島津液相色譜儀教材.ppt

1、島津液相色譜儀基礎知識,島津企業(yè)管理（中國）有限公司 分析儀器事業(yè)部 分析中心,島津HPLC的歷史,Started in 1969,1969,1972,1978,1981,1982,1984,1991,1997,2000,2004,2010,2010,GPC系統開發(fā),LC-1（LC-830）銷售,LC-3A系列銷售,LC-4A系列銷售,LC-5A系列銷售,LC-6A系列銷售,LC-10A系列銷售,LC-VP系列銷售,LC-2010銷售,LC-20A Prominence銷售,LC-15C銷售,LC-30A Nexera銷售,與DuPont簽訂許可合同后制造銷售,CDQR方式的單柱塞型送液單元為

2、特征,內置微型計算機的全自動HPLC,世界上首創(chuàng)的微量型LC對應HPLC,世界上最早的積木型HPLC、現在的HPLC的前身,世界上最早采用微沖程送液單元和減低噪音技術的檢測器,采用有效性支持功能的積木型HPLC,追求性能和操作性更加完善的一體型HPLC,為分析實驗室?guī)砀镄碌腍PLC ,為了讓LC分析更為便捷,130MPa耐壓系統，低系統容量，高溫分析和樣品自動前處理,在售產品,島津HPLC的歷史,2000,1997,THECNLOGY BREAKTHROUGH,Flexible HPLC System with Micro-stroke Volume Solvent Delivery Uni

3、t,THECNLOGY BREAKTHROUGH,LC-2010,LC-VP,2008,2004,THECNLOGY BREAKTHROUGH,THECNLOGY BREAKTHROUGH,2010,THECNLOGY BREAKTHROUGH,2010,THECNLOGY BREAKTHROUGH,LC-20A Prominence,UFLC Prominence,LC-15C Essentia,UHPLC LC-30A Nexera,LC-20A Prominence,基礎知識講解內容,1、色譜基礎知識,2、硬件基礎知識,3、定量基礎知識,4、維護基礎知識,第一部分,色譜基礎知識,色譜起源

4、,石油醚,色譜,色素混合物,碳酸鈣顆粒,分離組分,色譜發(fā)展史,20世紀初，俄國植物學家M.S. Tswett提出經典液相色譜法；,20-30年代，柱分配色譜和紙色譜；,50年代，氣相色譜，薄層色譜；,60年代，凝膠滲透色譜及高效液相色譜；,70年代，高效毛細管氣相色譜法；,80年代，電色譜；,90年代，光色譜。,色譜定義,色譜法：利用組分在兩相間分配系數不同而進行分離的技術 流動相：攜帶樣品流過整個系統的流體 固定相：靜止不動的一相，色譜柱,色譜是一種分離技術 色譜的主要目的是對混合物中的目標物 分離和定量,Ethyl Paraben,Propyl Paraben,Methyl Paraben

5、,Butyl Paraben,2.5,3.0,mV,500,400,300,200,100,0,0.0,0.5,1.0,1.5,2.0,min,色譜分類,高效液相色譜,High Performance Liquid Chromatography (HPLC),氣相色譜,Gas Chromatography (GC),薄層色譜,Thin-Layer Chromatography (TLC),毛細管電泳,Capillary Electrophoresis (CE),HPLC vs GC,液相色譜：,以液體作為流動相的色譜分離方法,適用于高沸點、大分子、強極性 和熱穩(wěn)定性差的化合物的分析 流動相具有

6、運載樣品分子和選擇 性分離的雙重作用,氣相色譜：,以氣體作為流動相的色譜分離方法,適用于沸點較低、熱穩(wěn)定性好的中小分子 化合物的分析 流動相只起運載樣品分子的能力,HPLC簡易流程圖,輸液泵,進樣器,柱溫箱,檢測器,色譜柱,儲液瓶,數據處理系統,HPLC特點,分離性能好,-910-12 g）靈敏度高（10,選擇性高（同分異構，旋光異構）,分析速度快,進樣量小（1-100 L）,HPLC分類,反相色譜（reversed phase chromatography）,離子對色譜（ion-pair chromatography）,正相色譜（normal phase chromatography）,離子

7、交換色譜（ion exchange chromatography）,尺寸排阻色譜（GPC / GFC）,反相色譜,流動相的極性大于固定相的極性,C18 (ODS) C8 (octyl) C4 (butyl),苯基 TMS,氰基,非極性,-O-Si(CH3)2-C18H37,SiO2,相互作用力是什么,疏水性,OH,C18 (ODS),SiO2,強 OH,弱,疏水性,如果樣品有, CH3CH2CH2,碳鏈,作用力強,芳香基,如果樣品有, COOH 羧基 NH2 氨基 OH 羥基,作用力弱,反相色譜流動相的選擇,優(yōu)化水相（緩沖液）和有機相的比例非常重要,甲醇、乙腈和THF是常用的有機溶劑。,在有緩

8、沖液的情況下，緩沖液的濃度和pH值 非常重要。,流動相極性變化對分離的影響,20 % 水,30 % 水,40% 水,1: 2: 3: 4:,對羥基苯甲酸甲酯 對羥基苯甲酸乙酯 對羥基苯甲酸丙酯 對羥基苯甲酸丁酯,有機相: 甲醇,固定相極性變化對分離的影響,C8,SiO2,C18 (ODS),一般,樣品,SiO2,強,樣品,C4,SiO2,弱 樣品,固定相極性變化對分離的影響,ODS,C8,TMS,分析條件 柱: Shim-pack CLC-ODS 流動相: MeOH : H2O = 7:3 流速: 1.0 mL/min 溫度: 40 進樣體積: 10 L 檢測器: UV-254 nm,色譜峰

