獸醫(yī)微生物12.ppt

1、禽腺病毒研究進(jìn)展,Lecture 12,腺病毒（Adenovirus, Adv）的分類,哺乳動物腺病毒屬（Mastadenovirus） 禽腺病毒屬(Avastrovirus） 唾液腺病毒屬(Siadenovirus) 蛙腺病毒、火雞腺病毒A 胸腺病毒屬(Atadenovirus) 山羊腺病毒、牛腺病毒48、 產(chǎn)蛋下降綜合征病毒,Adenovirus structure and genome organization.,CELO病毒與Ad2、Ad5基因組結(jié)構(gòu)的比較,Adenovirus DNA replication is a protein-primed process that occur

2、s in the nucleus: 1. Preterminal protein (pTP)/DNA polymerase (Pol) complex formed (both E2 proteins) 2. Continuous 53 synthesis of DNA by viral polymerase; DNA coated by ssDNA Binding Protein (DBP) 3. Because of terminal repeats, origin of replication reforms on displaced strand, leading to further

3、 replication,Adenovirus DNA replication,新的血清型腺病毒的出現(xiàn) 1、 PsAdV：從鸚鵡中分離得到，PCR擴(kuò)增五鄰體蛋白的頸環(huán)區(qū)1，與12個血清型的禽腺病毒、EDSV和火雞腺病毒3型核苷酸相似性為60.367.0，氨基酸相似性為51.361.0。37個氨基酸變化中有27個在頸環(huán)區(qū)的4個高變區(qū)，編碼血清特異性表位。但是擴(kuò)增片段的G/C含量、等電點(diǎn)在I群禽腺病毒的范圍以內(nèi)，命名為一種新的腺病毒PsAdV 2、從長尾鴨中分離到一株腺病毒，不能被I、II、III群禽腺病毒的抗血清中和，認(rèn)為可能是一種新的血清型。 3、從感染傳染性病毒性腺胃炎的肉雞中分離到一株類似

4、腺病毒的病毒，由于特異性識別I、II、III群禽腺病毒的免疫熒光和PCR不能檢測到該病毒，認(rèn)為不同于其他腺病毒 。,心包積水綜合征 1 1998年印度發(fā)生心包積水綜合征，它主要感染3-6W齡的肉雞，以突然發(fā)生、高死亡率（20-70%）、心包積水、質(zhì)脆的花斑肝和肝細(xì)胞內(nèi)核內(nèi)包涵體為特征，還有胰腺壞疽和心室的損傷。能垂直傳播或通過口糞途徑進(jìn)行橫向傳播。 2 病原是FAV-4,可以在CEK和CEL上復(fù)制。 3 引起心包積水綜合征的FAV-4病毒，8個多肽相似，分子量20-107KD，但不同于CELO，尤其是24.2KD。至少有5個蛋白質(zhì)片段與CELO有關(guān)。 4 FAV-12也參與了心包積水綜合征。,

5、禽腺病毒基因組結(jié)構(gòu)和功能研究進(jìn)展 1 ITR FAdv-1： OTE株 5-CATCATC PHELPS株 5-GATGATG 對pTP和Pol進(jìn)行序列分析不能解釋模板特異性的不同。 復(fù)制試驗表明：以上述任一序列相臨的DNA片段能在PHELPS株和OTE株感染的細(xì)胞上復(fù)制。 因此認(rèn)為FAdv-1在復(fù)制起始上具有松弛但不是改變的特異性。,2 CELO基因組 ORF-2、 ORF-12、 ORF-13、ORF-14：ATP酶/解螺旋酶。 ORF-9、 ORF-10、 ORF-11、 ORF-16 ：免疫調(diào)節(jié) ORF-18/19：甘油三酯脂酶，在感染禽類中有特殊的作用。 3 FAdV4 對印度的3株

6、雞源分離株和1株鵪鶉源FAdV4六鄰體的L1頸環(huán)區(qū)測序，并與其它所有的FadV4比較，表明FAdV4六鄰體的L1頸環(huán)區(qū)在核苷酸和氨基酸水平上高度同源,EDSV 提取分離自中國病雞的EDSV弱毒株AA-2的核苷酸，構(gòu)建基因組文庫，其中Hind IIIA片段編碼55kd蛋白，長1014nt(38200),與人adv1、12、40、犬ADV、禽I群腺病毒有25.532.4%的同源性，與綿羊腺病毒的同源性有46.4%,CAR受體是CELO 病毒受體 CAR是Ad5等腺病毒的高親和性受體，而纖突分子決定了對細(xì)胞結(jié)合區(qū)的高親和性，使得病毒能與CAR結(jié)合。CELO在衣殼表面有兩個纖突，推測可能是一個或兩個纖

