儀器分析平面色譜法.ppt

1、1,平面色譜法,plane chromatography,2,色譜分類,GC LC SFC,3,概述,平面色譜法是在平面上進行分離的一種色譜方法 是一種基于混合物組分在固定相和流動相之間的不均勻分配或保留而將其分離的方法,4,特點：,方便、快速、成本較低，易于推廣 樣品的預處理比較簡單 應(yīng)用范圍廣 展開劑選擇范圍寬,5,歷史簡介,1938年，俄國人Izmailov和Shraiber首先實現(xiàn)了在氧化鋁薄膜上分離一種天然產(chǎn)物。 1949年，兩位美國化學家報導了用薄層色譜法成功地分離了精油中的萜烯。 1958年，德國化學家Stahl系統(tǒng)描述了用作涂布薄層的材料（薄層色譜固定相）和涂板設(shè)備，對薄層色譜

2、技術(shù)也進行了規(guī)范化描述。 Stahl于1965年出版了薄層色譜法一書。,6,20世紀80年代,出現(xiàn)了儀器化薄層色譜法，薄層色譜的每一步均用儀器來代替以往的手工操作，再配以薄層掃描儀，這樣就使薄層色譜法的定量結(jié)果的重現(xiàn)性和準確性大大提高。,7,平面色譜參數(shù),定性參數(shù) 相平衡參數(shù) 面效參數(shù) 分離參數(shù),8,（一）定性參數(shù),比移值（Rf） Rf = L/ L0 相對比移值（Rr） Rr = Rf(i) / Rf(s) = Li / Ls,最佳范圍 0.3 0.5 可用范圍 0.2 0.8,9,（二）相平衡參數(shù),分配系數(shù)（distrabution coefficient; K ） 容量因子（capaci

3、ty factor; k）,保留比R是在單位時間內(nèi)一個分子在流動相中出現(xiàn)的幾率。在平面色譜中，也可表示組分分子在平面上移動的速度,10,當Vs和Vm固定時，Rf 由K決定 K不等是分離的前提 當實驗條件固定時，K只與組分性質(zhì)有關(guān),Rf為1 的組分，K與k為0，表示該組分不被固定相保留； Rf為0 的組分，K與k為，表示該組分停留在原點，完全被固定相所保留。,11,思考題：,下列色譜參數(shù)中數(shù)值在01之間的是（ ） ARf Br CR Dk,12,（三）面效參數(shù),理論塔板數(shù) L為原點到斑點中心的距離，W為組分斑點的縱向?qū)挾取?塔板高度 H = L0 / n L0為斑點到溶劑前沿的距離,13,（四）

4、分離參數(shù),分離度（resolution R） 分離數(shù)（separation number SN）,14,（四）分離參數(shù),分離數(shù)（separation number SN） 在相鄰峰的分離度為1.177時，在Rf=0及Rf=1兩種組分的色譜峰間能容納的色譜峰數(shù)。SN越大，薄層板的容量越大。,15,第二節(jié) 薄層色譜法（thin layer chromatography; TLC）,將細粉狀的吸附劑或載體（固定相）涂布于玻璃板、塑料板或鋁箔上，成一均勻薄層并進行活化，將混合物樣品與對照品溶液點在同一薄板的一端（原點），在密閉的容器中用適當?shù)娜軇鲃酉嗷蛘归_劑）展開，顯色后樣品斑點與對照品斑點進行比

5、較，用于定性鑒別或含量測定的方法。,16,特點,分離能力強，斑點集中 靈敏度高，g ng 展開時間短，min 試樣預處理簡單，對被分離組分性質(zhì)沒有限制 上樣量較大 所用儀器簡單，操作方便,17,一、薄層色譜法的主要類型,吸附薄層色譜法 固定相為吸附劑 一般極性大的組分移動速度慢 分配薄層色譜法 固定相為液體（吸附于載體上），固定相極性大于流動相極性時為正相色譜 在正相色譜中極性大的組分移動速度慢,18,二、吸附薄層色譜的吸附劑和展開劑,（一）吸附劑 硅膠 氧化鋁 硅膠具微酸性適于分離酸性和中性物質(zhì) 氧化鋁具微堿性適于分離堿性和中性物質(zhì),19,硅膠,表面帶有硅醇基呈弱酸性，硅醇基與極性基團形成氫

6、鍵而表現(xiàn)其吸附性能，不同組分的極性基團因與硅醇基形成氫鍵的能力不同而被分離。 硅膠吸水形成水合硅醇基而失去吸附能力，加熱（105110）可失去水而提高活度，增加吸附能力，這一過程稱為“活化” 。 含水量越多，級數(shù)越高，吸附能力越弱，同一組分在此硅膠上的Rf值越大。,20,氧化鋁和硅膠含水量與活性的比較,21,與硅膠的分離效率有關(guān)的是,粒度和孔徑 硅膠粒度越小，均勻性越好，分離效率越高； 表面積 硅膠表面積越大，則與樣品之間的相互作用越強，即吸附力越強。,22,氧化鋁,堿性（pH910）分離堿性（生物堿）、中性物質(zhì) 中性（pH7.5）廣泛 酸性（pH45）酸性、中性,23,商品出售的薄層色譜用氧