9、1. 苯甲酸甲酯 2. 苯甲酸乙酯 3. n-苯甲酸丙酯 4. n-苯甲酸丁酯,反相離子對色譜,原理,固定相,流動相,樣品離子與流動相中離子對試劑的反離子生成疏水,性離子對，而為反相色譜固定相保留。,疏水性的苯乙烯/二乙烯基苯樹脂或鍵合的硅膠,水（緩沖液）+ 離子對試劑 + 有機溶劑,所帶電荷與待測離子相反,離子對試劑,常用離子對試劑,陰離子化合物, 氫氧化四丁基銨 溴化四丁基銨,陽離子化合物, 丁烷基磺酸鈉 戊烷基磺酸鈉 己烷基磺酸鈉 庚烷基磺酸鈉 辛烷基磺酸鈉 癸烷基磺酸鈉 十二烷基磺酸鈉,（C4） （C5） （C6） （C7） （C8） （C10） （SDS）,反相離子對色譜流動相的選擇

10、,離子對試劑的類型,所帶電荷與待測物質相反,離子對試劑的濃度,10-410-2 mol/L,在一定范圍內，濃度越大，被分離物的保留值越大。,流動相的 pH,反相離子對色譜應用,有機酸、堿、鹽的分離,包括, ,陰陽離子表面活性劑 大分子脂肪酸 烷基磺酸鹽和芳香硫酸鹽 含氮化合物 生物堿 水溶性維生素 酚類,正相色譜,流動相的極性小于固定相的極性,硅 膠 柱: 氰 基 柱: 氨 基 柱: 二醇基柱:,常用 常用 分析糖 分析蛋白質,-Si-CH2CH2CH2CN,SiO2,SiO2,硅膠,-Si-CH2CH2CH2NH2,-Si-CH2CH2CH2OCH(OH)-CH2(OH),化學鍵合相,相互作

11、用力是什么,強,SiOH,SiOH,弱,非常弱,OH,HO,氫鍵力,氫鍵力,如果樣品有, COOH 羧基 NH2 氨基 OH 羥基,氫鍵力強,如果樣品沒有任何官能團，如碳水化合物 如果樣品有大的基團, 由于空間位阻,氫鍵力弱,正相模式下流動相的選擇,主要試劑 烷烴 （戊烷、己烷、庚烷、辛烷） 芳香烴 （苯、甲苯、二甲苯） 二氯甲烷 氯仿 四氯化碳,輔助試劑 甲基-t-丁基醚(MTBE)，乙醚，四氫呋喃(THF)，二氧雜 環(huán)乙烷， 嘧啶，乙酸乙酯，乙腈，丙酮，異丙醇，乙醇， 甲醇,為了調整保留時間，可以選擇主要試劑然后再加入輔助試劑。,流動相極性變化對分離的影響,0 % 甲醇,2 % 甲醇,5%

12、 甲醇,1: 2: 3: 4:,鄰苯二甲酸二辛酯 鄰苯二甲酸二丁酯 鄰苯二甲酸二乙酯 鄰苯二甲酸二甲酯,主要試劑 : 己烷,反相色譜與正相色譜的對比,反相色譜,流動相極性大于固定相極性 適用于能溶于水/有機混合物的中性或非離子化合物分離,正相色譜,流動相極性小于固定相極性 適用于不溶于水/有機混合液的親脂樣品、異構體混 合物的分離和制備HPLC,反相色譜與正相色譜的對比,反相, 保留時間重現性好 固定相耐用,正相, 對立體異構體有很好的分離（Vitamin E等） 保留時間重現性稍差,離子交換色譜,原理：利用被分離組分與固定相之間發(fā)生離子交換的能力差 異來實現分離,固定相：離子交換樹脂,流動相

13、：水緩沖溶液（常用）或有機溶劑與水緩沖溶液的混 合液,離子交換色譜所用的緩沖液：,陰離子分離：氫氧化物、硼酸鹽、碳酸鹽、酚鹽和兩性離子等,陽離子分離：礦物酸，如硝酸、鹽酸、硫酸和甲基磺酸等,離子交換色譜作用力,離子吸引力,樣品,+ + +樣品 + + + +,R +RN,R,- SO,3,離子交換色譜應用,生物領域（蛋白質、農藥、氨基酸分析）,離子分,陽離子交換劑 -） 強陽離子交換劑（SCX）（R-SO3,-）弱陽離子交換劑（WCX）（R-COO,陰離子交換劑 +） 強陰離子交換劑 （SAX） （R4N 弱陰離子交換劑 （WAX）（DEAE）,尺寸排阻色譜法(SEC),原理：利用多孔凝膠固定

14、相的獨特特性，而產生的 一種主要依據分子尺寸大小的差異來分離的液相色 譜方法。,固定相：一種表面惰性、具有一定孔徑的多孔凝膠,應用： 聚合物及生命科學領域,SEC分類,凝膠滲透色譜 （GPC）,主要用于聚合物領域 以有機溶劑為流動相（氯仿，THF，DMF）,常用固定相填料：苯乙烯二乙烯基苯共聚物,凝膠過濾色譜 （GFC）,主要用于生命科學領域 以水溶液為流動相 常用固定相填料：親水性有機凝膠（葡聚糖，瓊脂糖，聚丙烯酰 胺等）,GPC分離原理,固定相是多孔填料，小分子樣品可以進入孔徑內部,樣品與固定相之間無作用力,保留時間不同,樣品,大,填充物顆粒,中,小,孔穴,GPC分離原理,排阻極限,Log

15、 (MW),滲透極限,V,第二部分,硬件基礎知識,HPLC簡易流程圖,脫氣機,色譜柱,進樣器,輸液泵,儲液瓶,柱溫箱,數據處理系統,檢測器,儲液瓶,由機械性能和化學穩(wěn)定性好的不銹鋼、玻璃或聚,四氟乙烯材料制成,使用過程中儲液瓶應適當密閉,所有溶劑應先過濾，再裝入儲液瓶,溶劑前處理-過濾,過濾：0.45 m或更小孔徑濾膜,目的：除去溶劑中的微小顆粒，避免堵塞 色譜柱，尤其是使用無機鹽配制的緩沖液,濾膜類型： 聚四氟乙烯濾膜：適用于所有溶劑，酸和鹽。,醋酸纖維濾膜：不適用于有機溶劑，特別適用于水 基溶劑。,尼龍66濾膜：適用于絕大多數有機溶劑和水溶 液，可以用于強酸，不適用于 DMF，THF， C

