生物化學(xué)課件9-酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)

1、2006-1-7,上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,第九章 酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué),一、化學(xué)動(dòng)力學(xué)基礎(chǔ),二、底物濃度對(duì)酶反應(yīng)速率的影響,三、酶的抑制作用,四、溫度對(duì)酶反應(yīng)速度的影響,五、pH對(duì)酶反應(yīng)的影響,六、激活劑對(duì)酶反應(yīng)的影響,2006-1-7,上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,一、化學(xué)動(dòng)力學(xué)基礎(chǔ),化學(xué)反應(yīng)的兩個(gè)基本問題：（1）反應(yīng)進(jìn)行的方向、可能性和限度；（2）反應(yīng)進(jìn)行的速率和反應(yīng)機(jī)制。,（一）反應(yīng)速率及其測(cè)定,反應(yīng)速率是以單位時(shí)間內(nèi)反應(yīng)物或生成物濃度的改變來表示。用瞬時(shí)速率表示反應(yīng)速率： v =dc/dt 反應(yīng)速率的測(cè)定實(shí)際上就是測(cè)定不同時(shí)間的反應(yīng)物或生成物的濃度。,2006-1-7,上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,（二）反應(yīng)

2、分子數(shù)和反應(yīng)級(jí)數(shù),1. 反應(yīng)分子數(shù)：在反應(yīng)中真正相互作用的分子的數(shù)目。 單分子反應(yīng)，雙分子反應(yīng)， 判斷一個(gè)反應(yīng)是單分子反應(yīng)還是雙分子反應(yīng)，應(yīng)先了解反應(yīng)機(jī)制，即反應(yīng)過程中各個(gè)單元反應(yīng)是如何進(jìn)行的。,2. 反應(yīng)級(jí)數(shù)：根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，整個(gè)化學(xué)反應(yīng)的速率服從哪種分子反應(yīng)速率方程式，則這個(gè)反應(yīng)即為幾級(jí)反應(yīng)。 一級(jí)反應(yīng)，二級(jí)反應(yīng)，零級(jí)反應(yīng)。,2006-1-7,上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,（三）各級(jí)反應(yīng)的特征,1. 一級(jí)反應(yīng) 凡是反應(yīng)速率只與反應(yīng)物的濃度的一次方成正比的，這種反應(yīng)就稱為一級(jí)反應(yīng)。 速率常數(shù)與半衰期成反比，半衰期與反應(yīng)物的初濃度無關(guān)。 2. 二級(jí)反應(yīng) 凡是反應(yīng)速率與反應(yīng)物濃度二次方（或兩種物質(zhì)濃度的乘

3、積）成正比的，這種反應(yīng)就稱為二級(jí)反應(yīng)。 半衰期與初濃度成反比。 3. 零級(jí)反應(yīng) 凡是反應(yīng)速率與反應(yīng)物濃度無關(guān)而受它種因素影響而改變的反應(yīng)。 半衰期與初始濃度成正比。,2006-1-7,上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,二、底物濃度對(duì)酶反應(yīng)速率的影響,（一）中間絡(luò)合物學(xué)說,1903年，Henri用蔗糖酶水解蔗糖的實(shí)驗(yàn),在低底物濃度時(shí), 反應(yīng)速度與底物濃度成正比，表現(xiàn)為一級(jí)反應(yīng)特征。 隨著底物濃度的增加, 反應(yīng)速度不再按正比升高，反應(yīng)表現(xiàn)為混合級(jí)反應(yīng)。 當(dāng)?shù)孜餄舛冗_(dá)到一定值，反應(yīng)速度達(dá)到最大值（Vmax），此時(shí)再增加底物濃度，反應(yīng)速度不再增加，表現(xiàn)為零級(jí)反應(yīng)。,2006-1-7,上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,酶與底物

4、的中間絡(luò)合物學(xué)說（Henri和Wurtz）,S+E ES P+E,中間產(chǎn)物假說證據(jù)： （1）ES復(fù)合物已被電子顯微鏡和X射線晶體結(jié)構(gòu)分析直接觀察到。 （2）酶和底物的光譜特性在形成ES后發(fā)生變化。 （3）酶的物理性質(zhì)經(jīng)常在形成ES后發(fā)生變化。 （4）已分離得到ES復(fù)合物。 （5）平衡透析時(shí)，底物濃度在半透膜內(nèi)外不等。,（二）酶促反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)方程式,1.米氏方程式的推導(dǎo),推導(dǎo)原則：從酶被底物飽和的現(xiàn)象出發(fā)，按照 “穩(wěn)態(tài)平衡”假說的設(shè)想進(jìn)行推導(dǎo)。,米氏方程:,米氏常數(shù):,米氏方程的推導(dǎo),令：,將（4）代入（3），則：,ES生成速度：,，ES分解速度：,即：,則：,由于酶促反應(yīng)速度由ES決定，即,將

