第4章 酶的分離純化.ppt

1、第四章 酶的分離與純化,酶的分離純化策略 酶液的制備與初分離 酶的分離純化方法 酶純度的檢驗,酶的提取和分離純化是指把酶從組織中、細胞內(nèi)或細胞外液中提取出來并使之達到與使用目的相適應(yīng)的純度。 酶的分離提純包括三個基本環(huán)節(jié)： 一是抽提，即把酶從材料轉(zhuǎn)入溶劑中制成酶溶液； 二是純化，即把雜質(zhì)從酶溶液中除掉或從酶溶液中把酶分離出來； 三是制劑，即將酶制成各種劑型。,空間結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性,有活性的酶的空間穩(wěn)定性有限，不同的酶可能有不同的穩(wěn)定性 保持穩(wěn)定性的環(huán)境因素 離子強度適當 最適pH 低溫 加入穩(wěn)定性：甘油、糖類、聚乙二醇等,第一節(jié) 酶的分離純化策略,一、酶分離純化基本原則 防止變性失活 低溫進行 防

2、止局部的過酸過堿 避免劇烈攪拌和泡沫形成 重金屬離子能引起酶失活，有機溶劑會使酶失活，微生物污染以及蛋白酶的存在會使酶分解破壞， 其他因素：水質(zhì)、輔因子等,表4-2 酶蛋白性質(zhì)及其對純化策略的影響,二、酶的分離純化策略 1、目的明確 用途： 醫(yī)療用途、活體研究等 極高純度99% X射線結(jié)晶、物理化學(xué)性質(zhì)研究等 高純度95-99% N端測序、生產(chǎn)抗原等 一般純度95%,2、建立一個可靠、快速的分析方法 目標酶蛋白，蛋白質(zhì)純度的檢測，總蛋白量的檢測，對必須清除的雜質(zhì)的分析 純化方法的選擇-解決純化倍數(shù)和回收率的矛盾,建立以下分析通道： 快速、可靠的分析目標酶蛋白的方法（酶活力測定方法） 蛋白質(zhì)純度

3、檢測方法 總蛋白的檢測方法 對必須清除的雜質(zhì)分析方法,此外，還需盡量做到 純化過程中不宜重復(fù)相同的步驟和條件 減少添加劑的使用 盡早去除有破壞型的雜質(zhì) 盡早采用高效分離方法，將最昂貴、最費時的分離方法防在最后階段。,3、純化方法的選擇,評定好壞的標準： 比活力提高倍數(shù) 總活力的回收率 重現(xiàn)性,表4-3 常用的提純方法,比活力提高倍數(shù)是純化后樣品的酶比活力與純化前比活力的比值，較大的倍數(shù)表示比活力明顯提高，說明操作的有效性。 總活力的回收率是指純化后樣品的總活力占前樣品總酶活的百分比。這一比值越高說明該操作步驟對酶活的保存率越高。 較好的重現(xiàn)性是所有方法可行性的必要條件。,酶的分離純化一般程序可

4、以分為 預(yù)處理：包括材料的選擇、發(fā)酵液的預(yù)處理和細胞的破碎等。 粗分級分離：等電點沉淀、鹽析、有機溶劑沉淀、萃取和離心分離。 細分級分離：通常用色譜分離 成品制作：透析、超濾、結(jié)晶和冷凍干燥等。,第二節(jié) 酶液的制備和初分離,一、材料的預(yù)處理 動物材料： 除去與實驗無關(guān)甚至有妨礙的結(jié)締組 織，脂肪組織和血污等。 植物種子需要除殼 微生物材料需將菌體和發(fā)酵液成分分開,沉淀法,酶泥,胞外酶,用鹽析或有機溶劑沉淀,胞外酶：釋放到細胞外的酶 胞內(nèi)酶：游離在細胞內(nèi)的酶和牢固與膜或細胞顆粒結(jié)合在一起的酶,細胞壁的主要組分： 細菌：肽聚糖、N-乙酰葡糖胺、 N-乙酰胞壁酸 真菌和酵母：葡聚糖、甘露聚糖 藻類：

5、纖絲狀糖類 動物細胞無細胞壁，易破碎。,細胞破碎的方法,機械法 物理法：滲透壓突變、超聲波、凍融、冷凍干燥再抽提 化學(xué)法：有機溶劑處理、表面活性劑處理 生物法（酶法）：糖苷酶、溶菌酶葡聚糖酶、纖維素酶、甘露聚糖酶等,表4-4 常見的破碎細胞方法,胞內(nèi)酶？細胞破碎取酶,（1）機械破碎法 液體剪切：攪拌、勻漿 固體剪切：研磨、珠磨、搗碎,JY92-II D超聲波 細胞粉碎機,細胞破碎珠,高壓細胞破碎機,DY89-I型 電動玻璃勻漿機,（2）化學(xué)滲透：將細胞壁溶解作用和滲透壓作用相結(jié)合，使細胞膜破裂而釋放出胞內(nèi)物質(zhì)。 有機溶劑處理：溶解膜脂、干燥、抽提。 表面活性劑處理：改變膜的通透性，使之溶解，再