16、HCl3 等溶劑。,再生纖維素濾膜：蛋白吸收低，同樣適用于水溶性樣 品和有機溶劑。,溶劑前處理-脫氣,脫氣：除去流動相中溶解或因混合而產生的氣泡,氣泡對測定的影響：,1）泵中氣泡使液流波動，改變保留時間和峰面積 2）柱中氣泡使流動相繞流，峰變形 3）檢測器中的氣泡產生基線波動,常用脫氣方法,超聲脫氣,減壓脫氣,在線脫氣,脫氣機-在線真空脫氣,組成：,脫氣機主要由脫氣管、真空室和 真空泵組成。,脫氣管,真空室,到泵,真空室內的脫氣管由特殊的 透析材料制成，當溶劑流經脫氣 管時，溶解在溶劑中的氣體穿過 管壁被脫出。,儲液瓶,輸液泵,性能要求, 能在高壓下連續(xù)工作, 輸出流量范圍寬, 輸出流量穩(wěn)定、

17、精確度、重復性高,47,島津輸液泵系列,目的,單元,LC-20AT LC-15C,流速范圍,0.001-10ml/min,特性和應用,非凡的耐用性，適于常量 分析,極低脈動，適于半微量LC 和LC-MS分析,極低脈動，適于半微量LC 和 LC-MS分析,分析,LC-20AD LC-30A,LC-20AB,0.0001-10ml/min 0.0001-5ml/min,0.0001-10ml/min,LC-20AT,選配件 支架,壓力傳感器,泵頭固定座 泵頭,輔助進口單向閥,主進口單向閥,LC-20AT,主泵頭,副泵頭,串聯式柱塞往復泵,單向閥,LC-20AD,選配件支架,出口單向閥,壓力傳感器,

18、泵頭,泵頭固 定座,進液口,泵頭,LC-20AD,進口單向閥,泵頭,單向閥,并聯式微體積柱塞往復泵,LC-20AB,壓力傳感器,連接塊,出口單向閥,泵頭,泵頭固定座,進口單向閥,泵B,LC-20AB,進液口,泵A,柱塞往復泵結構示意圖,單向閥工作原理,單向閥結構,單向閥工作原理,吸液沖程,寶石球,拋光面,泵頭,球座,進口單向閥,出口單向閥,排液沖程,洗脫系統組成,等度洗脫系統,梯度洗脫系統,高壓梯度洗脫系統,低壓梯度洗脫系統,等度,B%,B%,梯度,時間,時間,使用梯度洗脫的原因,當采用等度洗脫時：,MeOH / H2O = 6 / 4,分析時間長,分離度差,MeOH / H2O = 8 /

19、2,( column : ODS ),使用梯度洗脫的原因,當采用梯度洗脫時：,95%,甲 醇 濃 度,30%,在最短時間內獲得最佳的分離,梯度洗脫要點,梯度洗脫：,優(yōu)點：可提高分離度、縮短分離時間、降低最小檢測量和提高分離精度,注意事項：,溶劑的純度要高，否則梯度洗脫的重現性差 梯度混合的溶劑互溶性要好 梯度洗脫應使用對流動相組成變化不敏感的選擇性檢測器（如紫 外吸收檢測器或熒光檢測器），而不能使用對流動相組成變化敏 感的通用型檢測器（如示差折光檢測器） 查看空白實驗的數據 遵守分析周期（最初的分析數據不采用）,等度洗脫,輸液泵,進樣器,柱溫箱,檢測器,色譜柱,單一或混合溶劑,高壓梯度系統,A

20、,泵,B,混合器,泵,進樣器,分析柱,柱溫箱,檢測器,數據處理系統,C,泵,梯度準確率高 需要2-3個泵,可以不配在線脫氣機,低壓梯度系統,混合器,分析柱,進樣器,輸液泵,低壓梯度比例閥,檢測器,柱溫箱,數據處理系統,脫氣機,一臺泵最多可使用4種流動相,泵前預混合,需帶在線脫氣機,A,B,C,D,流動相的選擇,采用“HPLC”級溶劑,避免使用會引起柱效損失或保留特性變化的溶劑,對試樣有適宜的溶解度,溶劑粘度要小,與檢測器相匹配,水的等級,水的等級,純化水 蒸餾水 去離子水,吸 光 率,去離子水,純化水,波長 (nm),因為不純物的存在，去離子的吸光率較高,純化水中去除了無機和有機的污染物,水的

21、等級,HPLC用水可以通過以下幾個方法得到：,專門的純水機或超純水機：理想的HPLC用水應為18.2 M 的超純水， 并通過0.22 m的濾膜，除去熱源、有機物、 無機離子及空氣等,去離子水重蒸 二次或三次重蒸水,不管采用何種途徑，配制流動相應用新鮮水,水的等級,未注入樣品時空白梯度的色譜圖,水中不純物的出峰,水中的不純物保留在柱中，隨之被乙腈洗脫,有機溶劑的等級,有機溶劑的等級,HPLC級 優(yōu)級純 分析純,微量分析、梯度洗脫,都經過蒸餾和0.45 m的過濾（除纖維毛,未溶解的機械顆粒）,優(yōu)級純的純度比分析純大，但里面含有防腐劑和抗氧化劑,HPLC級經過0.2 m的過濾，且除去有紫外吸收的雜質

22、,有機溶劑的等級,分析純級和 HPLC 級溶劑的吸光度比較圖,甲醇,乙腈,正己烷,選擇緩沖液的步驟,1. 確定最佳分離狀態(tài)時的流動相pH,2. 選擇具有與流動相的pH相近的pKa的緩沖液,（即使?jié)舛认∫簿哂休^強的緩沖能力）,3. 確認檢測波長下緩沖液是否有大的吸收,（在波長210nm附近進行檢測時，不能用醋 酸和檸檬酸的緩沖液）,常用代表性的弱酸的pKa值,pK1,醋酸,檸檬酸,磷酸,4.87,3.13,2.16,pK2,pK3,4.76,7.21,6.40,12.32,緩沖液的使用,使用前必須過濾,使用后一定要進行清洗 ，以免造成腐蝕、磨損、,阻塞： 用純水沖洗30-60 min(1 ml/

