臨床免疫定性實驗的質量保證.ppt

1、臨床免疫定性實驗的質量保證,一、相關基礎知識,質量保證(Quality Assurance,QA) 為一產品或服務滿足特定質量,要求提供充分可信性所必要的有計劃的和系統(tǒng)的措施。也可以說是為了提供信任表明實體能夠滿足質量要求，而在質量體系中實施并根據需要進行證實的全部有計劃和有系統(tǒng)的活動。,室內質量控制（Internal Quality Control,IQC) 由實驗室工作人員，采取一定的方法和步驟， 連續(xù)評價本實驗室工作的可靠性程度，旨在監(jiān)測 和控制本實驗室工作的精密度，提高本室常規(guī)工 作中批內、批間樣本檢驗的一致性，以確定測定 結果是否可靠、可否發(fā)出報告的一項工作。,室間質量評價 （Ext

2、ernal Quality Assessment, EQA） 為客觀比較一實驗室的測定結果與靶值的差異，由第三方機 構，采取一定的辦法，連續(xù)、客觀地評價實驗室的結果，發(fā)現誤 差并校正結果，使各實驗室之間的結果具有可比性。這是對實驗 室操作和實驗方法的回顧性評價，而不是用來評價實時的測定結 果的可接受性。當EQA用來為執(zhí)業(yè)許可或實驗室認證的目的而評價 實驗室操作時，常描述為實驗室能力比對檢驗（Proficiency testing, PT）。,常用臨床免疫檢驗方法,三大“標記”免疫檢驗技術:熒光標記、放射性核素標記和酶標 其它標記免疫測定技術：發(fā)光物標記、金標、鑭系元素標記等 免疫沉淀和免疫凝集

3、試驗,實驗方法的選擇,公認的參考方法。 參照衛(wèi)生部臨床檢驗中心制定的臨床檢驗操作規(guī)范中所推薦的方法。 根據權威部門發(fā)布的方法學評價結果，選用線性關系好、靈敏度高、特異性強、穩(wěn)定性好的實驗方法。,方法的評估,參數設定 ：真陽性 TP ，真陰性 TN ，假陽性FP ，假陰性 FN 敏感性 :患者中陽性百分率 公式： 100 特異性 :非患者中陰性百分率 公式： 100 ,方法的評估,診斷效率 :準確區(qū)分患者及非患者能力 公式： 100% 陽性預測值 :在所有陽性結果中真患者百分率 公式： 100%,方法的評估,陰性預測值 :在所有陰性結果中非患者百分率 公式： 100%,二、影響ELISA測定的因

4、素,標本收集 實驗室測定 報告和解釋 灰區(qū)的設置 結果報告和解釋 室內質控,樣本的外源性干擾因素：,標本溶血 標本被細菌污染 標本貯存時間過長 標本凝固不全 冷凍保存標本避免反復凍融,樣本的內源性干擾因素：,類風濕因子 補體 異嗜性抗體、治療性抗體、自身抗體 溶菌酶 磷脂 藥物小分子 總蛋白濃度,試劑盒的因素,固相材料:聚苯乙烯塑料 抗原:純化、合成和基因工程抗原 抗體：多抗、單抗和基因工程抗體 酶結合物：酶免疫測定的核心成份 色原底物： OPD 和 TMB 運輸貯存,儀器的校準與標定,酶標儀的校準一定要定時進行（一般使用頻繁不超過半年，最多不超過一年）。 加樣器及水浴用溫度計均應進行計量校準

5、后使用，前者可采用稱重法校準，后者可到國家計量單位進行。,酶免疫測定操作中的注意事項,加樣 溫育 洗板 顯色 比色 結果判斷 結果報告及解釋,加樣,定期對移液器進行維護和校準 加樣不可太快，避免加在孔壁上部，不可濺出和產生氣泡。 全自動加樣系統(tǒng)的標本“交叉污染”問題 。 操作時差對結果的影響,溫育,常采用的溫育溫度有 43 、 37 、室溫等。 溫育所需時間與溫度成反比，即溫育溫度高，則所需時間相對較短。 溫育時，微孔板應置于水?。ǜ∮谒妫┗驖窈兄?，以使反應溶液的溫度迅速與室溫平衡。 “邊緣效應”的排除: 使用水浴或在將反應溶液加入至板孔中時，將板和溶液均加熱至溫育溫度。,洗板,洗滌是ELI

6、SA測定過程中決定實驗成敗的關鍵步驟 。 洗板液一般為含0.05% Tween20 的中性 PBS 。 手工洗板要避免氣泡殘留孔內，洗板機洗板時，將洗液完全吸凈，否則空白值將升高甚至出現“花板”現象 。 機洗的次數要通過多次實驗來確定。,顯色,加入底物 A 和 B 后，應振蕩混勻 當底物為 OPD(鄰苯二胺） 時，顯色反應應避光進行；底物為TMB（四甲基聯苯胺）時，要新鮮配制。 顯色時間：建議在 37 下反應1530分鐘后，終止反應比色測定。,比色,加酸終止顯色反應后，比色測定前應振蕩混勻 測定時，要注意酶標儀的波長是否已調至合適 最好選擇雙波長比色測定，雙波長測定能去除背景的干擾，注意避免出

