《原位雜交技術(shù)》PPT課件.ppt

1、原 位 雜 交 技 術(shù),2012-12-06,原 位 雜 交 技 術(shù),一、原位雜交技術(shù)的歷史發(fā)展,原位雜交技術(shù)(In situ hybridization，ISH)是分子生物學(xué)、組織化學(xué)及細(xì)胞學(xué)相結(jié)合而產(chǎn)生的一門新興技術(shù)，始于20世紀(jì)60年代。1969年美國(guó)耶魯大學(xué)的Gall等首先用爪蟾核糖體基因探針與其卵母細(xì)胞雜交，將該基因進(jìn)行定位，與此同時(shí) BuongiornoNardelli和Amaldi等(1970)相繼利用同位素標(biāo)記核酸探針進(jìn)行了細(xì)胞或組織的基因定位，從而創(chuàng)造了原位雜交技術(shù)。自此以后，由于分子生物學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展，特別是20世紀(jì)70年代末到80年代初，分子克隆、質(zhì)粒和噬菌體DNA的構(gòu)

2、建成功，為原位雜交技術(shù)的發(fā)展奠定了深厚的技術(shù)基礎(chǔ)。,二、原位雜交技術(shù)的原理及分類,概念： 原位雜交技術(shù)(In situ hybridization，ISH)是用標(biāo)記的核酸探針，經(jīng)放射自顯影或非放射檢測(cè)體系，在組織，細(xì)胞、間期核及染色體上對(duì)核酸進(jìn)行定位和相對(duì)定量研究的一種手段。 原理：利用核酸分子單鏈之間有互補(bǔ)的堿基序列，將有放射性或非放射性的外源核酸(即 探針)與組織、細(xì)胞或染色體上待測(cè) DNA或 RNA互補(bǔ)配對(duì)，結(jié)合成專一 的核酸雜交分子，經(jīng)一定的檢測(cè)手段 將待測(cè)核酸在組織、細(xì)胞或染色體上 的位置顯示出來(lái)。,分類,1、 基因組原位雜交技術(shù) 基因組原位雜交(GISH)技術(shù)是20世紀(jì)80年代末發(fā)

3、展起來(lái)的一種原位雜交技術(shù)。它主要是利用物種之間DNA同源性的差異，用另一物種的基因組DNA以適當(dāng)?shù)臐舛茸鞣庾瑁诎腥旧w上進(jìn)行原位雜交。 2、熒光原位雜交技術(shù) 熒光原位雜交(FISH)技術(shù)是在已有的放射性 原位雜交技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種非放 射性DNA分子原位雜交技術(shù)。它利用熒光標(biāo)記 的核酸片段為探針，與染色體上或DNA顯微切 片上的特異fl-N：行雜交，通過熒光檢測(cè)系 統(tǒng)(熒光顯微鏡)檢測(cè)信號(hào)DNA序列在染色體或 DNA顯微切片上的目的DNA序列，進(jìn)而確定其雜 交位點(diǎn)。,3 、多彩色熒光原位雜交技術(shù) 多彩色熒光原位雜交(mFISH)是在熒 光原位雜交技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的 一種新技術(shù)，它

4、用幾種不同顏色的熒 光素單獨(dú)或混合標(biāo)記的探針進(jìn)行原位 雜交，能同時(shí)檢測(cè)多個(gè)靶位，各靶位 在熒光顯微鏡下和照片上的顏色不同， 呈現(xiàn)多種色彩。 4、原位PCR 原位PCR技術(shù)是常規(guī)的原位雜交技術(shù)與PCR技術(shù)的有機(jī)結(jié)合，即通過PCR技術(shù)對(duì)靶核酸序列在染色體上或組織細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行原位擴(kuò)增使其拷貝數(shù)增加，然后通過原位雜交技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，從而對(duì)靶核酸序列進(jìn)行定性、定位和定量分析。,三、原位雜交技術(shù)的一般過程,以經(jīng)過標(biāo)記的已知核酸分子為探針 以細(xì)胞內(nèi)與探針序列互補(bǔ)的特異核酸分子為靶分子 在一定條件下使探針與靶核酸分子在原位發(fā)生雜交 再對(duì)其探測(cè),雜交,檢測(cè),一）、探針,是含有互補(bǔ)順序的外源性被標(biāo)記的DNA或RNA片