23、min)，再用甲,醇沖洗30 min。,易受到細菌和霉菌的影響,不能直接用有機溶劑 沖洗緩沖鹽溶液,進樣器,手動進樣器 自動進樣器,要求： 無殘留 擴散小 進樣體積可變 可承受高壓,手動進樣器的原理圖,裝填狀態(tài),泵,進樣狀態(tài),泵,6,1,2,6,1,2,5,4,3,5,4,柱子,3,柱子,1,6,5,1,6,5,4,4,進樣量和檢測器響應的關系示意圖,檢 測 器 響 應 值,全量注入,部分注入,定量環(huán)體積的一半,3倍定量環(huán)體積,進樣體積,部分注入和全量注入,部分注入：一般要求進樣量最多為定量環(huán)體積的一半，如,20L的定量環(huán)最多進樣10L的樣品，并且要求每次進樣體積,準確、相同。,全量注入：進樣

24、量最少為定量環(huán)體積的3至5倍，即20L的定,量環(huán)最少進樣60至100L的樣品，這樣才能完全置換樣品定量,環(huán)內殘留的溶液，達到所要求的精密度及重現性。,交叉污染產生的原因,紅色表示殘留樣品,手動進樣方法,一般的方法,1.在進樣狀態(tài)下清洗針口,2.在裝填狀態(tài)下插入微量注射器,3.注入樣品,4.切到進樣狀態(tài),手動進樣方法,便捷的方法（不需清洗）,1.進樣狀態(tài)下插入微量注射器,2.切到裝填狀態(tài),3.注入樣品,4.切回到進樣狀態(tài),自動進樣器,由計算機自動控 制定量閥，按預先編 制注射樣品的操作程 序工作。,自動進樣器,清洗(Rinse)：進樣針移動到清洗口，針的外壁被清洗 液清洗的過程。,排氣(Purg

25、e)：排除管路中的氣泡和更換舊流動相的 過 程。,色譜柱,常用色譜柱,反相,C18 (ODS) 、C8 、C4 、苯基、TMS、 氰基,正相,硅膠、氰基 、氨基、二醇基,離子交換色譜,陽離子交換劑 強陽離子交換劑(SCX) 弱陽離子交換劑(WCX) 陰離子交換劑 強陰離子交換劑(SAX) 弱陰離子交換劑(WAX),R-SO3- R-COO-,NR4+ DEAE,體積排阻色譜,苯乙烯二乙烯基苯共聚物、葡聚糖，瓊脂糖，聚丙烯酰胺,分離模式的選擇,反相色譜：第一選擇,反相離子對色譜/正相色譜：第二選擇,特殊：,高分子量化合物：聚合物、 蛋白或糖類 無機離子 光學異構體,色譜柱的選擇,105,分子量,

26、104,非水相,體積排阻,離子交換,離子對反相,反相,103,水相正相,非極性,中等極性,高極性,色譜柱的連接,死體積可能會引起分離度變差和重現性變差等問題,色譜柱,公螺母,死體積,管線,好的連接,差的連接,色譜柱的使用,新色譜柱使用前：,最好用強溶劑在低流量下 (0.2-0.3 ml/min)沖洗 30 min，長時間未用的分析柱也要同樣處理 新色譜柱先測柱效，并保留色譜圖和實驗條件 定期檢測柱效,色譜柱的使用,1. 流動相：高純度，過濾 pH范圍 有機溶劑與色譜柱匹配互溶、并能溶解 樣品,2. 凈化樣品,3.使用保護柱：與色譜柱填料、內徑一致 避免色譜柱污染,色譜柱的使用,4. 分離條件流

27、速、柱溫、梯度的變化幅度,5. 定期使用強溶劑沖洗柱子,6. 使用緩沖鹽后，要先用含10%甲醇的水溶液沖洗， 再用有機溶劑沖洗,7. 流動相正相反相轉換時用異丙醇過渡,色譜柱的存放,存放前充分沖洗,合適的存放溶劑,接好堵頭，避免固定相干涸,存放環(huán)境,柱溫箱,分析結果重現性好,提高柱效,降低柱壓,保證檢測穩(wěn)定性,柱溫箱,CTO-20A/AC 空氣強制循環(huán)式,CTO-15C,模塊加熱式,CTO-30A,CTO-10AS,液相色譜檢測器的選擇,樣品的性質,分離目的不同，對檢測的要求不同,定量：高選擇性、高靈敏度,定性或制備：通用性,常用檢測器,紫外可見光檢測器 (UV),二極管陣列檢測器 (PDA)

28、,熒光檢測器 (RF),示差折光檢測器 (RID),電導檢測器 (CDD),蒸發(fā)光散射檢測器 (ELSD),質譜檢測器 (LCMS),紫外可見光檢測器,樣品池,C : 濃度,Ein,l,Eout,朗伯-比耳定律,A= Cl = - log (Eout / Ein),(A : 吸光度),紫外可見光檢測器,樣品池,光柵,Ein,Eout,光電二極管,Ein,Ein,參比池,光電二極管,D2 / W 光源,紫外可見光檢測器,紫外檢測器,原理：基于被分析組分對特定波長紫外光的選擇 性吸收。,定量基礎：朗伯-比耳定律，ACL,優(yōu)點： 1）靈敏度高,2）對溫度和流速不敏感,3）可用于梯度洗脫,缺點：僅適用

29、于測定有紫外吸收的物質,雙波長檢測,日本飲用水標準（2004年4月起實施 ）,1.磺草靈（asulam）,2.甲基硫菌靈（thiophanate-methyl）,3.環(huán)草隆1（siduron）,4.環(huán)草隆2（siduron）,5.依普同（iprodione）,分析條件： 色譜柱：Shim-pack VP-ODS (150 mmL. 4.6 mmI.D.),流動相：Acetonitrile/ 50 mM KH2PO4(pH3.0) =55/45(v/v%),流速：1.0 mL/min,柱溫 : 40C,檢測 : 230 nm, 270 nm,進樣 : 10 L,飲用水中4種農藥殘留雙波長分析,波