6、抽提蛋白。SDS、Triton,（3）酶溶解：利用溶解細胞壁的酶處理菌體，使細胞壁受到部分或完全破壞后，再利用滲透壓沖擊而破壞細胞膜。 （4）凍結(jié)-溶凍法 將細胞急劇凍結(jié)后在室溫緩慢融化，反復(fù)操作多次達到破壞細胞壁和細胞膜的作用，適用于較脆弱的菌體。,三、抽提 酶的提取是指在一定的條件下，用適當?shù)娜軇┗蛉芤禾幚砗冈?，使酶充分溶解到溶劑或溶液中的過程，也稱為酶的抽提。 酶提取時首先應(yīng)根據(jù)酶的結(jié)構(gòu)和溶解性質(zhì)，選擇適當?shù)娜軇?。一般說來，極性物質(zhì)易溶于極性溶劑中，非極性物質(zhì)易溶于非極性的有機溶劑中，酸性物質(zhì)易溶于堿性溶劑中，堿性物質(zhì)易溶于酸性溶劑中。 酶都能溶解于水，通?？捎盟蛳∷?、稀堿、稀鹽溶

7、液等進行提取，有些酶與脂質(zhì)結(jié)合或含有較多的非極性基團，則可用有機溶劑提取。,抽提緩沖液可能組成成分,pH調(diào)節(jié)劑 離子強度調(diào)節(jié)劑：鹽類 構(gòu)象穩(wěn)定性：甘油 抗氧劑：DTT、巰基乙醇等 重金屬絡(luò)合劑：EDTA、檸檬酸 蛋白酶抑制劑：PMSF、DFP等 增溶劑：Triton X-100等,影響酶提取的主要因素 （1）pH （2）溫度 （3）抽提液的用量,離心,離心轉(zhuǎn)數(shù)：每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)（rpm） 離心分離強度：g值 換算：g=（rpm2/60)2/9.8 r:粒子距離軸中心的距離 低速：4000rpm 高速：4000-20000 rpm 超速: 20000 rpm,實驗室的離心機,常溫和冷凍 超速離心機為冷

8、凍 使用冷凍離心機需先降溫，預(yù)冷離心機頭 使用超速離心機要抽真空,離心的形式,角式及外擺式：外擺式一般為低速，角式從低速到超速。,角式離心頭要配套，低溫使用預(yù)冷，操作注意穩(wěn)、蓋、膠圈、旋緊。,離心機：落地式、臺式,小臺式離心機,超速離心機,離心機管,材質(zhì)：玻璃、塑料 強度和離心機轉(zhuǎn)速配備 大小：和轉(zhuǎn)子相配備 高速和超速管要加蓋,離心機操作,平衡、定溫、定速、定時、定剎車,四、濃縮,（1）蒸發(fā) 工業(yè)上應(yīng)用較多的是薄膜蒸發(fā)濃縮，即將待濃縮的酶在高真空度的條件下變成極薄的液膜，并使之與大面積熱空氣接觸，讓其中的水分瞬時蒸發(fā)達到濃縮的目的。 （2）超濾 在加壓情況下，將待濃縮溶液通過一層只允許水分子和

9、小分子選擇性透過的微孔超濾膜，而將酶等大分子滯留，從而達到濃縮的目的。,（3）凝膠過濾：利用葡聚糖凝膠G-25或G-50等能吸水膨脹，而酶等大分子排阻于膠外的原理進行的一種濃縮。 （4）沉淀法 利用鹽析法或有機溶劑沉淀法將蛋白質(zhì)進行沉淀，再將沉淀溶解在小體積的樣品溶液中。 （5）滲透濃縮法 將蛋白質(zhì)溶液放入透析袋中，然后在封閉容器中緩慢減壓，水及無機鹽流向膜外。,第三節(jié) 酶的分離純化方法,（1）根據(jù)溶解度大小分離的方法、如鹽析法、有機溶劑沉淀法、共沉淀法、選擇性沉淀法、等電點沉淀法等。 （2）根據(jù)分子大小的差別。如離心分離法、篩膜分離法、凝膠過濾法等。 （3）根據(jù)電學(xué)、解離性質(zhì)差別，有吸附法、