7、化鋁和硅膠有：,氧化鋁（硅膠） G，表示含有粘合劑煅石膏； 氧化鋁（硅膠） H ，表示不含有粘合劑； 氧化鋁（硅膠）HF254，表示不含粘合劑而含有熒光物質(zhì)；在254nm波長紫外光下呈強烈黃綠色熒光背景。,24,（二）展開劑,薄層色譜中的展開是在一個具有一定空間和形狀的密閉容器中，展開劑沿薄層（固定相）運動。 通過組分分子與展開劑分子爭奪吸附劑表面活性中心而達到分離。,25,展開劑的選擇,主要是根據(jù)被分離物質(zhì)的極性、吸附劑的活度和展開劑的極性三者的相對關(guān)系進行選擇 先用單一溶劑展開，然后根據(jù)分離效果進行調(diào)整，經(jīng)常使用混合展開劑 分離酸堿組分時，展開中加入少量酸、堿。,26,化合物極性、吸附劑活

8、度和展開劑極性間的關(guān)系,27,三、薄層色譜操作方法,薄層板制備 點樣 展開 顯色,28,薄層板制備,玻璃板的大小 軟板不加粘合劑 硬板加粘合劑如515%石膏 或 0.250.75%CMC-Na,29,點樣,配樣溶劑的選擇 取決于待分析化合物的類型及其特性，相似相溶。合適的樣品濃度應(yīng)為0.01%0.1% 點樣量 影響展開后樣品的形狀和位置。一般而言，樣品量在最小檢測限的幾倍至幾十倍是比較恰當?shù)?。點樣量一般為幾微升。,30,展開,展開劑流速 展開劑在薄層中的流速與展開劑的粘度、表面張力、吸附劑種類、粒度、均勻度、展開距離等因素有關(guān)。 薄層板上吸附劑的顆粒越粗，展開劑遷移速度越快；薄層板上吸附劑的顆

9、粒越細且均勻，展開劑移動速度越慢。,31,展開,展開器皿 使用的器皿一般為長方形密閉玻璃缸，稱為層析缸或色譜缸。 展開方式 常用上行法，另外還有下行法、徑向展開、多次展開 、雙向展開。,32,展開過程中注意溶劑蒸氣飽和,邊緣效應(yīng) 同一物質(zhì)在同一薄層板上出現(xiàn)中間部分的Rf值比邊緣的Rf值小，這種現(xiàn)象稱為邊緣效應(yīng)。 產(chǎn)生原因 防止邊緣效應(yīng) 密閉容器，先用溶劑蒸氣飽和。,33,顯色斑點的定位,有色物質(zhì) 日光下觀察 有紫外吸收 紫外燈下觀察 在熒光背景下呈現(xiàn)暗斑 無色物質(zhì) 噴灑顯色劑,34,四、定性和定量分析,定性分析 Rf值 定量分析 洗脫法 直接定量法,目視比色法 薄層掃描法,35,五、高效薄層法

10、,高效薄層色譜法（high performance thin layer chromatography；HPTLC） 是在現(xiàn)代色譜理論指導下，以經(jīng)典薄層色譜法為基礎(chǔ)發(fā)展起來的一種新型薄層色譜技術(shù)。,36,特點,分離效率高 分析速度快 檢測靈敏度高等特點 高效薄層色譜法與經(jīng)典薄層色譜法比較見表18-2,37,六、薄層掃描法,用一定波長的光束照射展開后的薄層板，測定薄層色譜斑點的吸光度A（或熒光強度F）隨展開距離l的變化，所記錄的Al（或Fl）曲線稱為薄層色譜掃描圖，利用薄層掃描圖進行定量及定性分析的方法成為薄層掃描法。,38,薄層吸收掃描法,透過法與反射法 單波長法和雙波長法,39,測定波長的選

11、擇,常采用雙波長法s 選用被測組分的最大吸收波長，R選用不被被測組分吸收的波長（薄層板的空白吸收）。由于從測量值中減去了薄層本身的空白吸收，所以在一定程度上消除了薄層不均勻的影響，使測定結(jié)果準確度提高。,40,反射法測定,測光方式可分為透射法及反射法 透射法比反射法強度大，但受外界條件的影響較大，使用上受到限制。因此常用反射法,41,掃描方法,線形掃描快速，但在斑點不規(guī)則和濃度不均勻時測量誤差較大。 曲折形掃描適用于形狀不規(guī)則及濃度分布不均勻的斑點。,42,散射參數(shù)的選擇,由于吸光度與斑點中組分的量不成線性，即不遵守比耳定律，故校正曲線成彎曲狀，需要將其校正為直線。 曲線校正是將散射參數(shù)和處理

12、方法存入計算機，計算機根據(jù)適當?shù)男拚绦?，自動進行校正給出符合一定線性關(guān)系的數(shù)值，從而得到一定線性的定量工作曲線 硅膠薄層板一般選，氧化鋁薄層板選。,43,薄層色譜掃描法的定量分析,外標法 內(nèi)標法 歸一化法,44,外標兩點法定量,45,七、薄層色譜的應(yīng)用及實例,廣泛應(yīng)用于各種天然和合成有機物的分離和鑒定，有時也可用于小量物質(zhì)的精制。 藥品質(zhì)量監(jiān)控，可用于測定藥物的純度和檢查降解產(chǎn)物。 在生產(chǎn)上可用于判斷反應(yīng)終點，監(jiān)視反應(yīng)過程。 對中藥和中成藥，薄層色譜鑒別應(yīng)用廣泛，可鑒別有效成分，進一步進行含量測定。,46,實例,判斷合成反應(yīng)進行的程度鹽酸普魯卡因合成過程 藥品的鑒別和純度檢查硫酸長春堿的雜質(zhì)檢查 天然藥物的鑒別和定量測定六應(yīng)丸中有效成分的定性和定量,47,第三節(jié) 紙色譜法,一、分離原理 紙色譜法（paper chromatography）是以紙為載體的平面色譜法。紙色譜法分離原理屬于分配色譜的范疇。與薄層色譜相同，紙色譜