7、突決定了CELO的細(xì)胞結(jié)合功能。,以禽腺病毒為載體研制 基因工程疫苗,目前禽類病毒性載體的研究現(xiàn)狀,禽腺病毒載體的研究概況：,國外-CELO病毒，F(xiàn)AV-8， FAV-10,國內(nèi)-EDS、豬腺病毒、牛腺病毒、狗腺病毒、禽腺病毒,腺病毒作為活疫苗應(yīng)用較安全 重組腺病毒能刺激機(jī)體產(chǎn)生系統(tǒng)免疫和良好的 局部粘膜免疫 腺病毒載體應(yīng)用方便、表達(dá)效率高 一些人腺病毒和動物腺病毒載體構(gòu)建成功并在 臨床上成功應(yīng)用；,腺病毒載體的特點(diǎn),腺病毒載體的優(yōu)缺點(diǎn),優(yōu)點(diǎn)： 宿主范圍廣，致病性低，在機(jī)體內(nèi)復(fù)制不發(fā)生整合 腺病毒基因組中等大小，載體操作方便 重組腺病毒下游研究工作方便 腺病毒載體應(yīng)用方便 腺病毒載體表達(dá)效率高

8、 缺點(diǎn)： 腺病毒載體外源基因容量小 腺病毒自身的抗原性 腺病毒載體的致癌性和致病性,體外直接連接（direct ligation in vitro） 體內(nèi)同源重組（in vivo homologous recombination）,腺病毒載體的構(gòu)建方法,CELOV,Fiber,p,E3？,E3區(qū)在不同腺病毒的大小及位置示意圖,E3？,E3？,體內(nèi)同源重組,細(xì)胞內(nèi)病毒DNA同源重組,細(xì)胞內(nèi)質(zhì)粒DNA同源重組,群禽腺病毒江蘇分離株（FAVI-JS）的分離鑒定,研究方法,泄殖腔拭子,接種雞胚,形態(tài)學(xué)觀察血凝試驗,感染雞胚腎細(xì)胞（CEK）,PL1：5ggggcggccgcgatgatgtataataa

9、cct3; PL2：5gggtctagactcacgcgacatgactgtct3 Pr1：5gcgtctagaccagaaccattcttcagccg3 Pr2：5gcggaattcgtaccggactgttgtgcgga3 PITR1：5gcggaattcacacacggacaacttcaaag3 PITR2：5gcggtcgacgatgatgtataataacctc3,序列比較,TEM picture of The virus from chicken allantoic fluit infected with FAVI-JS isolate（1.3 105 、1.9105 ）,結(jié)果,病

10、毒在雞胚尿囊液上的電鏡照片,FAVI-JS在CEK上的病變,Cytopathogenic effect by FAVI-JS in CEK cells. A. Cytopathogenic effect result B. Normal CEK cells,Electrophoresis analysis of PCR products A. PCR result of left terminal of FAVI-JS; B. PCR result of right terminal of FAVI-JS; C. PCR result of ITR terminal of FAVI-JS,PC

11、R擴(kuò)增結(jié)果,2.0kb,Table.1. The nucleotide sequence homology between the three fragment of FAVI-JS and the relevant fragment of FAVI,表1. FAVI-JS與I群禽腺病毒一些毒株三個相應(yīng)片段的序列同源性（單位：%）,Phylogenetic tree based on ITR sequences,根據(jù)ITR序列繪制的遺傳發(fā)育樹,FAVI-JS復(fù)制非必需片段的確定,pHC,MCS,Construction of FAVI-JS transfer vector,轉(zhuǎn)移質(zhì)粒載體的構(gòu)建,

12、genome,1.5kb,Electrophoresis analysis of PCR products A. PCR result of left terminal of FAVI-JS; B. PCR result of right terminal of FAVI-JS; C. PCR result of ITR terminal of FAVI-JS,PCR擴(kuò)增結(jié)果,2.0kb,Construction of FAVI-JS transfer vector contained eGFP gene,含eGFP基因FAVI-JS轉(zhuǎn)移質(zhì)粒載體的構(gòu)建,含eGFP基因的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒載體的酶切鑒定結(jié)

13、果,Electrophoresis analysis of eGFP transfer vector by restriction enzyme,含eGFP基因重組FAVI的構(gòu)建,含eGFP重組病毒轉(zhuǎn)染CEK（出現(xiàn)可疑重組病毒熒光斑）,CEK was transfected by pFAVI-eGFP,熒光細(xì)胞的收獲及含eGFP基因重組FAVI的純化,純化后的重組病毒熒光 左圖：rFAVI-eGFP單個熒光斑， 右圖： rFAVI-eGFP感染CEK單層出現(xiàn)得大片熒光,TEM pictures of wt-FAVI-JS and rFAVI-eGFP（19 thousand） Left：wt-

