實(shí)驗(yàn)十二 血清肌酸激酶測定與應(yīng)用ppt課件

1、實(shí)驗(yàn)十二 血清肌酸激酶測定與應(yīng)用,1,1 實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 了解血清肌酸磷酸激酶測定的方法。 掌握其測定的應(yīng)用與意義。,2,2 實(shí)驗(yàn)原理,肌酸激酶（Creatine phosphokinase，簡稱CK）廣泛存在于骨骼肌、心肌和腦組織中，肝臟和紅細(xì)胞等不含此酶。骨骼肌中含量最豐富，占全身總量的96%之多。 肌酸磷酸激酶在肌肉收縮中很重要，它催化下列反應(yīng)：,3,上述反應(yīng)保證肌肉收縮時的能量供應(yīng)和運(yùn)動后ATP和肌酸磷酸的再合成。正常人血清中肌酸磷酸激酶主要由骨骼肌和心肌細(xì)胞透過細(xì)胞膜進(jìn)入血液的結(jié)果，其活力很小。正常值每升血液中100活力單位以下。 運(yùn)動訓(xùn)練能使血清肌酸酸磷酸活性升高。其原因一般認(rèn)為運(yùn)動時

2、缺氧, 代謝產(chǎn)物積累，供能相對不足等原因，引起肌細(xì)胞膜通透性升高。或肌細(xì)胞膜受到損傷，促使CK從細(xì)胞內(nèi)釋放增加，進(jìn)入血液循環(huán)，其中以肌肉牽拉的機(jī)械性損傷或產(chǎn)生血腫等原因最為重要。,4,滑雪運(yùn)動和馬拉松賽跑后，血清CK的活性較高，特別是大強(qiáng)度的馬拉松賽跑最高。在運(yùn)動后4小時升高，8-16小時達(dá)最高值。跳躍、短跑等短時間激烈運(yùn)動，沖擊性運(yùn)動，也易引起CK活性升高。大運(yùn)動量的訓(xùn)練和100m、200m跑比賽后，血清中CK活性都顯著升高，尤其是在比賽時，升高更為顯著。 應(yīng)用肌酸磷酸激酶來作機(jī)能評定時，一般認(rèn)為2-3天取血測定一次, 在負(fù)荷后經(jīng)常處于100-200國際活力單位/L。如果超過200IU/L，

3、就是運(yùn)動量過大，身體尚未恢復(fù)，此時應(yīng)調(diào)整運(yùn)動量。,5,3 實(shí)驗(yàn)器材與試劑 器材, 器材 試管、分光光度計(jì)、分析天平、采血裝置（注射器）、水浴箱、離心機(jī),6, 試劑, 試劑 混合底物 pH 7.4 三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液：稱取三羥甲基氨基甲烷（Tris）2.4g，加蒸餾水至100 ml，再加入0.2 N鹽酸88.8 ml及無水硫酸鎂0.34g，調(diào)節(jié)pH至7.4。此液在室溫下可保存數(shù)月。 0.012 M磷酸肌酸溶液：稱取磷酸肌酸鈉（C4H8O5-O4PNa36H2O）436 mg，加蒸餾水至100 ml，調(diào)節(jié)PH至7.4，保存于-25或普通冰箱上層冰盒中，可用一個月左右。 0.001 M A

4、DP溶液：稱取ADP鈉鹽0.233g，加蒸餾水至100 ml，調(diào)節(jié)PH至7.4，保存于-25或冰箱上層冰盒中，可用一個月左右。,7,臨用前，取上述（1）（2）（3）試劑各10 ml混合。 在此混合底物液30 ml中，加入鹽酸半胱氨酸0.105g，調(diào)節(jié)PH至7.4。此試劑最好新鮮配制，也可以保存于冰盒中。一般可放5-7天，若空白管光密度太高，說明有游離肌酸產(chǎn)生，即不能再用。 0.3 N 氫氧化鋇溶液 稱取氫氧化鋇（Ba(OH)28H2O）4.73g，加蒸餾水使之溶解（可加熱助溶），并稀釋到100 ml。 5% 硫酸鋅溶液 稱取硫酸鋅（ZnSO47H2O）8.82g，加蒸餾水溶解，并稀釋到100