10、離子交換色譜法、電泳法以及聚焦色譜法。 （4）基于酶和底物、輔助因子以及抑制劑具有專一的親和作用特性而建立的各種親和分離法。 （5）利用穩(wěn)定性差異而建立的選擇性熱變性、酸堿變性和表面變性法等。,一、根據(jù)溶解度不同而建立的純化方法,酶的性質(zhì)：水溶性 基于物理、化學(xué)規(guī)律，酶分子的疏水基團一般位于分子內(nèi)部，帶電和強極性基團位于分子表面，形成極性表面。進而水分子被結(jié)合在極性表面形成水化層，使酶分子具有一個很親水的表面而易溶于水。,調(diào)節(jié)酶溶解性的方法,1、鹽析法 在低濃度鹽溶液中，其溶解度隨鹽離子強度升高而加大，表現(xiàn)出鹽溶現(xiàn)象。原因：鹽離子與蛋白質(zhì)分子中的極性基團或離子基團作用，降低蛋白質(zhì)分子的活度系數(shù)

11、而使其溶解度增加。 當鹽濃度繼續(xù)升高達到某一上限值時，其溶解度又會以不同速度下降。分別沉淀析出，這種現(xiàn)象稱為鹽析。,S：為溶解度S0：離子強度為0時溶解度Ks：鹽析常數(shù)I：離子強度,不同蛋白質(zhì)分子量、表面電荷不同，在不同鹽濃度下沉淀。濃鹽中蛋白質(zhì)的溶解度遵循Cohn方程：,鹽析影響因素,pH值：等電點處最易沉淀 溫度：濃鹽溶液中，溫度升高溶解度下降 鹽種類：高價鹽效果好，常用硫酸銨，一般用氨水調(diào)pH。濃度經(jīng)常用飽和度（換算表） 蛋白質(zhì)濃度：過稀回收困難，過濃易沉淀。,飽和度：溶液中飽和硫酸銨的體積與溶液總體積之比。 當?shù)鞍踪|(zhì)溶液體積不大，要達到的鹽濃度不高，可加入飽和硫酸銨溶液，100m1硫酸

12、銨溶液，由飽和度S1變?yōu)镾2，應(yīng)向其中加入的飽和硫酸銨溶液的ml數(shù)(V)為： VVo(S2S1)/(1S2),當?shù)鞍踪|(zhì)原有體積較大，要達到的鹽濃度又較高，此時加入固體硫酸銨為宜。在0、25下，硫酸銨濃度由飽和度Sl增至S2應(yīng)向1L溶液中添加的固體硫酸銨的克數(shù)，可以直接查表:,鹽析法注意方面,鹽析法適宜的pH是接近分離酶的PI值.可控制pH5或pH6，使目的酶與雜蛋白帶相同電荷而減少與它們的結(jié)合 從酶的穩(wěn)定性和溶解度來看，鹽析溫度應(yīng)控制在0左右為宜。 蛋白質(zhì)濃度應(yīng)在1mg/ml以上。 經(jīng)鹽折后,沉淀通過離心或壓濾與母液分開，收集后的沉淀再溶于一定的緩沖液心除去不溶物,酶溶液又得到一次純化。,鹽析

13、操作,低飽和度：飽和溶液滴加法。易于迅速混合均勻，一般終飽和度不超過40%。 加量估算：假定混合總體積不變。 高飽和度：加固體鹽添加法，不會大量增加溶液體積。 溫和攪拌添加，加畢后繼續(xù)攪拌10分鐘以上，以充分沉淀。 沉淀后要高速離心分離，還需除鹽。,2、有機溶劑沉淀法,（1）原理：利用酶等蛋白質(zhì)在有機溶劑中的溶解度不同而使之分離的方法。 與水相容的有機溶劑（甲醇、乙醇和丙酮等）能使蛋白質(zhì)在水中的溶解度顯著降低。 有機溶解的主要作用是降低溶液的介電常數(shù)，因為分子中的靜電引力和溶劑的介電常數(shù)成反比，加入有機溶劑，蛋白質(zhì)分子間的引力增加，互相吸引凝聚，使其溶解度降低。 另一作用引起蛋白質(zhì)脫水而沉淀。

14、,注意事項,一般在進行有機溶劑法時，溶液pH盡可能靠近待純化酶的PI值。 加入適當?shù)闹行喳}，如5一10硫酸銨往往有助于提高分離效率。但其濃度不得越過0.05mol/L。 此法分辨率較高、溶劑易除去，但易引起酶的變性失活。,3、等電點沉淀法,利用兩性電解質(zhì)在等電點時溶解度最低，以及不同的兩性電解質(zhì)具有不同的等電點這一特性，通過調(diào)節(jié)溶液的pH值，使酶或雜質(zhì)沉淀析出，從而使酶與雜質(zhì)分離的方法稱為等電點沉淀。,4、有機聚合物沉淀法,在酶液中加入某些高分子物質(zhì)，使其與酶形成聚合物而沉淀下來，從而使酶與雜質(zhì)分離的方法稱為有機物聚合法。 SDS PEG 丙烯酰胺,5、萃取分離,萃取分離：利用溶質(zhì)在互不相溶的

