細胞培養(yǎng)的基本方法

1、細胞培養(yǎng)的基本方法,細胞培養(yǎng)的污染和檢測,細胞培養(yǎng)中常用的染色方法,培養(yǎng)細胞的觀察,A,C,B,目錄,培養(yǎng)細胞的觀察,無論是研究體外細胞的增殖生長狀態(tài)還是生物學性狀，都需要對其進行觀察和檢測，其內容涉及形態(tài)生物學、細胞生物學、遺傳學、生理生化、分子生物學等多學科的技術手段。這里主要介紹觀察檢測體外培養(yǎng)物最常用的技術方法。,相差顯微鏡,相差顯微鏡是荷蘭科學家Zernike于1935年發(fā)明的，用于觀察未染色標本的顯微鏡?；罴毎臀慈旧纳飿吮?，因細胞各部細微結構的折射率和厚度的不同，光波通過時，波長和振幅并不發(fā)生變化，僅相位發(fā)生變化（x相位差），這種相位差人眼無法觀察。而相差顯微鏡通過改變這種相

2、位差，并利用光的衍射和干涉現(xiàn)象，把相差變?yōu)檎穹顏碛^察活細胞和未染色的標本。相差顯微鏡和普通顯微鏡的區(qū)別是：用環(huán)狀光闌代替可變光闌， 用帶相板的物鏡代替普通物鏡，并帶有一個合軸用的望遠鏡。,一、相差顯微鏡觀察：能增強結構之間的反差,1、主要裝置 （1）環(huán)裝光柵 不同倍數的相差物鏡要用相應的環(huán)狀光闌 （2）相板 相差板上上裝有吸收膜及推遲相位的相位膜 （3）中心望遠鏡 輔助望遠鏡,培養(yǎng)細胞的觀察,培養(yǎng)細胞的觀察,2、觀察活細胞的方法 將相差裝置與倒置光裝置結合起來而制造的倒置相差顯微鏡廣泛用于觀察生長在瓶皿底面的細胞。,培養(yǎng)細胞的觀察,3、相差物鏡的選擇與使用 正（暗,即標本比周圍環(huán)境暗）反差適

3、用于物體細微結構和形態(tài)、計數、運動的觀察。PL（低亮，視場平坦型物鏡）相差物鏡常用于折射率比較弱的物體，PLL（低低亮，長工作距離平場物鏡）則適用于折射強的物體。 負（明，即標本比周圍環(huán)境亮）反差適用于物體形態(tài)、計數和物體運動的觀察，物體折射率比較弱是采用NM（中負）相差物鏡，折射率比較強時采用NH（高負）相差物鏡。,培養(yǎng)細胞的觀察,4、相差顯微鏡使用注意事項 1）當換不同倍率的物鏡時，要選用一致的相板和相環(huán)，并重新調中，否則成像效果不佳； 2）載物片或培養(yǎng)瓶的表面要平整、均勻、干凈，標本不能太厚，以免影響觀測效果； 3）標本要在有水的環(huán)境中（如培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)液、水封片等）成像效果才明顯；4）光

4、路最好加單色（如黃綠色）濾光片以提高相差顯微鏡的分辨率。,培養(yǎng)細胞的觀察,二、細胞計數法 1、細胞計數法是利用血細胞計數板計數細胞懸液中的細胞數 目，以測定細胞增殖和調整細胞濃度的一種方法。 2、細胞生長曲線是觀察細胞在一代生存期內的增生過程的重要指標。只有具備自身穩(wěn)定生長特性的細胞才適合在觀察細胞生長變化的實驗中應用。,培養(yǎng)細胞的觀察,3、細胞分裂指數是指分裂期細胞在全部細胞中所占的百分率，用以表示細胞的增殖旺盛程度。一般取1000個細胞中的細胞分裂相數。 4、細胞貼壁率又稱接種存活率，用于觀察貼壁附著生長細胞，主要反映細胞的生存能力（只有活細胞才貼壁）和部分底物材料的生物相容性。,培養(yǎng)細胞