5、（2）代入（1）得：,(3),當(dāng)酶反應(yīng)體系處于恒態(tài)時(shí)：,當(dāng)Et=ES時(shí)，,酶反應(yīng)速度與底物濃度的關(guān)系曲線,當(dāng)S Km時(shí),當(dāng)SKm時(shí),當(dāng)S=Km時(shí),本條件可準(zhǔn)確測(cè)定酶活力,Km的物理意義,2006-1-7,上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,2.動(dòng)力學(xué)參數(shù)的意義,（1）米氏常數(shù)的意義,a.不同的酶具有不同Km值，它是酶的一個(gè)重要的特征物理常數(shù),只與酶的性質(zhì)有關(guān)，而與其濃度無關(guān)。 b.Km值只是在固定的底物，一定的溫度和pH條件下，一定的緩沖體系中測(cè)定的，不同條件下具有不同的Km值。 c.Km值表示酶與底物之間的親和程度：Km值大表示親和程度小，酶的催化活性低; Km值小表示親和程度大,酶的催化活性高。 （同一

6、種酶有幾種底物就有幾個(gè)Km值，其中Km值最小的底物一般稱為該酶的最適底物或天然底物） 一般情況下，1/Km可以近似地表示酶對(duì)底物的親和力大小， 1/Km愈大，表明親和力愈大。,所以1/Km表示形成ES的趨勢(shì)大小,特例： Km=K2/K1=Ks(在K3K1，K2時(shí)),d. Km與Ks Km不等于Ks。在K3K1、K2時(shí)， Km看作Ks，也只有此時(shí)1/Km 才可以近似表示酶與底物結(jié)合的難易程度。 e. Km與Km 無抑制劑時(shí)，ES的分解速度與形成速度的比值符合米氏方程，為Km; 而有抑制劑時(shí)發(fā)生變化，則不符合米氏方程，為Km 。,2006-1-7,上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,f.Km和米氏方程的實(shí)際應(yīng)用

7、 若已知某個(gè)酶的Km值，可以計(jì)算在某一個(gè)底物濃度時(shí)，反應(yīng)速度相當(dāng)于最大反應(yīng)速度的百分率。 g.Km可以幫助推斷某一反應(yīng)的方向和途徑,2006-1-7,上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,（2）Vmax和k3(kcat)的意義,在一定的酶濃度下，Vmax是一個(gè)常數(shù)，它只與底物的種類及反應(yīng)條件有關(guān)。,當(dāng)S很大時(shí)，Vmax=K3 E,K3代表酶被底物飽和時(shí)每秒鐘每個(gè)酶分子轉(zhuǎn)換底物的分子數(shù)，稱為轉(zhuǎn)換數(shù)（或催化常數(shù)，Kcat）， 表明酶的最大催化效率。,轉(zhuǎn)換數(shù)的倒數(shù)即為催化周期：一個(gè)酶分子每催化一個(gè)底物分子所需的時(shí)間。 乳糖脫氫酶轉(zhuǎn)換數(shù)為1000/秒，則它的催化周期為10-3秒,（3） Kcat/Km 的意義,在生理

8、條件下， S/Km=0.011.0,SKm 時(shí)：,Kcat/Km的上限是K1，即生成ES復(fù)合物的速度(酶促反應(yīng)的速度不會(huì)超過ES的形成速度K1，在水相中不會(huì)超過108109）,衡量酶催化效率的參數(shù)：即其大小可以比較不同酶或同一種酶催化不同底物的催化效率,2006-1-7,上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,只有Kcat/Km可以客觀地比較不同的酶或同一種酶催化不同底物的催化效率,2006-1-7,上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,3.利用作圖法測(cè)定Km和Vmax值,（1）Lineweaver-Burk 雙倒數(shù)作圖法 米氏方程的雙倒數(shù)形式：,基本原則：將米氏方程變化成相當(dāng)于y=ax+b的直線方程，再用作圖法求出Km。,1