30、長切換,波長掃描,紫外檢測器,啟動儀器或開燈后，需要一定的時間使基線穩(wěn)定,檢查流通池與管路有無漏液,檢測時，請關閉前面板,清洗流通池，防止堵塞,標準流通池：12 L，耐壓12 MPa,（半微量流通池：2.5 L）,氘燈：2000小時，不要頻繁的開關（3小時）,二極管陣列檢測器,二極管陣列檢測器,樣品池,光柵,D2 / W 燈,每一組分可在每一波 長處得到一吸光度值,二極管陣列,二極管陣列檢測器,光譜,色譜,吸光度,波 長,時間,二極管陣列檢測器,二極管陣列檢測器,采集三維譜圖，可以發(fā)現單波長檢測時未,檢測到的峰,光譜定性，譜庫搜索,峰純度檢驗,二極管陣列檢測器,啟動儀器或開燈后，需要一定的時間

31、使基線穩(wěn)定,檢查流通池與管路有無漏液,檢測時，請關閉前面板,清洗流通池，防止堵塞,標準流通池：10 L，耐壓12 MPa,（半微量流通池：2.5 L）,氘燈：2000小時，不要頻繁的開關（3小時）,熒光檢測器,激發(fā)波長,+ h1,*,*,A*,h1,A,h2,h2+,發(fā)射波長,熒光,熒光檢測器,氙燈,光電倍增管,光柵,樣品池,熒光檢測器,熒光檢測器,原理：基于被分析組分發(fā)射的熒光強度進行檢測,優(yōu)點： 1）靈敏度高，是最靈敏的檢測器之一,2）選擇性好,3）對溫度和流速不敏感，可用于梯度洗脫,缺點：僅適用于測定可產生熒光的物質或能經過衍生化,反應產生熒光的物質,可檢測物質：多環(huán)芳烴、霉菌毒素、卟啉

32、、兒茶酚氨等（具,有對稱共軛體系）或氨基酸、脂肪酸等需衍生后檢測樣品,熒光檢測器,啟動儀器或開燈后，需要一定的時間使基線穩(wěn)定,檢查流通池與管路有無漏液,檢測時，請關閉前面板,清洗流通池，防止堵塞,oC時， 溫度上升，熒光強度下降（常溫附近溫度變化超過1,有些化合物強度變化達到5%）,標準流通池：12 L，耐壓2 MPa,氙燈：2000小時(RF-20AxL)，不要頻繁的開關,熒光檢測器應用,氨基酸檢測OPA衍生,CHO,A,A,N-R,+ R-NH2,CHO,o-phthalaldhyde (OPA),脂肪酸檢測ADAM衍生,+ R-COOH,CHN2,9-anthryldiazomethan

33、e (ADAM),CH2OCOR,氨基酸檢測OPA柱后衍生,Taurine,mV 700 檢測器 A:Ex:350nm,Em:450nm,600,500,400,300,Asp,200,100,0,0.0,5.0,10.0,15.0,20.0,25.0,30.0,35.0,40.0,45.0,50.0,55.0,60.0min,Thr Ser,Gly,Met isoLeu Leu Tyr Phe,His,Lys Ammonia,Glu Pro,各組分濃度：0.02 mol/mL，進樣10 L,Cys,Val,Arg,Ala,示差折光檢測器,光學系統,鎢燈,準直鏡,狹縫,物鏡,狹縫,反射鏡,調零

34、透鏡,硅光電池,樣品池,示差折光檢測器,示差折光檢測器,示差折光檢測器,原理：連續(xù)測定流通池中溶液折射率來測定試樣中,各組分濃度。,優(yōu)點：通用型檢測器,缺點：,1）對溫度變化敏感,2）對溶劑組成變化敏感，不能用于梯度檢測,3）屬于中等靈敏度的檢測器,示差折光檢測器,檢測時，請關閉前面板,清洗流通池，防止堵塞,流通池：9 L，耐壓2 MPa,進口：63.5 L,出口：280.2 L,鎢燈：20000小時,糖分析例,分析條件 色譜柱 : Shim-pack CLC-NH2 流動相 : 乙腈 / 水= 7 / 3 流速 : 1.0 mL/min 溫度 : 室溫,峰,1. 甘油 2. 木糖 3. 果糖

35、 4. 葡萄糖 5. 蔗糖 6.甘露糖 7. 乳糖,電導檢測器,V,I,K (電導) = I A / E V 2 / L cm x k=A cm (k : 電導率),k= (I/E)x(L/A),A,A,電極,L,電極,電導檢測器,原理：根據物質在某些介質中電離后所產生的電導率的變化來 測定電離物質含量，廣泛應用于離子色譜法。,優(yōu)點：對流動相流速和壓力的改變不敏感,缺點：對溫度變化敏感,（溫度每升高1，電導率增加2 %-2.5 %),用途：主要用于離子色譜，檢測無機和有機離子,電導檢測器,清洗流通池，防止堵塞,流通池：0.25 L，耐壓2.9 MPa,海水中陰離子分析例,分析條件 色譜柱 :

36、Shim-pack IC-A3 流動相 : 8.0 mM p-hydroxybenzoic acid 3.2 mM Bis-Tris 流速: 1.5 mL/min 溫度: 40 進樣體積 : 100 L,色譜峰 1. F- 2. Cl - 3. NO2- 4. Br - 5. NO3- 6. SO4 2-,(1.4 ppm) (10200 ppm) (10 ppm) (43 ppm) (44 ppm) (431 ppm),陽離子分析例,+,+,+,+,2+,2+,分析條件 色譜柱 : Shim-pack IC-C1 流動相 : 5 nM 硝酸溶液 流速 : 1.5 mL/min 溫度 : 40