15、兩相間分配系數(shù)不同而使溶質(zhì)得到純化或濃縮的方法。,（1）雙水相萃取,將兩種不同水溶性聚合物的水溶液混合，當聚合物達到一定濃度時，體系自然分成互不相溶的兩相，從而構(gòu)成雙水相體系。 原理：利用酶和雜質(zhì)蛋白等在不混溶的兩個水相系統(tǒng)中分配系數(shù)不同而達到分離的目的的方法。,雙水相的形成主要是由于高聚物之間的不相溶性，即高聚物分子的空間阻礙作用，互相無法滲透，形成不了均一相，從而具有分離傾向，在一定條件下分成兩相。 聚合物/聚合物：聚乙二醇/葡聚糖、聚丙二醇/聚乙二醇 聚合物/鹽：聚乙二醇/(硫酸鹽或磷酸鹽）,雙水相適合進行的酶萃取,兩相中含有70%以上的水 設(shè)備簡單 操作方便、快捷,（2）超臨界流體萃取

16、,超臨界流體萃取是將超臨界流體（supercritical fluid）作為萃取溶劑，利用欲分離物質(zhì)與雜質(zhì)在超臨界流體中溶解度不同而達到分離的一種萃取技術(shù)。 超臨界流體：物質(zhì)狀態(tài)超過氣液共存時的最高壓力和最高溫度下物質(zhì)特有的點臨界點后的流體。,超臨界流體的物理特性和傳質(zhì)通常介于液體和氣體之間，超臨界流體的黏度大大低于液體的黏度，接近氣體的黏度，有利于物質(zhì)擴散。其擴散系數(shù)接近于氣體。 由于溶質(zhì)在超臨界流體中的溶解度隨溫度和壓力的變化很大，超臨界流體對于物質(zhì)的萃取具有選擇性。 常用的超臨界流體是二氧化碳。,（3）反膠團萃取,反膠團（reversed micelles）：兩性表面活性劑在非極性有機溶

17、劑中親水基團自發(fā)地向內(nèi)聚集而成的微小膠團。 表面活性劑的存在是構(gòu)成反膠團的必要條件 陰離子型表面活性劑 陽離子型表面活性劑 非離子型表面活性劑,反膠團的形成使有機相內(nèi)形成了分散的親水微環(huán)境，使生物分子在有機相（萃取相）內(nèi)存在于反膠團的親水微環(huán)境中，消除了蛋白質(zhì)難溶于有機相中或在有機相中發(fā)生不可逆變性現(xiàn)象。 通過控制pH值、離子強度、有機溶劑的種類及表面活性劑的種類和濃度，可以改變蛋白質(zhì)在兩相間的分配系數(shù)，不同蛋白質(zhì)表面電荷與相對尺寸的不同使得它們在兩相中的分配系數(shù)不同，從而達到分離的目的。,二、根據(jù)不同分子大小而建立的純化方法,1、凝膠過濾 凝膠過濾(Gel fitration Chromat

18、ography，GFC)也稱凝膠色譜，是利用凝膠的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)根據(jù)分子大小進行分離的一種方法。,凝膠性質(zhì),得水值Wr：膠體內(nèi)部含水量1g干凝膠吸水克數(shù) 排阻限度：不能滲透到凝膠內(nèi)部的最低分子量。 分離范圍：上限為排阻限度。 顆粒形狀：理想形狀為球狀。 顆粒大?。侯w粒越小，分辨力越強，流速越低。,選擇性曲線,顆粒大小對分辨率大小,流速對分辨率的影響,常用凝膠,1、交聯(lián)葡聚糖凝膠Sephadex Sephadex G-10至200，型號/10=得水值 細度um，粗100-300， 中50-100 細20-80 超細10-40 號越高排阻限度和分離范圍越高，溶脹時間越長，最大流體靜壓力越小，操作壓力超限