5、的觀察,5、細胞周期 這里的細胞周期僅指一個細胞的分裂生長周期 時間，而不是指細胞群體倍增時間?？衫门囵B(yǎng)細 胞來研究細胞動力學、DNA合成代謝和有絲分裂。 細胞周期的時間測定有兩種方法。 （1）同位素標記測定法 （2）流式細胞儀測定法 6、MTT(二甲基噻唑二苯基四唑溴鹽）比色法測定 細胞活力。,細胞培養(yǎng)中常用的染色方法-活體染色,一、活體染色 體外活體染色就是在體外條件下用某種活體染料對活的組織或細胞進行染色，而不影響活細胞的生命活動的一種方法。 1、活體染料的類別 可分為堿性和酸性活體染料兩大類。 堿性：噻嗪類（次甲基藍、甲苯膠藍），亞噴類（亮焦 油藍、亮焦油紫），吖嗪類（中性紅、詹納斯

6、綠），三酚苯甲烷類（甲基紫、維克多利亞藍）。 酸性：臺盼藍、剛果紅、吡咯藍。 體外活體染色一般用堿性活體染料，酸性活體染料只用于體內活體染色。,細胞培養(yǎng)中常用的染色方法-活體染色,2、活體染色方法 （1）臺盼藍染色 1）用Hanks液（最常用的無機鹽溶液和平衡鹽溶液，主要用于洗滌細胞和組織的，也是合成培養(yǎng)基的基礎液。如果含有鈣鎂離子的話，當用消化液消化細胞時，鈣鎂離子會破壞消化液的活力。）配制0.1%臺盼藍溶液； 2）用0.5%的胰蛋白酶：0.2%EDTA=1:1混合液消化培養(yǎng)的貼壁細胞； 3）加入適量Hanks液制成細胞懸液； 4）每毫升細胞懸液加入10l0.1%臺盼藍溶液，混勻； 5）用毛

7、細吸管吸少許混合液置細胞計數板，并在顯微鏡下計數； 6）計數1000個細胞中的活細胞（折光性強且不著色）和死細胞（染上藍色）數目。,細胞培養(yǎng)中常用的染色方法-活體染色,細胞培養(yǎng)中常用的染色方法-活體染色,（2）吖啶橙熒光染色法 吖啶橙用于直接染色觀察活細胞或固定染色觀察細胞。與DNA結合呈亮綠色，與RNA結合呈橘紅色至火紅色。,細胞培養(yǎng)中常用的染色方法-活體染色,吖啶橙/溴化乙錠雙熒光染色,細胞培養(yǎng)中常用的染色方法-染料排除檢測法,二、染料排除檢測法 由于死細胞的細胞膜通透性發(fā)生改變，某些染料可大量進入卻不被排出，因而細胞顯示一定顏色。而活細胞由于能排出進入細胞的染料，故不易著色。 1、臺盼藍

8、排除檢測法,細胞培養(yǎng)中常用的染色方法-染料排除檢測法,2、溴化乙錠和碘化丙錠排除檢測法 EB和PI均為熒光染料，可與DNA特異性結合。,細胞培養(yǎng)的污染與檢測,在細胞培養(yǎng)中，凡是與培養(yǎng)無關的雜質的混入培養(yǎng)系統(tǒng)稱為污染。對于組織細胞培養(yǎng)工作來說，污染是時常存在的，因此要努力避免污染的發(fā)生。污染一般包括微生物、化學物、細胞等，其中微生物污染較多。以下著重介紹微生物的污染、預防與檢測。,細胞培養(yǎng)的污染與檢測-污染途徑,一、污染途徑 1、空氣 空氣是微生物及粉塵顆粒傳播的最主要途徑。 2、器材 各種培養(yǎng)皿及器械消毒不徹底和洗刷不干凈導致污染。 3、操作 無菌操作觀念不強、實驗操作馬虎、動作不準確、使用污