37、oC 進樣：50 L,蒸發(fā)光散射檢測器,流動相,霧化,載氣,霧化器,蒸發(fā),光電倍增管,檢測池,檢測,光源,光電倍增管,漂移管,LED,蒸發(fā)光散射檢測器,原理: 流出物在檢測器中被高速氮氣噴成霧狀液滴，溶劑揮發(fā) 后，溶質形成微小顆粒，被載氣帶到檢測系統，進入散射室 中，檢驗散射光的強度。,優(yōu)點: 消除了溶劑干擾以及溫度變化帶來的基線漂移，可梯度 洗脫，靈敏度高，是HPLC的通用型檢測器。,缺點： 不能使用非揮發(fā)性緩沖鹽做流動相，如磷酸鹽。,蒸發(fā)光散射檢測器,廢氣不能直接排放在室內 如果流動相中含有機溶劑，使用惰性氣體做霧化氣 避免使用在工作溫度下能引起爆炸的溶劑和霧化氣 流動相中不使用非揮發(fā)性鹽

38、 霧化氣壓力不要超過450 kPa 先開氣，后開泵 保證霧化器虹吸出口充滿液體 不要打開前門 LED燈：5000小時,PEG-1000分析例,質譜檢測器,強大的定性和選擇性能力,多組份樣品的準確定性 未充分分離組份峰的鑒別 消除雜質干擾,可作為便捷的定性分析,用于合成和衍生反應的研究 作NMR預分析的質譜鑒定,人造色素質譜圖,(x1,000,000) 8.0,7.0,6.0,1,2 3,4,5,6,8,9,7,10,11,12,5.0,4.0,3.0,2.0,1.0,0.0 0.0,TIC,m/z 467 m/z 537 m/z 421 m/z 407 m/z 451 m/z 763 m/z

39、747 m/z 557 m/z 784.5 m/z 834.5 m/z 972.5,0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0,3.5,4.0,4.5,5.0,min,色譜柱:,流動相:,時間程序: 流速: 進樣體積: 柱溫:,Shim-pack XR-ODS (50 mmL x 2.0 mmI.D. Particle size: 2.2 m) A; 20mmol/L NH4Ac (pH 4.7) B; 20mmol/L NH4Ac (pH 4.7) /A CN=1/1 10%B (0 min) - 100%B (5.0 min) 0.5 mL/min 5 L 40 C,掃描范圍 m/z

40、200-1200,1: tartrazine 2: amaranth 3: indigo carmine, 4: new coccine 5: sunset yellow FCF 6: allura red AC,7: fast green FCF 8: brilliant blue FCF 9: acid red 10: phloxine B 11: erythrosine 12: rose bengal,第三部分,定量基礎知識,定性方法,色譜峰的定性鑒別,通過保留值(通常是保留時間)進行定性,需要指定保留時間誤差范圍（時間窗、時間帶）,在相同的分析條件下,保留時間相同并不肯定是同樣的組份,

41、保留時間不同肯定不是同樣的組份,定性確證,僅僅通過保留時間并不能完全確證該物質,通過加入標準物確認,通過改變色譜條件確認,光譜和質譜信息也可以作為進一步確證手段,其他儀器方法確證,定量分析的基本要求,需要有純物質作標準,被定量組分峰要與其它峰達到基線分離,符合定性參數要求,選擇合適的定量方法,定量分析基本公式,在某些條件限定下，被測組分的濃度與檢測器的響應值成正比的關系。 （蒸發(fā)光散射檢測器濃度與峰面積不成線性，分別取對數后成線性 ）,Ci= fi Ai Ci= fi Hi,Ci： fi: Ai： Hi：,組分濃度 響應因子，與組分的物理化學性質和檢測器的性質有關 組分響應面積 組分響應高度,

42、實際修飾公式： Y=aX+b,常用定量方法,面積歸一化,外標法,內標法,標準加入法,面積歸一化法,不能作為準確定量的方法，僅在特定情況下使用,公式,特點：,Ai Ci % = 100 % Ai ,1、無需做校正，簡便，快速,2、進樣量不嚴格要求,3、要求所有組分都流出并且被檢測到,4、要求所有組分的響應因子相當,外標法,濃度,C1,A2,C2,面積,A1,A4,A3,A2,A1,A4,C4,C1,C2,C3 濃度,C4,峰面積,標準曲線,A3,C3,外標法,C i = f i Ai,fii 組分工作曲線的斜率,實驗室最常用的定量方法，定量結果準確,特點：,1、不需所有峰都流出或被檢測到，只對目

43、標組分作校正,2、需要標準樣品,3、進樣量必須準確,4、儀器必須有良好的穩(wěn)定性,單點校正法,當被測試樣中各組分濃度變化范圍不大時，可不必繪制多點的標準 曲線，而用單點校正法（比較法）。配制一個和被測組分含量接近的標 準溶液，定量進樣，根據被測組分和外標組分峰面積比或峰高比計算被 測組分的含量。,wi Ai = ws As,當方法存在較大的系統誤差, 單點校正法的誤差較大。,內標法,濃度,目標 內標,C1,CIS,A2 AIS,C2,CIS,A3 AIS,C3,CIS,A4 AIS,C4,CIS,C1/CIS C2 /CIS C3 /CIS C4 /CIS,濃度比: 目標 / 內標,面積,A1

44、AIS,A4 /AIS,A3 /AIS,A2 /AIS,A1/AIS,面積比: 目標/ 內標,標準曲線,內標法,試樣配制：準確稱取一定量的試樣Wi，加入一定量內標物WS,計算公式：,wi = f i Ai,ws = f s As,f i AiAi wi =ws = f i ws f s AsAs,fi為待測組分 (i) 對內標物 (s) 的質量相對校正因 子,內標法特點,多用在國際標準和規(guī)定比較嚴格的方法中,特點：,1、進樣量不嚴格要求,2、只對所測組分作校正,3、必須在樣品中加一內標組分,4、操作較為繁瑣,5、選擇內標物比較困難,選擇內標物應注意,1、理化性質與待測物相近,2、在樣品中不存在

45、且不與樣品中組分發(fā)生化學反應,3、內標物與待測物響應相近,4、與待測物有良好的分離，但又不能相距太遠,5、與待測物的峰面積比為0.7-1.3最好，因此要根據待測物 的 濃度確定內標物的添加量,標準加入法,當難以選擇合適的內標物或無空白樣品時，以欲測組分的純物 質為內標物加入到待測樣品中，然后在相同的色譜條件下，測定加 入欲測組分前后的峰面積，從而計算待測組分的含量。,wi = f i Ai,wi + wi = f i Ai ,wi + wi Ai = wiAi,fi = fi ,wi wi = Ai 1 Ai,標準加入法特點,1、不需另外選擇內標物,2、進樣量不必十分準確，操作簡單,3、兩次色