9、 Km 1 1 = . + v Vmax S Vmax,2006-1-7,上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,（2） Eadie-Hofstee 作圖法,vv/S作圖法,v,Vmax,-Km,2006-1-7,上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,（3） Hanes-Woolf 作圖法,1 Km 1 1 = . + v Vmax S Vmax,在,兩邊均乘以S：,以 S作圖,-Km,S,（4）Eisenthal 作圖法,（5）Hill 作圖法,（寡聚酶）,2006-1-7,上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,（三）多底物的酶促反應(yīng),1.多底物酶促反應(yīng)按動(dòng)力學(xué)機(jī)制分類,有序反應(yīng),只有Leading substrate (領(lǐng)先底物A)首先與

10、酶結(jié)合，然后B才能與酶結(jié)合，形成的三元復(fù)合物EAB（ternary complex)轉(zhuǎn)變?yōu)镋PQ，B 的產(chǎn)物P先釋放，A的產(chǎn)物Q后釋放。 在缺少A時(shí)，B不能與E結(jié)合,E+A+BAEBPEQE+P+Q,（1）序列反應(yīng),2006-1-7,上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,A與其產(chǎn)物Q相互競(jìng)爭(zhēng)地結(jié)合E，但A和B互不竟?fàn)?反應(yīng)的總方向決定于A、Q的濃度和反應(yīng)的平衡常數(shù),NAD 與NADH相互競(jìng)爭(zhēng)E上的NAD結(jié)合部位,隨機(jī)反應(yīng),底物A、B與酶結(jié)合的順序是隨機(jī)的，形成的三元復(fù)合物AEB QEP，產(chǎn)物P、Q的釋放順序也是隨機(jī)的。,限速步驟是AEB QEP A與Q相互競(jìng)爭(zhēng)E上的底物結(jié)合部位A，B 與P相互競(jìng)爭(zhēng)E上的底物結(jié)

11、合部位B 反應(yīng)的總方向決定于A、B、Q、P的濃度和反應(yīng)的平衡常數(shù),（2）乒乓反應(yīng),底物A先與E結(jié)合成AE二元復(fù)合物，AE PF（修飾酶形式），釋放第一個(gè)產(chǎn)物P，接著底物B與F形成FB，F(xiàn)B EQ，釋放第二個(gè)產(chǎn)物Q。 A與Q 競(jìng)爭(zhēng)自由酶形式E ，B與P競(jìng)爭(zhēng)修飾酶形式F。 整個(gè)反應(yīng)歷程中只有二元復(fù)合物形式，沒有三元復(fù)合物形式。,2.雙底物反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)方程,（1）乒乓機(jī)制的動(dòng)力學(xué)方程,KmA： B達(dá)到飽和濃度時(shí)A的米氏常數(shù) KmA： A的表觀米氏常數(shù) Vmax：AB都達(dá)到飽和濃度時(shí)的最大反應(yīng)速度,2006-1-7,上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,乒乓機(jī)制的動(dòng)力學(xué)曲線是兩組平行直線 表觀米氏常數(shù)KmA（KmB）

12、隨B（ A）濃度的增大而增大 表觀最大反應(yīng)速度Vmax隨B（A）的增大而增大,（2）序列機(jī)制的底物動(dòng)力學(xué)方程,2006-1-7,上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,序列機(jī)制的動(dòng)力學(xué)曲線是兩組相交直線（交于X軸負(fù)側(cè)） 交點(diǎn)在X軸：表觀KmA（KmB）不隨B（A）濃度變化而變化（ KmA= KmA 、 KmB= KmB） 交點(diǎn)在X軸上：表觀KmA（KmB）隨B（A）濃度的增加而減小 交點(diǎn)在X軸下：表觀KmA（KmB）隨B（A）濃度的增加而增大 表觀最大反應(yīng)速度Vmax隨B（A）的增大而增大,2006-1-7,上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,三、酶的抑制作用,變性作用(denaturation)： 抑制作用(inhibit