5、段，是在原位雜交中用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)特定DNA或RNA順序定位的特殊試劑，探針的堿基序列是已知的，只能與特定的核酸分子結(jié)合上,1、cDNA 2、RNA 3、寡核苷酸,1、cDNA (complementary DNA),互補(bǔ)于mRNA的DNA分子 （長(zhǎng)度為數(shù)百-數(shù)千堿基對(duì)）, 克隆于質(zhì)粒中，可以無(wú)限繁殖，取之不盡 較穩(wěn)定，不易被降解 標(biāo)記方法可靠易行,優(yōu)點(diǎn),優(yōu)點(diǎn)： 雜交效率比DNA探針高 在檢測(cè)mRNA時(shí)所形成的RNA-mRNA雜交體 比DNA-mRNA雜交體穩(wěn)定 可以同時(shí)得到同義RNA鏈和反義RNA鏈 缺點(diǎn)：,2、RNA,RNA是單鏈分子 （探針長(zhǎng)度50-300堿基對(duì)）,容易受RNA酶的污染而被

6、降解,這類探針是根據(jù)靶分子而設(shè)計(jì)序列 在DNA合成儀上用化學(xué)方法合成 優(yōu)點(diǎn)：形成雜交體快速 （序列短鏈，雜交時(shí)易于穿透） 缺點(diǎn)：特異性較低（短鏈和簡(jiǎn)單）,短鏈探針 (長(zhǎng)度10-50個(gè)核苷酸),3、寡核苷酸,二）、探針標(biāo)記,1、標(biāo)記物 （1）放射性標(biāo)記物 （2）非放射性標(biāo)記物 2、標(biāo)記方法 （1）DNA探針標(biāo)記 （2）RNA探針標(biāo)記 （3）寡核苷酸探針標(biāo)記,1、標(biāo)記物,高度靈敏性； 標(biāo)記物與核酸探針結(jié)合，應(yīng)絕對(duì)不能影響核酸探針與模板的結(jié)合能力及結(jié)合的特異性； 當(dāng)用酶促方法進(jìn)行標(biāo)記時(shí)，應(yīng)對(duì)酶促活性（Km值）無(wú)多大影響，以保證標(biāo)記反應(yīng)的效率和標(biāo)記產(chǎn)物的比活性； 高度特異性； 較高的化學(xué)穩(wěn)定性，保存時(shí)

7、間長(zhǎng)，標(biāo)記及檢測(cè)方法簡(jiǎn)單； 對(duì)環(huán)境無(wú)污染，對(duì)人體無(wú)損傷； 價(jià)格低廉等。,放射性標(biāo)記物：同位素 35S、33P、32P 和 3H等 非放射性標(biāo)記物：熒光素 生物素 地高辛 溴脫氧尿嘧啶等 標(biāo)記分子：某種單核苷酸 在單核苷酸分子中導(dǎo)入某個(gè)原子、 功能基團(tuán)或側(cè)鏈分子作為標(biāo)記物， 對(duì)堿基配對(duì)不造成影響,標(biāo)記分子： 放射性標(biāo)記分子： 35S-UTP 35S-dATP 35S-dCTP 32P-UTP 32P-dATP等等 非放射性標(biāo)記分子： 四甲基羅達(dá)明-UTP 生物素-UTP (Bio-UTP) 地高辛-dUTP (Dig-dUTP) 溴脫氧尿嘧啶本身為標(biāo)記分子,2、標(biāo)記方法,（1）DNA探針標(biāo)記 切

8、口移位法 隨機(jī)引物法 （2）RNA探針標(biāo)記 在體外轉(zhuǎn)錄技術(shù)中與探針制備同時(shí)完成 （3）寡核苷酸探針標(biāo)記 末端轉(zhuǎn)移法,將放射性或非放射性的標(biāo)記分子 在各種酶促反應(yīng)中參入探針分子,切口平移法,隨機(jī)引物法,三）、靶核酸分子,靶分子（或靶序列）： 指所要探測(cè)的核酸分子或核苷酸序列 （DNA 或RNA） DNA 可以是中期染色體上的或是間期細(xì) 胞核內(nèi)的，也可以是線粒體DNA或 病毒DNA RNA 可以是編碼細(xì)胞合成的任何蛋白質(zhì)分子 的mRNA，也可以是核糖體rRNA 線粒體或病毒RNA,四）、雜交,1.雜交體 2.雜交條件 3.嚴(yán)格度的概念,1、雜交體 hybrids,DNA-DNA DNA-RNA R