5、ml。 上述2、3兩種溶液配好后，需進(jìn)行滴定，即吸取5%硫酸鋅溶液5 ml，放入50 ml三角燒瓶中，加入酚酞指示劑2滴，用0.3 N Ba(OH)2溶液滴定至出現(xiàn)粉紅色30秒鐘不褪色為止。 Ba(OH)2用量與ZnSO4相等，如不相等，可稀釋較濃的溶液。,8,標(biāo)準(zhǔn)肌酸溶液（1.7M/ml） 準(zhǔn)確稱取無水肌酸22.3mg，置于100ml容量瓶中，加蒸餾水使之溶解，并稀釋到刻度，置冰箱中保存，可用數(shù)日。 雙乙酰液 先配成1%溶液，置棕色瓶中放冰箱保存。臨用時用蒸餾水稀釋20倍。 貯存堿溶液 稱取30g NaOH，無水碳酸鈉（Na2CO3）64g，加蒸餾水使溶解并稀釋至500 ml，室溫低時可析出

6、沉淀，此時應(yīng)放于37水浴中待沉淀溶解后再使用。 -萘酚溶液 稱取-萘酚1g，用上述貯存堿液使溶解，并稀釋到100 ml，此液必須新鮮配制，否則空白管光密度讀數(shù)增高。,9,4 實(shí)驗(yàn)方法與步驟肌酸磷酸激酶顯色法,肌酸磷酸激酶顯色法。 測定CK活性原理：利用上述反應(yīng)所生成的肌酸與-萘酚和雙乙酸反應(yīng)，生成紅色化合物。在一定范圍內(nèi)，紅色深淺與肌酸含量成正比，與同樣處理的肌酸標(biāo)準(zhǔn)液比色，求得酶的活力。,10,測定操作步驟（如下表3-14）： 表3-14 單位： ml,11,12,計(jì)算：,13, 肌酸磷酸激酶檢測試劑盒法：, 原理 ATP+葡萄糖 葡萄糖-6-磷酸+ADP 為作用酶 葡萄糖-6-磷酸+NAD

7、P+ 6-磷酸-葡萄糖+NADPH+H+ 為作用酶,14, 器材與試劑：試管、可見光分光光度計(jì)、電子分析天平、采血裝置（注射器）、水浴鍋、離心機(jī)、試劑盒測定法。 如：采用中生北控生物科技股份有限公司生產(chǎn)的肌酸磷酸激酶檢測試劑盒，該試劑盒適用于全自動，半自動生化分析儀及分光光度計(jì)測定人血清中CK的酶活濃度。 基本參數(shù)：波長：340 nm，溫度：25,30,37，比色杯光徑：1cm。,15,原裝試劑雜2-8避光保存，有效期12個月。復(fù)溶后在2-8可穩(wěn)定7天，在15-25可穩(wěn)定12小時。,試劑盒主要成分與濃度，見表3-15： 表3-15 肌酸磷酸激酶檢測試劑盒成分與濃度,16,混合均勻，在37溫育2

8、分鐘后，讀取初始吸光度，然后在精確1分鐘，2分鐘，3分鐘時分別讀取吸光度，確定每分鐘平均吸光度變化A。,表3-16 肌酸磷酸激酶檢測試劑盒的操作, 操作步驟：取一定量R2（參看R1瓶簽）復(fù)溶1瓶R1，溶解后即為工作液。工作液預(yù)先保溫至測試溫度。,17,計(jì)算： CK（U/L）=（A樣品/分A空白/分）F F=(Vt/Vs消光系數(shù)) 1000=8095（37） Vt=反應(yīng)總體積 Vs=樣品體積 NADPH在340 nm波長下毫克分子消光系數(shù)=6.3 參考值：男：24-195 U/L；女：24-170 U/L 線性上限：CK活力可達(dá)1500U/L（37） 注意事項(xiàng)：當(dāng)A/分大于0.0360（F=4127），0.0190（F=8095）時，樣品用生理鹽水稀釋后重新測定， 結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)；試劑空白吸光度大于0.6時,勿用；血清CK不穩(wěn)定，樣品收集后要盡快分析，在室溫4小時，在4 8-12小時后，CK活性即要下降。,18,5 注意事項(xiàng),5 注意事項(xiàng), 紅細(xì)胞中肌酸磷酸激酶活力很低，故溶血標(biāo)本不影響測定結(jié)果。 混合底物的pH要求準(zhǔn)確。 氧氧化鋇和硫酸鋅要滴定至恰好等量，否則離心后會出現(xiàn)混濁。特別是鋇離子多時，不能完全被硫酸根清除盡，使顯色混濁而影響測定結(jié)果。 肌酸磷酸激酶活力單位定義：以1 ml血清在37與底物作用1小時，生成1M肌酸為1個肌酸磷酸激酶活力單位。 酶的