13、on)：使酶活力下降或喪失但并不引起酶蛋白變性 變性劑沒有選擇性 抑制劑有不同程度的選擇性 研究抑制劑對(duì)酶的作用有重大的意義： （1）藥物作用機(jī)理和抑制劑型藥物的設(shè)計(jì)與開發(fā) （2）了解生物體的代謝途徑，進(jìn)行人為調(diào)控或代謝控制發(fā)酵 （3）通過抑制劑試驗(yàn)研究酶活性中心的構(gòu)象及其化學(xué)功能基團(tuán)，不僅可以設(shè)計(jì)藥物，而且也是酶工程和化學(xué)修飾酶、酶工業(yè)的基礎(chǔ),2006-1-7,上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,（一）抑制程度的兩種表示方法,1、相對(duì)活力,相對(duì)活力分?jǐn)?shù) (殘余活力),相對(duì)活力百分?jǐn)?shù)*100%,2、抑制率,抑制分?jǐn)?shù) （被抑制活力）,抑制百分?jǐn)?shù),2006-1-7,上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,（二）抑制作用的類型,1

14、、不可逆的抑制作用 抑制劑與酶活性中心（外）的必需基團(tuán)共價(jià)結(jié)合，使酶的活性下降，無法用透析、超濾等物理方法除去抑制劑而使酶復(fù)活。,2、可逆的抑制作用 抑制劑與酶蛋白非共價(jià)鍵結(jié)合，可以用透折、超濾等物理方法除去抑制劑而使 酶復(fù)活。,2006-1-7,上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,（1）競(jìng)爭(zhēng)性抑制（Competitive inhibition） 抑制劑具有與底物類似的結(jié)構(gòu)，競(jìng)爭(zhēng)酶的活性中心，并與酶形成可逆的EI復(fù)合物，阻止底物與酶結(jié)合。 可以通過增加底物濃度而解除此種抑制。,2006-1-7,上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,（2）非競(jìng)爭(zhēng)性抑制（noncompetitive inhibition） 底物和抑制劑可以同

15、時(shí)與酶結(jié)合，但是，中間的三元復(fù)合物ESI不能進(jìn)一步分解為產(chǎn)物，因此，酶的活性降低。 抑制劑與酶活性中心以外的基團(tuán)結(jié)合，其結(jié)構(gòu)可能與底物無關(guān)。不能通過增加底物濃度的辦法來消除非競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用。,2006-1-7,上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,（3）反競(jìng)爭(zhēng)性抑制 酶只有在與底物結(jié)合后，才能與抑制劑結(jié)合。 E+SES+I ESI P 常見于多底物的酶促反應(yīng)中,2006-1-7,上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,（三）可逆抑制作用與不可逆抑制作用的鑒別,1、通過透析、超濾、凝膠過濾等 2、通過v-E速度曲線,E,v,1,2,3,(1) 反應(yīng)體系中不加I。,(2) 反應(yīng)體系中加入一定量的不可逆抑制劑。,(3)反應(yīng)體系中加入

16、一定量的可逆抑制劑。,2006-1-7,上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,I 增高,I 增高,3、通過可逆抑制劑的動(dòng)力學(xué)曲線可以區(qū)分三種可逆抑制作用,（四）可逆抑制作用動(dòng)力學(xué),1、競(jìng)爭(zhēng)性抑制,動(dòng)力學(xué)方程：,（Ki為EI的解離常數(shù)）,Vmax不變; Km變大，而且隨I濃度的增大而增大。,相對(duì)活力：,抑制分?jǐn)?shù)：,抑制程度決定于I、S、Km和Ki,2、非競(jìng)爭(zhēng)性抑制,動(dòng)力學(xué)方程：,Km不變，Vmax降至Vmax/（1+I/Ki）,相對(duì)活力：,抑制分?jǐn)?shù)：,抑制程度決定于I和Ki ，與底物的Km和S無關(guān),3、反競(jìng)爭(zhēng)性抑制,動(dòng)力學(xué)方程：,Km及Vmax都變小,相對(duì)活力：,抑制分?jǐn)?shù)：,抑制程度決定于Km、Ki、S、I,2

17、006-1-7,上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,可逆抑制的動(dòng)力學(xué)比較,抑制類型 Vmax變化 Km變化 無抑制劑 / / 競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用 不變 變大 非競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用 變小 不變 反競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用 變小 變小,2006-1-7,上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,（五）一些重要的抑制劑,1、不可逆抑制劑：,（1）非專一性不可逆抑制劑 與酶的活性中心以及活性中心外的某一類或幾類必需基團(tuán)反應(yīng),有機(jī)磷的酰化物 二異丙基磷酰氟（DFP，神經(jīng)毒氣）和許多有機(jī)磷農(nóng)藥。 抑制機(jī)理：與蛋白酶及酯酶活性中心Ser的OH形成磷脂鍵。 毒理：強(qiáng)烈抑制乙酰膽堿脂酶（神經(jīng)毒劑）。 解毒劑：PAM（解磷定）可以把酶上的磷?；鶊F(tuán)除去。,2006-

