課題2　多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段 (2).ppt

1、實(shí)驗(yàn)一、聚合酶鏈反應(yīng)PCR，一、實(shí)驗(yàn)原理：PCR也稱為聚合酶鏈反應(yīng)，是體外酶促特異DNA片段合成的方法，主要由高溫變性、低溫退火和適溫拉伸三個(gè)步驟重復(fù)的熱循環(huán)組成：高溫下，待擴(kuò)增的目標(biāo)DNA雙鏈為熱然后在低溫下，2條人工合成的寡核苷酸引物與互補(bǔ)的單鏈DNA模板結(jié)合，在形成部分雙鏈的Taq酶的最佳溫度(72 )下，以引物3端為合成的起點(diǎn)，以單核苷酸為原料，在Mg2的存在下，沿模板向53個(gè)方向延伸，DNA 這樣，每雙鏈的DNA模板一次經(jīng)過解鏈、退火、拉伸3個(gè)步驟的熱循環(huán)，成為雙鏈DNA分子。 通過這樣重復(fù)，每1個(gè)循環(huán)產(chǎn)生的DNA成為下一個(gè)循環(huán)的模板，每1個(gè)循環(huán)將2條人工合成的引物之間的DNA特異區(qū)

2、域的拷貝數(shù)放大2倍，PCR產(chǎn)物指數(shù)急速放大，經(jīng)過2530個(gè)循環(huán)，理論上為數(shù)百萬DNA模板：反應(yīng)中的DNA量為50ng200ng左右。 DNA純度高，可提高反應(yīng)特異性。 在dNTP:反應(yīng)體系中達(dá)到了100M200M。 Mg2 :Mg2的Taq酶亞基濃度為2.0mM左右，濃度過低，Taq酶活性降低過高，反應(yīng)特異性降低。 引物：根據(jù)目標(biāo)基因兩側(cè)的特定序列進(jìn)行設(shè)定修訂。 引物約為20個(gè)堿基左右，G C的含量在4070之間，引物內(nèi)部不能忽略這個(gè)序列，引物一側(cè)不是互補(bǔ)的。 Taq酶：從嗜熱桿菌中提取的耐熱性聚合酶，95:30具有50的活力。 說明、PCR過程示意圖、二、實(shí)驗(yàn)所需器材和試劑器材：臺(tái)式高速離心機(jī)、恒溫水槽、PCR放大器、瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)、凝膠成像系統(tǒng)、Eppendorf離心管、PCR小管、試劑：引物1、引物2、marker 1 :按取樣順序在PCR小管中加入下述的試劑(50ul系):5ul 10X PCR Buffer 4ul dNTP mix 2ul引物1 2ul引物2 3ul引物1ultaqdnn的注意事項(xiàng)：同時(shí)對(duì)照組(對(duì)照組不加入模板DNA ) 用以下的殘奧儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增(對(duì)每個(gè)PCR反應(yīng)設(shè)置不同的反應(yīng)條件)，進(jìn)行94分94 30秒51 30秒30循環(huán)72 30秒72