9、染的器具或密封不嚴等，都可能造成污染。同時培養(yǎng)兩種以上細胞，操作不規(guī)范，交叉使用吸管或者營養(yǎng)液瓶等會導致細胞交叉感染。,細胞培養(yǎng)的污染與檢測-污染途徑,4、血清 有的市售血清制備水平低、檢測不嚴，常被支原體和病毒污染。 5、組織樣本 初代組織常有污染，有的在手術中污染，有的本身可能是被污染的組織（如已發(fā)生潰爛的腫瘤組織）。手術用碘酒消毒后，擦拭不凈從而出現(xiàn)碘污染。,細胞培養(yǎng)的污染與檢測,二、污染對培養(yǎng)細胞的影響與檢測 體外培養(yǎng)的細胞自身沒有抵抗污染的能力，而且培養(yǎng)基中加入抗生素的抗污染能力也很有限，因而培養(yǎng)細胞一旦發(fā)生污染多數將無法挽回。一般在細胞受到有害污染的早期或污染較輕時，如果能及時處理

10、并去除污染物，部分細胞有可能恢復，所以對培養(yǎng)細胞的污染與檢測極其重要。,細胞培養(yǎng)的污染與檢測,1、細菌污染及檢測 細菌是一種原核生物，其大小以微米計。常見的污 染菌有革蘭式陰性菌（其中白色葡萄菌等比較常見）和 E.coli、假單胞菌等。細菌污染初期不易判斷。有懷疑時 可取細胞懸液離心沉淀后加入無抗生素的培養(yǎng)液中培養(yǎng) 觀察24h，看是否為陽性（受到污染）結果。 多數情況下受到細菌污染后培養(yǎng)液短期內顏色變黃，產大 量酸性物質，出現(xiàn)明顯渾濁。還可用倒置顯微鏡觀察，現(xiàn)象明 顯。 青霉素、鏈霉素預防細菌污染有效。,細胞培養(yǎng)的污染與檢測,2、真菌的污染與檢測 在微生物污染中，以真菌的污染最多，常見的有煙

11、曲霉、黑曲霉、毛霉菌、孢子霉、白念珠菌、酵母菌。 真菌污染后易發(fā)現(xiàn)，大多呈白色或淺黃色小點漂浮 于培養(yǎng)液表面，肉眼可見，還可用倒置顯微鏡觀察散在 生長在培養(yǎng)液中的真菌。 瓶外的污染物要及時用酒精棉球擦洗干凈，以防其 通過瓶口傳入瓶內。 抗真菌劑對預防和排除真菌污染有效。,細胞培養(yǎng)的污染與檢測,3、支原體污染與檢測 支原體是一種介于細菌和病毒之間、能獨立生活的最小微生物，最小的直徑0.2微米，約有1%可通過濾菌器，無細胞壁，形態(tài)呈多形性，可為圓形、絲狀或梨形。 目前常用檢測方法有相差顯微鏡檢測法、DNA熒光處理法、電鏡檢測法、低張?zhí)幚淼匾录t染色觀察、免疫學法、 -胸腺嘧啶滲入、支原體培養(yǎng)法及PC

12、R法等。,細胞培養(yǎng)的污染與檢測,4、病毒的污染與檢測 病毒是一種能通過細菌濾器，大小以納米計，不能 單獨利用外界營養(yǎng)物質進行自體繁殖的微生物。病毒進 入細胞后會進行裝配形成新的病毒，或將遺傳物質整合 到宿主DNA上，從而影響到細胞的生長或干擾實現(xiàn)結果 的準確性。對病毒進行檢測主要有細胞直接觀察法、動 物接種檢查法、電子顯微鏡檢查法、免疫學及PCR法等。,細胞培養(yǎng)的污染與檢測,5、細胞交叉污染檢測 細胞間交叉污染是由于在培養(yǎng)操作過程中各種細胞同時進 行培養(yǎng)，而所有器具或液體混雜使用所致。這種污染有的變化 輕微不易察覺，有的可能因污染細胞具有生長優(yōu)勢而使原培養(yǎng) 細胞生長受到抑制，最終死亡。常用觀察