18、1-7,上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,有機(jī)汞、有機(jī)砷化合物 抑制機(jī)理：使酶的巰基烷化 毒理：主要與還原型硫辛酸輔酶反應(yīng)，抑制丙酮酸氧化酶系統(tǒng)。 解毒劑：二巰基丙醇（BAL）、Cys、GSH等過量的巰基化合物。,2006-1-7,上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,重金屬 Ag、Cu、Hg、Cd、Pb能使大多數(shù)酶失活，EDTA可解除。 、烷化物 含鹵素的烷化物（碘乙酸、碘乙酰胺、鹵乙酰苯等）常用于鑒定酶中巰基。 氰化物、硫化物、CO 與含鐵卟啉的酶中的Fe2+結(jié)合，阻抑細(xì)胞呼吸,2006-1-7,上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,青霉素 不可逆抑制糖肽轉(zhuǎn)肽酶 還原劑 巰基乙醇、二硫蘇糖醇等巰基試劑還原酶的二硫鍵、含活潑雙鍵試劑（

19、與、反應(yīng)） 乙基順丁烯二酰亞胺 親電試劑 四硝基甲烷，可使Tyr硝基化。,2006-1-7,上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,（2） 專一性不可逆抑制劑 此類抑制劑僅僅和某一種酶的活性部位的必需基團(tuán)反應(yīng)。,Ks型不可逆抑制劑（親和標(biāo)記試劑，親和修飾試劑） 具有與底物相似的結(jié)構(gòu)，同時(shí)還帶有一個(gè)能與酶活性中心或活性中心外的必需基團(tuán)進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)的活潑基團(tuán)。 專一性程度取決于它與活性中心及活性中心外的的Ks之比。 胰乳蛋白酶的最佳底物：對(duì)-甲苯磺酰-L-苯丙氨酸甲酯 Ks型不可逆抑制劑：對(duì)甲苯磺酰-L-苯丙氨酰氯甲烷（TPCK） -CH2-Cl與酶活性部位的一個(gè)His-咪唑基距離很近，很易使之烷基化。,2006-

20、1-7,上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, Kcat型不可逆抑制劑（自殺性底物） 具有與底物相似的結(jié)構(gòu)，不僅能與酶結(jié)合，而且潛伏的反應(yīng)基團(tuán)（latent reactive group）能被酶催化而活化，并與酶活性中心必需基團(tuán)進(jìn)行不可逆結(jié)合。,2006-1-7,上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,2、可逆抑制劑,競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑 許多代謝類似物都是競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，可用作抗菌藥和抗癌藥物。 磺胺類藥物及其作用機(jī)理 對(duì)氨基苯磺酰胺或其衍生物 對(duì)氨基苯甲酸的結(jié)構(gòu)類似物，競(jìng)爭(zhēng)性抑制細(xì)菌的二氫葉酸合成酶活性,2006-1-7,上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,抑制劑與藥物開發(fā) Kcat型不可逆抑制劑的專一性程度很強(qiáng)，前景廣闊 底物類似物型的競(jìng)爭(zhēng)性抑

21、制劑最易開發(fā) 過度態(tài)底物類似物型藥物最具價(jià)值(高效特異),2006-1-7,上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,四、溫度對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響,（一）最適溫度及影響因素 溫度對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響有兩個(gè)方面： 提高溫度，加快反應(yīng)速度。 提高溫度，酶變性失活。 溫度系數(shù)Q10：溫度升高10，反應(yīng)速度與原來的反應(yīng)速度之比，大多數(shù)酶的Q10一般為12。 溫血?jiǎng)游锏拿福钸m溫度3540，植物酶最適溫度4050，細(xì)菌Taq DNA聚合酶70。 最適溫度不是酶的特征常數(shù)，它與底物種類、作用時(shí)間、pH、離子強(qiáng)度 等因素有關(guān)。,2006-1-7,上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,（二）酶的穩(wěn)定性溫度 在某一時(shí)間范圍內(nèi)，酶活性不降低的最高溫度稱該酶的穩(wěn)定性溫度。