熒光及其熒光單分子跟蹤技術(shù).ppt

1、熒光及其熒光單分子跟蹤技術(shù),2011.11,鄢志丹,熒光 什么是熒光；分子熒光的主要特性有那些； 熒光顯微技術(shù) 熒光顯微鏡；探測傳感器；熒光顯微技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域； 熒光單分子檢測技術(shù) 單分子檢測意義；熒光單分子檢測特點、應(yīng)用范圍和關(guān)鍵技術(shù)； 一種高精度快速的熒光單分子跟蹤算法 圖像去噪；位置估計；偽點剔除；精細(xì)定位；軌跡生成；特性評價；真空設(shè)備； 總結(jié)及思考題,主要內(nèi)容:,思考題,思考題,1、什么是熒光？它有哪些主要特點？ 2、熒光如何從激發(fā)光中分離出來，它有那么主要的探測器件？ 3、單分子檢測的應(yīng)用領(lǐng)域有哪些？ 4、單分子跟蹤算法分為幾個重要步驟？ 5、IDGM（圖像去噪高斯掩膜）與2DDGF

2、（二維直接高斯擬合）算法相比，有什么優(yōu)勢？ 6、熒光顯微技術(shù)如何實現(xiàn)與真空分子生長（蒸發(fā)）技術(shù)的耦合？,熒光,熒光（ 1852年，英國科學(xué)家Stokes) ：,1/5：熒光（Fluorescence）,光致發(fā)光： 某些分子受外界可見光或紫外線激發(fā) 而出射光子的現(xiàn)象； 熒光和磷光： 激發(fā)態(tài)電子排布和光子發(fā)射路徑不同； 熒光發(fā)射過程： 吸收、內(nèi)轉(zhuǎn)移、振動馳豫、熒光發(fā)射 磷光發(fā)射：系間竄越,分子熒光發(fā)射能量圖,光致發(fā)光,分子熒光特性：,1/5：熒光（Fluorescence）,量子跳躍特性： 發(fā)射暗態(tài)交替的量子跳躍過程；在實驗中可觀察到單分子熒光強(qiáng)度和熒光光譜的漲落；,熒光偏振特性： 單個熒光分子因

3、其具有唯一的固有熒光和吸收躍遷偶極矩， 因而只吸收那些偏振方向與其吸收躍遷偶極矩方向一致的 光子，并發(fā)出具有一定偏振方向的熒光；,分子熒光特性：,1/5：熒光（Fluorescence）,熒光顯微技術(shù),熒光顯微鏡家族：,種類繁多，包括落射式熒光顯微鏡、全內(nèi)反射式熒光顯微鏡、激光掃描共焦顯微鏡、駐波熒光顯微鏡、受激發(fā)射損耗熒光顯微鏡等； 激發(fā)樣品方式不同，但熒光分離原理近似；,基本原理：利用熒光濾鏡組出射一定波長的激發(fā)光激發(fā)樣品以產(chǎn)生熒光（比激發(fā)光波長長），該熒光被物鏡采集后，再次經(jīng)由熒光濾鏡組消除不是熒光波長的其他光，最終使熒光到達(dá)光學(xué)傳感器。,落射式熒光顯微鏡,2/5：熒光顯微技術(shù)（Fluo

4、rescence Microscopy）,特點：高靈敏度、高分子選擇性、高信噪比；,熒光濾鏡組：,把微弱的熒光從激發(fā)光中分離出來。,2/5：熒光顯微技術(shù)（Fluorescence Microscopy）,結(jié)構(gòu)圖,光譜圖,激發(fā)濾鏡的帶通波長范圍必須是分色濾鏡和發(fā)射濾鏡的阻礙波長范圍，而發(fā)射濾鏡的通過波長范圍在分色濾鏡的通過波長范圍之內(nèi)； 熒光濾鏡組的選擇要針對所觀測分子，須明確其激發(fā)光譜和熒光發(fā)射光譜特征。,探測傳感器：,2/5：熒光顯微技術(shù)（Fluorescence Microscopy）,熒光顯微技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域：,2/5：熒光顯微技術(shù)（Fluorescence Microscopy）,熒光單分