46、譜條件完全相同以保證校正因,子完全相等,定量計算常用術語,Integration parameters ：積分參數，規(guī)定計算出峰面積的方法,Identification ：,定性參數，保留時間及允許誤差,Quantification method： 定量方法，選擇定量方法(外標法,內標法等),Curve fit Type：,Compound table：,曲線擬合類型，包括線性、二次方程等,化合物表，定義要進行定量計算的組分，其中,包括定性和定量參數,1) Type： 組分類型，指組分的分析類別 Target：要計算的目標組分 ISTD：指該組分為添加的內標組分 Reference： 指該組分

47、為參比組分，用來對目標組分進行確認 ISTD&Ref.： 指該組分既是內標組分，又是參比組分 2) Conc： 濃度，指目標組分的計算結果,定量計算常用術語,Sample Type ：樣品類型，規(guī)定該數據的計算類別,Standard ：標樣， 濃度已知的標準品，用來制作標準曲線,Unknown ：未知樣，濃度待測的目標組分,Sample Amt.：樣品量, 待測樣品的原始稱樣量, 在計算結果中會除以該數值,Dil. Factor ：稀釋因子,待測樣品的稀釋倍數，在計算結果中會乘以該數值,ISTD Amt. ：內標量，內標組分的添加量,Level ：樣品濃度水平，規(guī)定數據的濃度級別， Unkno

48、wn為0，,Standard為整數，濃度由低到高依次為1、2、3、4、5 ,Peak Table ：,峰表，所有積分結果的列表,數據處理參數,積分參數：（Width, Slope, Drift, T.DBL等）,定性參數：保留時間及允許誤差（時間窗，時間帶）,定量參數：,1) 定量方法：外標法、內標法、面積歸一法等,2) 曲線點數：一點或多點,3) 曲線擬合：線性、折線、曲線,積分參數,積分參數,基本積分參數,Channel：通道，指定檢測器檢測信號的通道,Width ：半峰寬，峰的半高寬，排除峰寬小于最小峰寬的峰,Slope ：斜率，用來判斷出峰起點、終點以及濾除低平噪聲,Drift ：漂移

49、，判斷相鄰峰的積分方式,設定值為0時，積分儀將自動判斷,如Drift與基線至峰谷連線較接近時，積分面積值可能變化較,大,T.DBL ：時間變參，根據時間自動改變峰寬和斜率,Minimum area：最小峰面積，排除面積小于該值的峰,Slope的設定,Slope,Slope,Slope峰斜率，作為峰計 算,Slope,Slope峰斜率，作為噪聲濾除,Slope,Slope峰斜率，積分不穩(wěn)定，須手動設 定,Drift值的設定(手動校正),Drift,Drift,Drift,Drift,Drift,Drift,注：1) 設定值為0時，積分儀將自動判斷 2) 如Drift與基線至峰谷連線較接近時，積分

50、面積值可能變化較大,Drift值的設定(自動校正),谷寬半峰高寬度 T2T1,谷寬半峰高寬度 T2T1,.DBL的設定,T.DBL：時間變參，根據時間自動改變峰寬和斜率,等度洗脫時，出峰時間越長，峰越寬 設定值為0時，根據寬度自動判斷 默認值為1000，此時該參數不起作用,在實際使用中，一般使用默認設定,積分鎖定,Integration Off to On：鎖定某一時間范圍的峰，使之不計算積分,mAU (x10) 2.5 202nm4nm (1.00),2.0,1.5,1.0,0.5,0.0,0.0,0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0,3.5,4.0,4.5,min,Integra

51、tion Off to On,定性參數,定性參數,絕對保留時間,相對保留時間,保留時間允許誤差,時間窗：相對允差, 一般設為5% 時間帶：絕對允差, 一般設為0.050.25 min,定量參數,定量參數,定量方法： 面積歸一法、外標法、內標法等,工作曲線的制作： 曲線點數：一點、兩點及多點 曲線計算：線性、折線、二次曲線、三次曲線,影響定量結果的因素,保留時間的重現性（對GPC影響很大）,樣品問題（雜質、溶劑、穩(wěn)定性、配制）,進樣問題（準確度和精密度）,檢測器的性能（影響線性、檢出限、靈敏度）,方法的可靠性,積分參數的設定,第四部分,維護基礎知識,日常維護,目的：維持儀器處于正常運作狀態(tài)，有效

52、的降低儀器發(fā)生故障的 頻率，延長儀器的使用壽命。,準備工作： 使用&維護日志 設備的耗材和備件 維護工具盒 試劑（甲醇、異丙醇、稀硝酸等） 超聲波清洗機,液相系統維護流程圖,線路過濾器,單向閥,色譜柱,柱塞密封圈,進樣器,檢測器,吸濾頭,輸液系統日常維護部件,排液閥,清洗流路密封圈,柱塞,保險絲,柱塞密封圈,吸濾頭,主進口單向閥 線路過濾器,輔助進口單向閥,管線選擇,材料 不銹鋼 特氟隆 (Teflon) 聚醚醚酮 (PEEK),尺寸,不銹鋼材質管路,0.1 mm I.D. x 1.6 mm O.D.,0.3 mm I.D. x 1.6 mm O.D.,0.5 mm I.D. x 1.6 mm

53、 O.D.,0.8 mm I.D. x 1.6 mm O.D.,0.13 mm I.D. x 1.6 mm O.D.,0.25 mm I.D. x 1.6 mm O.D.,PEEK材質管路,管線材料,不銹鋼 (可用于所有連接) 能承受幾百MPa 壓力 酸性或高濃度鹽環(huán)境中易腐蝕 (尤其在pH小于2時) PEEK (可用于所有連接) 能承受高達 25 MPa壓力 可在整個pH范圍(pH 1-14)內使用,不適用高溶解性溶劑如三氯甲烷、四氫呋喃等 Teflon (用于柱后阻尼管、反應管和排液管) 化學惰性大 僅能承受 0.5 MPa壓力,管線材料,使用高溶解性溶劑如氯仿、THF等,當ID.0.25