9、NA-RNA 穩(wěn)定性依次是： DNA-DNA DNA-RNARNA-RNA,2、雜交條件,（1）雜交液 （2）探針濃度（3）溫度（4）pH （5）時(shí)間 （1）、雜交液 鈉鹽（雜交效率 非特異反應(yīng)） 甲酰胺（使雜交所需溫度降低） 硫酸葡聚糖（提高探針濃度） 牛血清白蛋白和載體DNA等 （阻斷探針與組織非特異結(jié)合， 背景）,雜交條件,（2）、探針濃度 探針濃度影響雜交反應(yīng)的速度 放射性標(biāo)記探針0.5g/ml 非放射性為2g/ml 最適宜的探針濃度要經(jīng)實(shí)驗(yàn)摸索得到確定,（1）雜交液 （2）探針濃度（3）溫度（4）pH （5）時(shí)間,雜交條件,（3）、溫度 雜交時(shí)溫度一般低于相應(yīng)雜交體的Tm值25 Tm

10、值：是核酸的融解溫度，是一半雙鏈分子解鏈時(shí)的溫度） 當(dāng)雜交液含50%甲酰胺、鹽濃度0.75mol/L左右時(shí) 雜交溫度： 對(duì)DNA探針是42 對(duì)RNA探針是50-55 對(duì)寡核苷酸探針是37,1）雜交液 （2）探針濃度（3）溫度（4）pH （5）時(shí)間,雜交條件,（4）、PH pH在5-9范圍內(nèi)，雜交體形成不受影響 常用緩沖液pH為6.5-7.5 （5）、時(shí)間 一般探針濃度下，雜交反應(yīng)在4-6小時(shí)內(nèi)完成 孵育6小時(shí)后 - 雜交信號(hào)不再增強(qiáng) 反應(yīng)超過24小時(shí)后 - 已形成的雜交體可能發(fā)生解 鏈，雜交信號(hào)反而減弱,（1）雜交液 （2）探針濃度（3）溫度（4）pH （5）時(shí)間,3、嚴(yán)格度,在某些條件下，探

11、針可以與含不相配堿基的核 酸序列結(jié)合而形成不穩(wěn)定的雜交體 高嚴(yán)格度條件下 堿基完全互補(bǔ)的雙鏈可形成雜交體 低嚴(yán)格度條件下 堿基對(duì)不完全互補(bǔ)的雙鏈也能形成雜交體,嚴(yán)格度（stringency） 決定探針是否與含不相配堿基的 核酸序列結(jié)合的條件稱為嚴(yán)格度,五）、雜交體的探測(cè),使標(biāo)記的雜交體在光鏡或電鏡下可見 （一） 放射自顯影方法 （二） 免疫細(xì)胞化學(xué)方法,（一）、放射自顯影方法,方法： 切片上涂覆核子乳膠膜 置于暗盒中于4干燥處自顯影 經(jīng)顯影和定影后在顯微鏡下觀察銀粒 在細(xì)胞和細(xì)胞器的分布情況,用同位素標(biāo)記探針來(lái)顯示雜交反應(yīng)的方法,（二）、免疫細(xì)胞化學(xué)方法,報(bào)告分子（ reportermolecules） 在雜交后探測(cè)技術(shù)中，為顯 示探針標(biāo)記物而使用的免疫細(xì)胞 化學(xué)標(biāo)記物常被叫做報(bào)告分子 即與抗體（或親和素、 A蛋白、）聯(lián)結(jié)，最終在 顯微鏡下可見的分子： 熒光素 膠體金 酶-過氧化物酶-H2O2和DAB 堿性磷酸酶-NBT/BCIP 用地高辛標(biāo)記的探針用熒光素、膠體金、酶標(biāo)記抗地高辛抗體來(lái)顯示,依據(jù)免疫細(xì)胞化學(xué)