5、子檢測技術(shù),3/5：熒光單分子檢測技術(shù)（Fluorescence Single Molecule Detection）,為什么要進(jìn)行單分子檢測：,2. 單分子的特征對局部場的存在非常敏感， 可以反映局部微觀環(huán)境的信息,3. 能夠揭示隨時間變化的分子特性,3/5：熒光單分子檢測技術(shù)（Fluorescence Single Molecule Detection）,目前的主要方法：,近場方法：STM，AFM等； 遠(yuǎn)場方法：熒光顯微鏡； 其他方法：微流體、磁鑷、光鑷、超快振動譜等。,掃描隧道顯微鏡,原子力顯微鏡,3/5：熒光單分子檢測技術(shù)（Fluorescence Single Molecule De

6、tection）,熒光單分子檢測：,快速；非接觸；多分子檢測與跟蹤；分子選擇 性強(qiáng)；納米級分辨率；光譜信息和圖像信息,熒光單分子檢測,3/5：熒光單分子檢測技術(shù)（Fluorescence Single Molecule Detection）,熒光單分子檢測的關(guān)鍵技術(shù)：,確保單分子的信號大于背景干擾信號 (有效減少拉 曼散射、瑞利散射及其雜質(zhì)熒光所造成的干擾),在被照射的體積中只有一個分子與激發(fā)光發(fā)生相互作用（調(diào)整研究體系的濃度或密度）,一種高精度快速的熒光 單分子跟蹤算法,基于熒光顯微成像的單分子跟蹤,多方面的單分子跟蹤實驗以及單分子跟蹤算法的研究。如：美國埃默里大學(xué)、喬治城大學(xué)、華盛頓大學(xué)、

7、伊利諾伊衛(wèi)斯理大學(xué)，英國曼徹斯特大學(xué)和瑞士生物醫(yī)學(xué)圖像組等,四種典型運動軌跡 （A 靜態(tài)；B 簡單擴(kuò)散；C 單方向擴(kuò)散；D 限制區(qū)域擴(kuò)散,3/5：一種高精度快速的熒光單分子跟蹤算法,材料科學(xué)、細(xì)胞學(xué)、生物物理、生物化學(xué)等領(lǐng)域 跟蹤分子運動、獲取運動軌跡、分析擴(kuò)散方式、精確擴(kuò)散速率，可得到豐富而詳細(xì)的動力學(xué)和統(tǒng)計學(xué)信息。 分子馬達(dá)特性；蛋白分子的聚核與裂解；膠體相互作用；細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞間反應(yīng)機(jī)理等,20,原始圖像,圖像去噪,特征點位置估計,偽點剔除,高斯掩膜精細(xì)定位,概率軌跡鏈接,實現(xiàn)快速高精度,快速高精度單分子跟蹤算法,快速高精度單分子實時跟蹤算法是進(jìn)行實時單分子跟蹤的必然要求。 該算法包括圖像

8、去噪處理與高斯掩膜質(zhì)心法相結(jié)合的定位算法和同時考慮等效光強(qiáng)和幀間最大運動位移的同分子概率鏈接算法。,3/5：一種高精度快速的熒光單分子跟蹤算法,圖像重構(gòu) A (轉(zhuǎn)化為浮點型數(shù)組),散粒噪聲,背景噪聲: 光學(xué)器件殘余熒光； 樣品雜質(zhì)熒光； 非焦平面雜散熒光； 瑞利散射光； CCD讀取噪聲、暗電流； 散粒噪聲（像素噪聲，離散化噪聲）： CCD器件進(jìn)行離散光電子計數(shù)產(chǎn)生的具有 泊松分布的信號,的選取很重要,用圖像去噪算法去除背景噪聲和散粒噪聲的后，單分子圖像信息便凸顯出來,背景噪聲,3/5：一種高精度快速的熒光單分子跟蹤算法,特征點位置估計: 像素級分辨率,采用圖像數(shù)學(xué)形態(tài)學(xué)處理技術(shù)中的256級灰度