54、 mm或0.13 mm、氯仿、THF 25 %以下，10 MPa以下的使用,條件時，在實際應用中一般沒有問題。,特氟隆材質管路,作為廢液管的時候，請勿隨意增長或縮短其長度。增長管路，會提高,背壓，有損壞檢測器的危險；縮短管路，容易使得檢測器內產生氣泡,。,接頭,不銹鋼接頭 / 墊圈,主要用于輸液泵、進樣器的管路連接,能承受 40 MPa以上的壓力,一旦固定，墊圈不可再動,墊圈,不銹鋼接頭,PEEK接頭,主要用于色譜柱、檢測器的管路連接,易于安裝 能承受 25 MPa的壓力,容易產生死體積,PEEK接頭,死體積,產生原因：由于管路連接不好產生的額外體積,死體積可能會引起分離度下降和重現性變差等問

55、題,色譜柱,公螺母,死體積,管線,好的連接,差的連接,吸濾頭,材料：不銹鋼燒結(或陶瓷），孔徑 10 m,功能：防止較大固體不溶物進入液相色譜,系統,日常維護：定期使用異丙醇（或5稀硝酸）,清洗,故障：吸濾頭堵塞,現象：管路中不斷有氣泡生成,措施：用異丙醇（或5稀硝酸）浸泡并進行超聲波浴清洗，再用蒸,餾水清洗至中性,LC-20AT,選配件支 架,壓力傳感器,泵頭固定座 泵頭,輔助進口單向閥,主進口單向閥,LC-20AT,LC-20AD,選配件支架,出口單向閥,壓力傳感器,泵頭,泵頭固定座,進口單向閥,進液口,LC-20AD,單向閥結構,注意：,請不要分解閥心A和閥心B,重新組裝后性能不被保證，

56、輸液可能不穩(wěn)定,單向閥故障處理,故障：寶石球或球座受污導致密封不好,表現：系統壓力波動大,措施：,1）打開排液閥，用泵輸送或用注射針打入異丙醇進行清洗,2）拆下單向閥，放入異丙醇中，超聲波浴清洗,注意：超聲波清洗時開口端向上放置。,單向閥故障處理,故障：寶石球粘附于墊片,表現：泵無法吸液或排液，流路不通,措施：1）用針筒抽出口單向閥，利用產生的負壓使寶石球,與墊片分開。,2）拆下單向閥，放入異丙醇或水中，用超聲波浴清洗。,柱塞密封圈,柱塞密封圈,LC-20AD LC-20AB LC-10ADvp,部件號228-35146,取下和安裝 柱塞密封圈工具,柱塞密封圈,LC-20AT LC-10ATv

57、p,部件號：228-35145,柱塞密封圈故障處理,密封圈,故障：密封圈磨損導致密封不良,現象：系統壓力波動大或漏液,措施：更換密封圈,注意： 拆卸泵頭前，必須將柱塞桿復位 （儀器面板上的P-SET界面）,柱塞桿,泵頭清洗管路,流動相,線路過濾器,排液閥,壓力傳感器,故障：堵塞,現象：系統壓力偏高,判斷依據：關閉排液閥，斷開出口管路，,設定流速1mL/min，如壓力0.3 MPa，,可以判定為線路過濾器堵塞。,措施：以異丙醇(或5稀硝酸)為清洗劑，超聲波浴清洗。,再用水洗至中性。,線路過濾器,流動相,過濾器的更換,如果清洗無法解決故障，需要更換線路過濾器。,舊過濾器的取出,新過濾器的安裝,新型

58、號線路過濾器,部件號：228-35871-99,混合器,混合器不同體積的連接方法,混合器故障處理,常見故障：堵塞 混合器堵塞往往是由于混合,器過濾組件堵塞引起的。,處理方法： 按圖中結構卸下過濾組件， 5%稀硝酸或其他溶劑超聲波浴 清洗或更換新的組件。,標準或半微量混合器用 部件號：228-18872-93,LC-20AT 各部件定期檢查和維護清單,檢查/維護項目,更換柱塞密封圈,清洗并檢查（更換） 柱塞,更換清洗流路密封 圈,檢查（更換）輔助 進口單向閥并做超 聲波浴清洗,檢查（更換）主進 口單向閥并做超聲 波浴清洗,檢查（更換）并清 洗線路過濾器,檢查（更換）并清 洗吸濾頭,更換排液閥,6

59、個月,1年,2年,3年,備注,LC-20AD 各部件定期檢查和維護清單,檢查/維護項目,更換柱塞密封圈,清洗并檢查（更換） 柱塞,檢查（更換）膜片,檢查（更換）出口 單向閥并做超聲波 浴清洗,檢查（更換）進口 單向閥并做超聲波 浴清洗,檢查（更換）并清 洗線路過濾器,檢查（更換）并清 洗吸濾頭,更換排液閥,泵組件潤滑,請咨詢島津各辦事處維修部,6個月,1年,更換柱塞時同時更換,2年,3年,備注,手動進樣器,手動進樣器操作注意事項,針頭密封墊,1. 進樣請使用液相色譜專用平頭進樣針,2. 進樣時，進樣針應插入針導管到底,3. 清洗請使用專用進樣口清洗器,不銹鋼套 4. 樣品溶液pH小于10， 常用密封墊的Vespel材質 彈簧 （適用pH10），否則換Tefzel或PEEK材質的 轉子 密封墊（pH 0-14） 定子,5. 不使用手動進樣器時將針頭留在進樣器內,手動進樣器維護要點,1. 將附件進樣口清洗器裝在注射器上,2. 用注射器吸入清洗液 （試樣溶液或者不含 鹽的流動相等）,3. 在進樣（INJECT）狀態(tài)下，將進樣口清洗 器壓接在針導管上，注入清洗液約1mL,4. 使用緩沖溶