19、會破壞多孔結(jié)構(gòu)。 化學(xué)穩(wěn)定，不溶所有溶液，pH2-12,表4-6 常用的商品化凝膠過濾介質(zhì),凝膠的選擇,瓊脂糖凝膠剛性相對較高，能得到較高的流速，但葡聚糖凝膠的分辨率較高。 葡聚糖凝膠的穩(wěn)定范圍最寬，特別是堿穩(wěn)定性好（2-12），聚丙烯酰胺凝膠酸穩(wěn)定性好（1-10），瓊脂糖凝膠凝膠穩(wěn)定性范圍最小。 不必須高流速和強酸的情況下，一般多選用葡聚糖凝膠。,用凝膠過濾去除小分子,分離酶蛋白和溶液中的小分子，如抑制劑、鹽、底物、保護劑等，傳統(tǒng)的技術(shù)是透析，但透析一般用時較多，不適合快速操作，此時凝膠過濾是最好的選擇。 加壓法：有規(guī)格化產(chǎn)品供選用。 離心柱法：裝小塑料柱平衡離心加樣再離心收集 選膠：排阻限

20、度在酶分子量之下，而在小分子量之上越多越好，大承壓。,用凝膠過濾測分子量,利用凝膠過濾中按分子量大小出峰位置不同，可以測定蛋白質(zhì)的分子量。,2、膜分離,膜分離即過濾分離法，利用微孔超濾膜僅能選擇性透過一定大小的分子而達到分離目的的一類方法。,膜分離,加壓膜分離,微濾 超濾 反滲透,電場膜分離,電滲析 離子交換膜電滲析,擴散膜分離,透析,根據(jù)膜材料和不同進料液的特性，商品應(yīng)用的膜產(chǎn)品通常采取如下幾種結(jié)構(gòu)形式：管式；中空纖維；卷式；平板式。,中空纖維膜超濾膜是由數(shù)百至數(shù)百萬根中空纖維膜固定在圓筒形容器內(nèi)構(gòu)成。 外壓型 內(nèi)壓型,3、依據(jù)電學(xué)解離性質(zhì)不同建立的純化方法,1、離子交換色譜 離子交換色譜是

21、利用離子交換劑上的可解離基團對各種離子的作用力不同而達到分離目的的一種色譜方法。,基本原理,離子交換樹脂共價鍵有可解離基團，可人為選擇性使其帶上電荷，帶正電荷的為陰離子交換樹脂，帶負電荷的為陽離子交換樹脂。生物大分子表面帶有電荷，通過靜電作用結(jié)合在相應(yīng)的樹脂上，親和力的大小取決于靜電鍵的數(shù)目及排布有關(guān)。不同的大分子有不同的親和力。改變環(huán)境的離子強度或pH值使表面電荷發(fā)生變化，會改變相應(yīng)的親和力，從而改變大分子在樹脂上的吸附狀態(tài)，達到分離的目的。,一般由 高分子支持物和功能基團(又叫離子交換基)兩部分組成。離子交換劑根據(jù)支持介質(zhì)的不同有離子交換樹脂、離子交換纖維素、離于交換凝膠等。,高分子支持物

22、,功能基團,離子交換劑,陽離子交換劑：帶負電荷，吸附帶陽離子的基團，與陽離子發(fā)生交換，其活性基團為酸性。 常用羧甲基 磺丙基 陰離子交換劑：帶正電荷，與陰離子發(fā)生交換，其活性基團為堿性。常用二乙胺基乙基、二乙胺基乙基-2-羧丙基,解離基團為強電離基團的稱為強離子交換劑。如碘酸基。 帶有弱解離基團的為弱離子交換劑。如羧甲基。,吸附狀態(tài),緊密吸附：靜電荷鍵多緊密吸附，吸附后解吸幾率極低，將被吸附于柱頂不下移。 有限吸附：靜電荷鍵不多，吸附與解吸附處于某程度平衡，隨溶液在柱中下移，大分子多次吸附與解吸附，形成一定的下移速度，此狀態(tài)可以達到較高的分辨率。 不吸附：靜電鍵少，不能吸附，與溶液同步下移，形

23、成“穿越峰”。,離子交換纖維素樹脂的前處理,酸堿處理：0.5mol/L HCl和NaOH。 陽離子交換樹脂：酸-堿-酸處理，最后掛上陽離子H+。 陰離子交換樹脂：堿-酸-堿處理，最后掛上陰離子OH-。 處理時間：20-30min。 每步處理后用蒸餾水洗掉浮酸（堿），終處理的樹脂還要用緩沖液洗至基本平衡的酸堿度和離子強度，以換上緩沖液離子。,離子交換葡聚糖,以Sephadex G-25和G50為骨架，接入離子交換基團，由于膠表面和膠孔內(nèi)可連接交換基團，吸附容量大，且流速大。 DEAE（QAE）， Sephadex A-25，A-50， CM（SP）， Sephadex C-25，C-50陽離子交