9、膨脹算法來實現(xiàn)區(qū)域極大值的選擇，在進(jìn)行膨脹算法時，以w為半徑創(chuàng)建結(jié)構(gòu)圓，并將圖像向上下左右四個方向外延w個像素，選擇圖像膨脹前后像素值的相同點即是極大值點,濾波后圖像,膨脹后圖像,3/5：一種高精度快速的熒光單分子跟蹤算法,偽點,偽點剔除,設(shè)定一個百分比r，當(dāng)極值點像素值位于全部像素值前 時r ，此極大值即為估計中心位置，否則剔除之；,特征點,3/5：一種高精度快速的熒光單分子跟蹤算法,采用結(jié)合質(zhì)心法和二維直接高斯擬合兩種算法優(yōu)點的高斯掩膜精細(xì)定位算法； 運算速度快； 精度高； 適合實時的單分子跟蹤研究,精細(xì)定位,式中：,3/5：一種高精度快速的熒光單分子跟蹤算法,第i個特征點在兩幀間移動的實

10、際距離,相鄰兩幀分子可能移動的最大距離,兩特征點點等效光強(qiáng)之差,最大可能移動距離,下一幀檢測到的特征點,軌跡鏈接,式中：,兩特征點點等效光強(qiáng)的平均值,鏈接，即在確定每幀的單分子位置坐標(biāo)后，通過合理的鏈接算法把表示同一分子的點以時間序列的方式連接起來 以等效光強(qiáng)和運動位移為評價因素的概率法，是一種有效的特征點匹配方法,3/5：一種高精度快速的熒光單分子跟蹤算法,熒光單分子仿真圖像,實驗用熒光顯微成像系統(tǒng)配置,3/5：一種高精度快速的熒光單分子跟蹤算法,IDGM與2DDGF(直接二維擬合）的比較分析,單分子定位算法精度分析一,IDGM和2DDGF算法的運算時間比較,3/5：一種高精度快速的熒光單分

11、子跟蹤算法,3/5：一種高精度快速的熒光單分子跟蹤算法,仿真與實驗,熒光單分子跟蹤研究的真空設(shè)備,3/5：一種高精度快速的熒光單分子跟蹤算法,超高真空系統(tǒng)整體示意圖,1)超高真空腔；2)真空閥門；3)傳輸真空腔；4)襯底/樣品傳輸機(jī)構(gòu)；5)渦輪分子泵（下接旋轉(zhuǎn)機(jī)械泵）；6)分子蒸發(fā)源接口；7)橢偏儀接口；8)線性驅(qū)動真空波紋管；9)樣品架；10)反射差分光譜儀接口；11)結(jié)構(gòu)架；12)支撐柱；13)鈦升華泵；14)懸掛彈簧；15)離子泵；16)液氦低溫冷頭；17)x-y平面移動平臺；18)熒光顯微鏡；19)CCD攝像機(jī),真空系統(tǒng)裝配實物圖,熒光單分子跟蹤研究的真空設(shè)備,3/5：一種高精度快速的熒光單分子跟蹤算法,5/5：總結(jié)及思考題,2、 熒光顯微技術(shù)、探測傳感器以及熒光顯微術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域；,3、熒光單分子檢測特點、應(yīng)用范圍和關(guān)鍵技術(shù)；,4、一種快速高精度的單分子跟蹤算法的實現(xiàn)過程、特性評價及典型的單分子研究裝置。,總結(jié),思考題,5/5：總結(jié)及思考題,1、什么是熒光？它有