土壤中產(chǎn)淀粉酶芽孢桿菌的篩選及其淀粉酶活力的測定FINAL

1、土壤中產(chǎn)淀粉酶芽胞桿菌的篩選及其淀粉酶活力的測定設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)方案課程名稱：微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)學(xué)院：生命科學(xué)學(xué)院班別：06生工組員：摘要：本文通過稀釋平板和分區(qū)劃線的方法在演藝中心旁的土壤、新運(yùn)動場附近的足球場和實(shí)驗(yàn)室老師用于培養(yǎng)大麥所用的有機(jī)肥土壤培養(yǎng)基的土壤樣品中分離到能產(chǎn)淀粉酶的芽孢桿菌3株，編號為3、5、7。通過觀察其透明圈并測量計(jì)算透明圈直徑（H）和菌落直徑（D）的比值和采用3，5-二硝基水楊酸顯色法（DNS）對發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)提取的粗酶液進(jìn)行酶活力測定的方法對該3株菌株進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明前言：酶是生物體內(nèi)進(jìn)行生物化學(xué)反應(yīng)的催化劑，在生物體中已發(fā)現(xiàn)的酶有2500多種。由于酶促反應(yīng)的特異性強(qiáng)，

2、反應(yīng)條件溫和、安全、無毒、環(huán)境污染少。而不同類型的微生物由于自身生長的需要，產(chǎn)生并向胞外分泌能水解大分子蛋白和淀粉的酶類，使不能透過微生物細(xì)胞的大分子物質(zhì)經(jīng)酶解后形成小分子糖、小隊(duì)和氨基酸，可為微生物提供碳素和氮素營養(yǎng)。由于微生物體積小，生長速度快，易于大規(guī)模生產(chǎn)，從微生物中制取酶已成為發(fā)酵工業(yè)中的一個新興領(lǐng)域。目前能由工業(yè)生產(chǎn)的50多種酶制劑，大部分是由霉菌、細(xì)菌、鏈霉菌和酵母菌產(chǎn)生的。酶制劑中的蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、果膠酶、纖維素酶、葡萄糖氧化酶，葡萄糖異構(gòu)酶在食品、洗滌劑、皮革、紡織、造紙、診斷、藥用等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。潮lJ值得一提的是，用于H報(bào)反應(yīng)的高溫叫A聚合酶Taq酶是從

3、古生菌中的水生棲熱菌(7AowM6g壩zifm)中獲取的，此酶可耐8090高溫，而最新的Pfu酶則是從另一類古生菌激烈火球菌(P)州。en6M71刪)中獲取的。該酶可耐90以上的高溫，這兩種微生物酶的發(fā)現(xiàn)，為分子生物學(xué)的研究提供了有力的工具。一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊?、了解微生物分離純化的原理及微生物分離純化常用方法和技術(shù)；2、掌握從土壤中篩選產(chǎn)淀粉酶菌株的原理及方法；3、掌握微生物的搖瓶培養(yǎng)方法及淀粉酶活力測定的原理及方法；4、培養(yǎng)學(xué)生自行設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)流程、綜合分析解決問題及判斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果的能力；5、對所學(xué)習(xí)過的微生物實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行綜合技能訓(xùn)練；6、從不同環(huán)境土壤樣品中篩選出能產(chǎn)淀粉酶的芽孢桿菌，并分析比較

4、各產(chǎn)淀粉酶菌株的產(chǎn)淀粉酶活力及總結(jié)各芽孢桿菌在土壤中的分布情況。二、實(shí)驗(yàn)原理土壤微生物類群在全球自然生態(tài)系統(tǒng)中具有不可替代的作用,它推動著生態(tài)系統(tǒng)的能量流動和物質(zhì)循環(huán),維持生態(tài)系統(tǒng)的正常運(yùn)轉(zhuǎn),是生態(tài)系統(tǒng)中的重要組成部分,在土壤中的分布既反映土壤、植物和氣候等綜合因素對微生物的影響和作用,同時其生命活動也反映出土壤肥力、土壤改良與植物營養(yǎng)的密切關(guān)系。芽孢桿菌是土壤細(xì)菌中最具活力的部分之一,也是土壤細(xì)菌的主要種群之一3。芽孢桿菌屬(Bacillus)是一類好氧或兼性厭氧、產(chǎn)生抗逆性內(nèi)生孢子的桿狀細(xì)菌。多數(shù)為腐生菌,主要分布于土壤、動植物體表及水體中。由于芽孢桿菌屬的細(xì)菌可以產(chǎn)生多種有用代謝產(chǎn)物,芽