24、換樹脂 離子交換葡聚糖需在酸性（陽離子交換樹脂）或堿性（陰離子交換樹脂）緩沖液中溶脹。,柱色譜操作步驟： 加樣 洗滌 洗脫：恒定溶液洗脫，逐次洗脫和梯度洗脫。,洗脫方法,增加緩沖液離子強度：即增大離子在樹脂上的競爭，同時減少大分子表面電荷，降低吸附力，從而使大分子從樹脂上解吸。（氯化鈉） 改變pH值：減少蛋白質(zhì)分子表面基團的解離度，降低吸附力，從而使大分子解吸，但改變過多可能使蛋白質(zhì)變性。 有時兩種方法結(jié)合使用。,洗脫方式,梯度洗脫 洗脫液中離子強度或pH連續(xù)改變，使混合物中各個蛋白質(zhì)先后進入有限吸附至不吸附狀態(tài)而被洗脫。 注意：總體積要足夠大，使各分離峰不要太擁擠，梯度上限要足夠高，使各物質(zhì)

25、都能解吸，梯度斜度適當，如過大各峰不易分開，過小，峰形過寬和拖尾。,逐次洗脫（階段洗脫）,用不同離子強度或pH洗脫液按洗脫能力由小到大相繼進行洗脫。 優(yōu)點：洗脫峰集中，體積小濃度高，所需洗脫液總量少，時間短，設(shè)備和操作簡單 缺點：如洗脫條件不準確純度可能不夠高；洗脫峰經(jīng)常拖尾，變一次洗脫液會出現(xiàn)一個峰，有時造成假象。,2、電泳,帶電顆粒在電場的作用下，向著與其電性相反的電極方向移動，這種現(xiàn)象稱之為電泳(electrophoresis，簡稱EP)。 1937年由瑞典科學(xué)家Tiselius A首先提出來的，并設(shè)計出世界上第一臺自由電泳儀，建立了“移界電泳”分離模式。首先證明了血清是由白蛋白、1、2

26、、和球蛋白組成的，1948年被授予諾貝爾獎。,顆粒在電場中的移動速度主要決定于其本身所帶的凈電荷量，同時受顆粒形狀和顆粒大小的影響。此外，還受到電場強度、溶液pH值、離子強度及支持體的特性等外界條件的影響。,（1）聚丙烯酰胺凝膠電泳,聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis PAGE）以聚丙烯酰胺作為支持載體。 聚丙烯酰胺有單體丙烯酰胺和亞甲基雙丙烯酰胺聚合而成。,（2）等電聚焦電泳,等電聚焦電泳（isoelectric focusing)是利用蛋白質(zhì)等兩性電解質(zhì)具有等電點，在等電點的pH值下呈電中性，從而不發(fā)生泳動的特點而進行的電泳分析。 在電

27、泳設(shè)備中首先需調(diào)配連續(xù)的pH梯度，然后使蛋白質(zhì)在電場作用下泳動到與各自等電點相同的pH值區(qū)域而不再繼續(xù)泳動，從而形成具有不同等電點的蛋白質(zhì)區(qū)帶。,等電聚焦電泳法測定蛋白質(zhì)pI,（3）連續(xù)凝膠電泳,連續(xù)凝膠電泳實質(zhì)上是聚丙烯凝膠垂直平板電泳的發(fā)展，實現(xiàn)在批次內(nèi)連續(xù)將各個電泳區(qū)帶分離回收，并可進行多批次分離操作。 在電場作用下，電泳形成的區(qū)帶一次連續(xù)走出凝膠并進行洗脫、收集，達到將各組分分離回收的目的。,（4）連續(xù)流動電泳,連續(xù)流動電泳是在紙電泳的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。 以濾紙為載體，可以減少分離組分在流動的緩沖液中的自由擴散。將濾紙的上端插入電泳液槽中，依靠毛細管虹吸作用和重力作用，電泳液沿著紙面向

28、下均勻流動，在垂直于電泳緩沖液流動方向施加電場，即在濾紙的兩個側(cè)邊上與電極解觸，將欲分離的樣品以定點方式流加在濾紙上，加樣點的位置需根據(jù)各組分的電泳行為確定。 在電場作用下，帶有不同電荷的組分隨著電泳緩沖液向前流動的同時而向不同電極方向遷移。,（5）無載體連續(xù)流動電泳,與連續(xù)流動載體類似，只是不使用載體，而是使用兩張塑料板，在她們之間形成0.50.8mm的間隙作為電泳槽，使電泳緩沖液從下到上平行流過電泳槽，依靠表面張力減少液體內(nèi)部的流動性，待分離樣品從下端某一點連續(xù)加入，在垂直于電泳緩沖液流動方向上的電場作用下，帶有不同電荷的各個組分分別向不同的電極方向遷移，在電泳槽的末端，將流出的電泳緩沖液

