注射器將待測(cè)試劑加入濾紙上。測(cè)定需要設(shè)定五個(gè)濃度，加入二溴氯丙烷，設(shè)定100、50、25、12、6mgL和非藥物對(duì)照，并重復(fù)三次。24時(shí)25分熏蒸24小時(shí)，檢查線蟲的死亡率。(2)熏蒸劑、線蟲、濾紙片的毒性試驗(yàn)；(5)殺菌劑、化學(xué)藥劑(殺菌劑)、病原菌的盆栽試驗(yàn)、室內(nèi)生物測(cè)定、殺菌劑的盆栽試驗(yàn)、盆栽和缽栽幼苗的生物測(cè)定是研究殺菌劑的有效方法之一。盆栽試驗(yàn)方法克服了體外對(duì)病原體無效和體內(nèi)有效的化合物的遺漏。同時(shí)，盆栽試驗(yàn)方法更接近現(xiàn)場(chǎng)實(shí)際情況，所得數(shù)據(jù)對(duì)指導(dǎo)實(shí)際生產(chǎn)具有較高的參考價(jià)值。此外，盆栽試驗(yàn)所用材料易得，條件易控制。在目前