14、FAV，Right： rFAVI-eGFP,rFAVI-eGFP的形態(tài)學(xué)觀察,重組病毒的相對遺傳穩(wěn)定性試驗,The twentyth passage of rFAVI-eGFP in CEK,The kinetics of the growth of rFAVI-eGFP and wtFAVI-JS in CEK,rFAVI-eGFP和wtFAVI-JS在CEK上的生長曲線,The kinetics of the growth of rFAVI-eGFP in chicken embryo by different ways of injection,不同接種途徑接種后rFAVI-eGFP 在

15、雞胚上的生長曲線,FAVI-JS通用型轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建,引物設(shè)計,P1 5 TAG GAA TTC TTC GCG ATG TAC GGG CCA GAT 3 (加EcoR I位點(diǎn)) P2 5 TAG GAA TTC CCA TAG AGC CCA CCG CAT CCC 3 (加EcoR I位點(diǎn)),FAVI-JS通用型轉(zhuǎn)移載體pFACMV3.1的構(gòu)建,Electrophoresis analysis of pFACMV3.1 by some usable restriction enzyme 1. 1kb DNA Marker; 2. EcoR I; 3. Kpn I; 4. Not I; 5

16、. Apa I; 6. Nhe I,pFACMV3.1中部分可用酶切位點(diǎn)的鑒定結(jié)果,表達(dá)傳染性法氏囊病毒VP2基因 的重組禽腺病毒的構(gòu)建,含VP2基因禽腺病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒載體pFAVI-VP的構(gòu)建,人類醫(yī)學(xué)中對重組禽腺病毒的研究 CELO病毒是新型腺病毒載體，具有產(chǎn)量高、病毒穩(wěn)定性高、不與AD5中和抗體反應(yīng)的優(yōu)點(diǎn)。 1 CELOp53 用重組CELO病毒能將在存在抗人AD5的抗體的情況下將基因轉(zhuǎn)移到各個器官。 重組的表達(dá)P53的CELO在培養(yǎng)的人腫瘤細(xì)胞和裸鼠異種移植物中能恢復(fù)P53的腫瘤抑制功能。后期還能抑制腫瘤生長。 CELOp53能在人表皮癌細(xì)胞A431，肺腺癌細(xì)胞H1299和 Hela上激

17、活P53靶基因，這些細(xì)胞以不同的機(jī)制關(guān)閉了內(nèi)源性p53的表達(dá)。,CELO-TK 構(gòu)建了CMV啟動子控制下的表達(dá)HSV胸苷激酶（TK）或EGFP的 重組CELO病毒。 在人和鼠細(xì)胞以及鼠C57BL/6鼠的黑色素瘤中有抗癌活性。CELO-TK能將功能性HSV-TK轉(zhuǎn)移到腫瘤細(xì)胞系。 在H1299細(xì)胞對CELO-TK和ad5-tk比較，同樣能增加CELO載體感染多樣性。 CELO載體能在C57BL/6鼠的黑色素瘤轉(zhuǎn)導(dǎo)EGFP和HSV-tk。腫瘤內(nèi)注射CELO-TK能抑制腫瘤生長，提高了存活率。 這一研究表明CELO是轉(zhuǎn)移藥物前體基因如HSV-tk到腫瘤細(xì)胞的有效工具。,4 構(gòu)建了CMV啟動子控制下的

18、表達(dá)SEAP的重組CELO病毒,研究了其在293、A549、H1299、LMH、B16中的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。通過不同途徑在C57BL/6鼠檢測到SEAP的表達(dá)。在免疫抑制小鼠SEAP表達(dá)持續(xù)21天。可以在雞胚尿囊液中檢測到SEAP的表達(dá)。 5 表達(dá)的EGFP和人IL-2重組CELO在雞胚、腎管狀和絨毛膜尿囊膜細(xì)胞。在細(xì)胞和活體水平上研究了CELO載體的轉(zhuǎn)導(dǎo)人和動物細(xì)胞的能力。首次在C57BL/6鼠的黑色素瘤B16檢測到EGFP的表達(dá)。首次在雞胚尿囊液中檢測到人IL-2基因的表達(dá)。 6 表達(dá)血小板生長因子的重組腺病毒能在禽動脈損傷模型中抑制血栓癥形成。,檢測方法 1 PCR檢測EDSV76在組織中的分布，即脾、子宮、毛皮，在子宮中可以存在21天，在毛皮中檢測到病毒對研究層養(yǎng)雞疾病有意義 2 建立的檢測EDSV抗體的ELISA方法高度敏感特異。用HI和ELISA檢測抗EDSV抗體，發(fā)現(xiàn)兩種方法的符合率為0.793，ELISA方法能有效的用于疫苗和感染雞血清的抗體檢測?？梢杂糜诳贵w監(jiān)測。 3 用PCR和ELISA檢測抗EDSV抗原，特