29、分割，再分別檢測、收集，即可獲得分離的各個組分。,多孔膜連續(xù)自由流動電泳,利用多孔膜將電泳槽分成多個小池，在電場作用下，電泳分離的物質(zhì)可透過膜在小池間遷移，而多孔膜可起到穩(wěn)定液流、防止擴散的作用，在各個小池流動的電泳緩沖液不僅可起到帶走電泳產(chǎn)生的熱量的作用，同時也可以收集電泳產(chǎn)生的不同區(qū)帶，從而達到分離的目的。,3、聚焦色譜,原理：當用特種的緩沖液滴定和淋洗填裝在色譜柱中的特種多緩沖液交換劑時，隨著這種緩沖液的擴展，會在色譜柱中自上而下地建立起連續(xù)的pH梯度，將待純化樣品加入色譜柱，其中的蛋白質(zhì)組分將隨著多緩沖液的擴展按各自的等電點聚焦與相應(yīng)的pH值區(qū)段并隨擴展過程中pH梯度的逐漸下降，最后分

30、別從色譜柱先后流出，從而達到分離純化的目的。,四、利用親和作用進行純化的方法,生物物質(zhì)，特別是酶和抗體等蛋白質(zhì)，具有識別特點物質(zhì)并與該物質(zhì)的分子相結(jié)合的能力，這種識別并結(jié)合的能力具有專一性、排他性，即生物分子能夠區(qū)分結(jié)構(gòu)和性質(zhì)非常接近的其他分子，選擇性地與其中某一種分子相結(jié)合，這種特異性地相互結(jié)合作用稱為生物親和作用（bioaffinity）。 利用生物分子間的這種特異性結(jié)合作用而進行的分離純化技術(shù)稱為親和純化技術(shù)。,1、親和色譜,親和色譜是利用生物分子與配基之間所具有的專一而又可逆的親和力，而使生物分子分離純化的技術(shù)。 酶與底物,酶與競爭性抑制劑,酶與輔助因子,抗原與抗體，酶RNA與互補的R

31、NA分子或片段,RNA與互補的DNA分子或片段等之間，都是具有專一而又可逆親和力的生物分子對。故此,親和色譜在酶的分離純化中有重要應(yīng)用。,親和色譜 (1) 親和色譜法 的固定相為一固相擔(dān)體，上有專一性親和基團(A)，流動相為溶離緩沖液。 (2) 當樣本通過管柱時，與親和基團有專一性的分子(B)結(jié)合到固定相上，非專一性分子(X) 則隨流動相洗出管柱。 (3) 留在定相上的分子(B)，可用酸或堿溶離，或用專一性游離分子溶離。,親和樹脂的制備,1.載體 載體是親和交換樹脂的骨架，理想載體： 均一、結(jié)實多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，有較大的表面和良好的流動性。 親水的多孔結(jié)構(gòu)，無非特異性吸附。 有可活化基團，以偶聯(lián)

32、配基 化學(xué)穩(wěn)定：溫度、pH、溶劑、變性劑,常用親和交換載體,最常用的為瓊脂糖Sepharose 1B到10B，為含瓊脂糖1%-10%，號越大分離范圍越小，1B為1000000-15000000,10B為10000-500000。,2、配基,條件：能與載體專一性共價結(jié)合，又不產(chǎn)生新的產(chǎn)物：如競爭性抑制劑，底物，抗體、輔酶等。,3、手臂,酶和配基需要足夠的空間，為克服空間障礙，引入“手臂”。,4、載體的活化-偶聯(lián),用溴化氫活化，再偶聯(lián)配基。 需要手臂活化時先接手臂再活化手臂，最后加配基實現(xiàn)偶聯(lián)。,層析操作,分離前： 1）樹脂的預(yù)處理：凝膠溶脹、按種類、型號選擇合適條件：pH、溫度、時間、離子強度等

33、。 2）裝柱：均勻、密度合適、密封。常壓和逐步加壓的方法。 3）平衡：一般用樣品緩沖液，平衡至pH、離子強度穩(wěn)定。,分離中 上樣：保證pH、離子強度不超標的情況下體積盡可能的小。注意不要超過樹脂的吸附容量。 洗滌：一般用一個空柱體積的樣品緩沖液洗滌掉不吸附的雜蛋白。 洗脫：梯度洗脫和階段洗脫。分步收集和手工收集，監(jiān)測和檢測。注意流速控制，隨時觀察，保持溶液。 分離后：再生、平衡、保存。,層析裝置,梯度混合器 蠕動泵 層析柱 監(jiān)測儀 記錄儀 收集器,記錄儀,低溫層析柱,2、親和膜,親和膜（affinity membrane）：利用親和配給修飾的微濾膜為親和吸附介質(zhì)，而進行親和純化目標酶，是固定床