13、細胞形態(tài)、檢查細胞 的標記物等方法檢查交叉污染的細胞。 為有效防止交叉污染，應該做到： 1）器具嚴格區(qū)分，做好標記； 2）換液或傳代操作時，注射器和滴管不要觸及培養(yǎng)液瓶瓶口。 3）從別處轉來的細胞或自己建立的細胞系都要早期留有充足的凍存儲備。,細胞培養(yǎng)的污染與檢測-污染的預防,三、污染的預防 1、培養(yǎng)操作前的準備 1）定期清洗或更換超凈工作臺的空氣濾網，定期檢查超凈工作臺的空氣凈化標準； 2）檢查培養(yǎng)皿是否有消毒標志； 3）檢查新配置的培養(yǎng)液，取樣檢菌一周后確認無菌方可使用； 4）操作前提前30min啟動超凈工作臺及其紫外消毒燈； 5）操作者應清洗雙手，如有呼吸道感染應戴口罩。,細胞培養(yǎng)的污染

14、與檢測-污染的預防,2、培養(yǎng)操作時注意事項 1）工作臺上的所有培養(yǎng)瓶瓶口不能與工作臺上的風向相逆，不能用手碰器皿無菌部分； 2）在安裝吸管帽、開啟或封閉瓶口時要經火焰灼燒，并在火焰附近進行； 3）吸取培養(yǎng)液、細胞懸液時，應專管專用； 4）使用培養(yǎng)液前不宜過早開瓶，開瓶后培養(yǎng)液保持斜立，培養(yǎng)的細胞在處理之前勿過早的暴露于空氣中； 5）操作時不要交談咳嗽以防止唾沫和呼出的氣流所造成的污染； 6）操作完后應整理好工作臺面，用消毒劑抹拭工作面，關閉超凈工作臺。,細胞培養(yǎng)的污染與檢測-污染的預防,3、其他注意事項 1）及早凍存有價值的培養(yǎng)物，重要細胞系（株）的傳代工 作應由兩人獨立完成； 2）購入未滅活

15、血清應于56水浴滅活30min，以使血清中 的補體和支原體滅活； 3）避免誘導抗藥細菌，應定期更換培養(yǎng)系統(tǒng)中的抗生素， 或盡可能不用抗生素； 4）對新引進的細胞株應加強觀察，防止外來污染源； 5)定期用消毒劑清潔二氧化碳培養(yǎng)箱。,細胞培養(yǎng)的污染與檢測-污染排除,四、污染排除 培養(yǎng)細胞的污染一旦確定，多數將無法救治。如果污染的細胞不具備重要價值則盡快棄之，防止造成更大的污染，只有那些必須保留的貴重細胞和單抗細胞等，才有必要進行污染排除。防止關鍵在于嚴格無菌操作。,細胞培養(yǎng)的污染與檢測-污染排除,1、抗生素的應用 平時抗生素主要用來殺滅微生物，而細胞培養(yǎng)工作采用抗生素多為預防污染。常用多鐘抗生素聯(lián)

16、合應用，用于預防比污染后使用好。使用多了容易使微生物產生抗藥性，因此盡量少用。但對于一些有價值的細胞，仍需用抗生素挽救。部分抗生素參考用量和效果如下表：,細胞培養(yǎng)的污染與檢測-污染排除,2、加溫處理 根據支原體對熱耐性差的特點，有人把受污染的細胞置41中總1510h，最長可達18h，以殺滅支原體。 41對培養(yǎng)的細胞本身也有很大影響，所以一般都要進行預實驗，確定對培養(yǎng)細胞的影響降到最小的同時最大限度的殺傷支原體的處理時間。,細胞培養(yǎng)的污染與檢測-污染排除,3、動物體內接種除菌法 此方法適用于在連續(xù)傳代培養(yǎng)中的腫瘤細胞和雜交瘤細胞中，清除細菌和支原體污染的方法。 把支原體污染的腫瘤細胞接種在同種動物皮下或腹腔中，借助其免疫系統(tǒng)消滅支原體，待腫瘤細胞在體內生長一段時間后取出細胞再進行培養(yǎng)繁殖。,細胞培養(yǎng)的污染與檢測-污染排除,4、巨噬細胞吞噬法 從動物腹腔采取巨噬細胞，為排除其他細胞成分，