紙層析法分離鑒定氨基酸.ppt

1、實(shí)驗(yàn)二、紙層析法分離鑒定氨基酸,一、目的： 學(xué)習(xí)并掌握紙層析法分離鑒定氨基酸的原理和方法。,二、原理 紙層析法是用濾紙作為惰性支持物的分配層析法，其中濾紙纖維上吸附的水是固定相，展層用的有機(jī)溶劑是流動(dòng)相。在層析時(shí)，,將樣品點(diǎn)在距濾紙一端約23cm的某一處，該點(diǎn)稱為原點(diǎn)；然后在密閉容器中層析溶劑沿濾紙的一個(gè)方向進(jìn)行展層，這樣混合氨基酸在兩相中不斷分配。由于分配系數(shù)（Kd）不同，結(jié)果它們分布在濾紙的不同位置上。物質(zhì)被分離后在紙層析圖譜上的位置，可用比移值（Rf）來表示。 所謂Rf，是指在紙層析中，從原點(diǎn)至氨基酸停留點(diǎn)（又稱為層析點(diǎn)）中心的距離（X）與原點(diǎn)至溶劑前沿的距離（Y）的比值。如圖,在一定條

2、件下（如溫度、展層劑的組成、層析紙質(zhì)量等不變），某種物質(zhì)的Rf 值是常數(shù)，因此可作為定性依據(jù)。 由于氨基酸無色，可利用茚三酮反應(yīng)使氨基酸層析斑點(diǎn)顯色，從而作定性分析。本實(shí)驗(yàn)利用紙層析法分離氨基酸。,三、操作,1. 在層析缸中裝入展層劑，其高度約1.52cm。 2. 準(zhǔn)備濾紙: 戴上手套，取層析濾紙（長22 cm、寬14 cm）一張，在紙的一端距邊緣3cm處用鉛筆畫一條直線，在此直線上每間隔2cm作一記號(hào)，為點(diǎn)樣位置（即原點(diǎn)），如圖。注意事項(xiàng)：手不能直接接觸濾紙；直線與底邊平行。 3. 點(diǎn)樣：用毛細(xì)管依次將Lys(賴) 、 Gly(甘) 、 Pro(脯)、Val (纈)、 Leu (亮)和混合樣

3、品分別點(diǎn)在這6個(gè)位置上，點(diǎn)樣點(diǎn)干后再點(diǎn)一次。注意每點(diǎn)在紙上擴(kuò)散的直徑，最大不超過3mm。,紙層析點(diǎn)樣標(biāo)準(zhǔn)圖,Lys Gly Pro Val Leu 混合樣品,4、展層：將點(diǎn)好樣的濾紙(點(diǎn)樣面朝外)卷成筒狀，用透明膠紙粘接或用線縫好，紙的兩邊不能接觸。將濾紙直立于層析缸中（注意：點(diǎn)樣的一端在下，展層劑的液面需低于點(diǎn)樣線1cm ，濾紙勿與缸壁接觸），蓋好層析缸蓋，進(jìn)行展層。待溶劑上升1520 cm時(shí)，取出濾紙，用鉛筆描出溶劑前沿界線，電吹風(fēng)吹干。,5、顯色：用噴霧器均勻噴上0.1水合茚三酮正丁醇溶液，然后用電吹風(fēng)吹干即可顯出各層析斑點(diǎn)。,卷成筒狀的濾紙,四、計(jì)算： 用直尺測(cè)量并計(jì)算出各種氨基酸的Rf值。,試劑和器材： 1. 試劑： (1) 氨基酸溶液：0.5% (m/V)的賴氨酸、脯氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸溶液及它們的混合液 (各組分的濃度均為0.5)。 (2) 展層劑：正丁醇冰醋酸水413 (V/V)。 (3) 顯色劑：0.1 (m/V)水合茚三酮正丁醇溶液 。 2.