34、親和色譜的變形。,五、利用穩(wěn)定性差別建立的純化方法,1、選擇性熱變性 在嚴格控制的條件下，將酶溶液迅速升溫到某一溫度并保溫一定時間（通過時間確定）而后迅速冷卻，這樣，大量不耐熱的雜蛋白就將變形析出，通過離心可除去，而酶的總活力損失很少，同時比活力大大上升。 為了使選擇性熱變性法有更大的適用范圍，可以在酶溶液進行熱處理前，加入該酶的底物、輔酶、競爭性抑制劑、保持巰基的還原劑等。同時控制溶液pH。,2、選擇性酸堿變性,在一定溫度下，目標酶表現(xiàn)出較強的耐酸性或耐堿性，而這一條件對大多數(shù)蛋白質(zhì)是不穩(wěn)定的，那么可以將溶液的pH嚴格控制在一定范圍內(nèi)并處理一定時間。,3、表面變性法,利用酶溶液和惰性液體（三

35、氯甲烷）混合振蕩，造成選擇性表面變性在制備過氧化氫酶、醇脫氫酶和-淀粉酶等。 振蕩后混合液分為三層：上層為未變性的蛋白質(zhì)，中間為乳濁液變性蛋白質(zhì)，下層為三氯甲烷。,提純程序,提純方法的選擇 酶的分離提純一般是多步驟完成的，可用的方法和材料可能有多種，可根據(jù)制備的規(guī)模、純度的要求、分離時間、實驗室條件等進行選擇。 方法銜接上，一般次序為分步沉淀 凝膠吸附 離子交換層析，凝膠過濾親和層析。,六、酶的結(jié)晶與干燥,濃縮是從低濃度酶液中除去部分的水或其他溶劑而使之成為高濃度溶液的過程。 1、結(jié)晶 結(jié)晶是溶質(zhì)以晶體形式從溶液中析出的過程。,（1）鹽析結(jié)晶,鹽析結(jié)晶是指在 適當?shù)臏囟群蚿H值等條件下，于接近

36、飽和的酶液中緩慢加入某種中性鹽，使酶的溶解度緩慢降低，達到稍微過飽和狀態(tài)，析出酶晶體的過程。 鹽析結(jié)晶一般是把飽和鹽溶液慢慢滴加到濃酶液中，在稍微呈渾濁時，讓其在一定溫度下放置一段時間，慢慢析出結(jié)晶。在緩慢而又均勻地補加飽和鹽溶液，直至結(jié)晶完全。,（2）有機溶劑結(jié)晶法,有機溶劑結(jié)晶是在接近飽和的酶液中緩慢加入某種有機溶劑，使酶的溶解度降低，而析出酶晶體的過程。 過程：首先要將經(jīng)過純化的酶溶液濃縮至接近飽和的狀態(tài)，將酶的pH值調(diào)節(jié)到酶穩(wěn)定性好的范圍，用冰浴降溫至0左右。然后一邊攪拌一般慢慢加入有機溶劑，當酶液稍微出現(xiàn)渾濁時，將其在冰箱中放置12h，離心除去沉淀，再將上清液至于冰箱中，讓其慢慢析出

37、結(jié)晶。,（3）透析平衡結(jié)晶法,透析平衡結(jié)晶是將酶液裝進透析袋，用一定濃度的鹽溶液進行透析，使酶液逐步達到過飽和狀態(tài)而析出結(jié)晶的過程。,（4）等電點結(jié)晶法,等電點結(jié)晶法在改變濃酶液的pH值時一定要緩慢而均勻，以免引起局部過酸或過堿。 平衡透析等電點結(jié)晶：將濃酶液裝在透析袋中，用一定pH值的緩沖液進行透析，使酶液的pH值逐漸接近酶的等電點，從而使酶液析出。 氣相擴散等電點結(jié)晶是將酶液裝在容器中，與裝有揮發(fā)性酸（乙酸、干冰等）或揮發(fā)性堿（如氨水）的容器一同置于一個較大的密閉容器中，酸或堿先揮發(fā)到氣相中，再逐漸溶解到酶液中，使酶的pH值慢慢接近酶的等電點而結(jié)晶析出。,2、干燥,冷凍干燥：首先將酶液在較低溫度下（-50-10）凍結(jié)成固態(tài)，然后在高度真空條件下，將其中固態(tài)的水分直接升華為氣態(tài)而除去的干燥過程，也稱為酶的升華干燥。,3、酶制劑的類型,液體酶制劑 固體粗酶制劑 純酶制劑 固定化酶制劑,第四節(jié) 酶純度的檢驗