7、現吸光度值為負值的現象。,灰區(qū)的概念,ELISA“灰區(qū)”是把定量分析的正常值范圍引入定性分析而建立的概念。即將CO值上下一段區(qū)域定為陽性可疑。處于“灰區(qū)”的樣本，可通過確認試驗或重復檢測來確定到底是陽性還是陰性 。如果重復檢測仍然落在“灰區(qū)”，則結果可報“陽性”。,灰區(qū)的設置,灰區(qū)”的設置有二種方式：CO（1CV）， CV為該試劑的批內CV (一般在15-20%)；CO2s，s為實驗室做室內質控RCV常規(guī)條件下的變異）的標準差。,結果判斷與報告,按照試劑盒確定的 Cut-off 值判斷結果 。 對于“灰區(qū)”的問題，報告方式引入“可疑”較為合理，同時對結果做必要的說明。 各試劑盒CO值差異及變異

8、系數大等因素，結果缺乏可比性，位報告結果的不一致對于臨床實驗室來說是不可回避，也是目前醫(yī)療糾紛主要集中點和“結果互認”的最大障礙，所以必須引入陽性和弱陽性的報告方式。 ELISA檢測的原始存根必須完整而全面地保存 。,室內質量控制（ IQC ）,IQC是一個集體活動，不光是對實驗室一次測定的有效性的判斷，也反應了實驗室測定趨勢的變化。 IQC的失控不能做為處罰的依據，應建設性的找出失控的原因，針對其采取措施加以改進。 對IQC應定期進行評價,統(tǒng)計質控方法,質控物濃度的選擇 每次（批）質控物的數量和放置位置 質控規(guī)則 Levey-Jennings質控圖方法 “即刻法”質控方法,質控血清的選擇,弱

9、陽性質控血清：趨近測定下限的反應物濃度水平；能靈敏的反映試劑盒測定下限的改變，確保弱陽性標本不被漏檢。 陰性質控血清：避免分析物和微生物之間出現交叉反應；能監(jiān)測到出現假陽性反應常見的原因。,定性免疫測定質控物濃度的選擇,陽性質控標本選擇： 可選擇S/CO值減去三倍批間CV與該S/CO值的乘積（仍大于1的質控血清作室內質控用，計算公式： S/CO（1-3CV%）1 S/CO比值可在1.54之間 弱陽性質控標本選擇： 選擇S/CO處于1.01.5左右的質控血清以判斷每次測定時試劑盒測定下限的有效性。,每塊板質控物的數量及位置,23份弱陽性質控 23份陰性質控 隨機放置血液標本中間,Levey-Je

10、nnings 質控圖方法,基本的統(tǒng)計學含義：穩(wěn)定條件下，在20個 IQC 結果中不應有多于1個結果超過2 SD （ 95.5% 可信限）限度；在1000個測定結果中超過3 SD （ 99.7% 可信限）的結果不多于3個。 如以3 s 為失控限，假失控的概率為0.3%。 Levey-Jennings 質控圖結合 Westgard 多規(guī)則質控方法,Westgard多規(guī)則質控方法,l 2S ：一質控點在 2S 之外應警惕。 13s:一質控點在 3S 之外，為失控。 R 4S ：連續(xù) 2 個質控點相差 4S 。 4 1S ：連續(xù) 4 個質控點落同側 1S 之外。 X ：連續(xù) 7 個質控點落均值一側。,

11、室內質控的現狀及應對措施,對于抗體檢測，尤其是競爭法檢測HBeAb、HbcAb，由于不同試劑盒、不同檢測方法間CO值存在差異及變異系數大等因素，結果缺乏可比性，在沒有統(tǒng)一的判斷標準、及明確的臨床意義的情況下，引入弱陽性報告方式。 由于質控品不穩(wěn)定，每個月需重新設立靶值 對位于“灰區(qū)”和弱陽性結果及少見模式結果進行復查，避免偶然因素及孔間差對結果造成影響,質控小結,定期召開質控分析會，討論質量控制情況 要在常規(guī)條件下建立質控圖參數，用S/CO比值繪制質控圖 采用自制的質控物，是一種經濟的方法，關鍵是要確保質控物的性質穩(wěn)定 使用新批次的外部對照質控物時，必須重新繪制質控圖。變異系數(cv)小于20,質控小結,建議長期和穩(wěn)定地使用一種質量好的試劑盒，更換不同廠家的試劑盒后，必須重新繪制質控圖。改用新批號試劑盒也應重新制作質控圖。 發(fā)現質控結果失控，應填寫報告單，上交質量負責人，分析原因并決定是否發(fā)出檢測報告。,質控小結,根據不同質控工作的具體要求，在Westgard多規(guī)則方法中，實際采用的“多規(guī)則”本身并非嚴格的一成不變，而是可多可少，并可以用不同方式進行組合。 當失控時，能確定產生失控的分析誤差的類型，有助確定失控原因以尋找解決問題的辦法。,乙肝檢驗存在的問題,HBV基因組變異對病毒HBsAg和HBeAg測定影響問題，以及如何評價試劑盒對這些