5、孢又是菌體度過不良環(huán)境的休眠體,因此,在工、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上有較高的應(yīng)用價(jià)值 1。 從混雜微生物群體中獲得只含有某一種或某一株微生物的過程稱為微生物分離與純化。平板分離發(fā)普遍用于微生物的分離與純化。其基本原理是選擇適合與待分離微生物的生長條件，如營養(yǎng)成分、酸堿度、溫度和氧等要求，或加入某種抑制劑造成只利于該微生物生長，而抑制其他微生物生長的環(huán)境，從而淘汰一些不需要的微生物。 微生物在固體培養(yǎng)基上生長形成的單個菌落，通常是由一個細(xì)胞繁殖而成的集合體。因此可通過挑取單菌落而獲得一種純培養(yǎng)。獲取單個菌落的方法可通過稀釋涂布平板或平板劃線等技術(shù)完成。值得指出的是，從微生物群體中經(jīng)分離生長在平板上的單個菌落并

6、不一定保證是純培養(yǎng)。因此，純培養(yǎng)的確定除觀察其菌落特征外，還要結(jié)合顯微鏡檢測個體形態(tài)特征后才能確定，有些微生物的純培養(yǎng)要經(jīng)過一系列分離與純化過程和多種特征鑒定才能得到。 土壤是微生物生活的大本營，它所含微生物無論是數(shù)量還是種類都是極其豐富的。因此土壤是微生物多樣性的重要場所，是發(fā)掘微生物資源的重要基地，可以從中分離、純化得到許多有價(jià)值的菌株。本實(shí)驗(yàn)將用營養(yǎng)瓊脂和淀粉牛肉膏培養(yǎng)基分離純化產(chǎn)淀粉酶的芽孢桿菌。三、實(shí)驗(yàn)材料和用具土樣采集 新運(yùn)動場附近的足球場、溫室旁、b17樓下、演藝中心旁的土壤和實(shí)驗(yàn)室老師用于培養(yǎng)大麥所用的有機(jī)肥土壤培養(yǎng)基營養(yǎng)瓊脂(%)：蛋白胨1 牛肉膏0.3 氯化鈉0.5 瓊脂1

7、.5 2.0 蒸餾水 將除瓊脂以外的各成分溶解于蒸餾水內(nèi)，加入15%氫氧化鈉溶液約2mL，校正pH至7.27.4。加入瓊脂,加熱煮沸，使瓊脂溶化。淀粉牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(%)：可溶性淀0.2 牛肉0.3 蛋白1.0 氯化鈉0.5 瓊脂1.52.0 校正pH至7.27.4發(fā)酵培養(yǎng)基(%)：玉米粉 2 黃豆餅粉 1.5 CaCl 0.02 MgSO4 0.02 NaCl 0.25 K2HPO4 0.2 檸檬酸鈉 0.2 硫酸氨0.075(溶解后加) Na2HPO40.2 校正pH值7.0葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基（V.P試驗(yàn)用）（%）：葡萄糖0.5 蛋白胨0.5 K2HPO4 0.2 校正pH 7.27.

8、4蛋白胨水培養(yǎng)基（吲哚試驗(yàn)用）（%）：蛋白胨1% 氯化鈉0.5% 校正pH 7.27.4西蒙氏檸檬酸鹽培養(yǎng)基（%）：氯化鈉0.5 硫酸鎂(MgSO47H2O)0.02 磷酸二氫銨0.1 磷酸氫二鉀0.1 檸檬酸0.5 瓊脂2 溴麝香草酚藍(lán)溶液4 酚紅試劑 校正pH6.8配制營養(yǎng)明膠培養(yǎng)基（%）：蛋白胨 0.5、牛肉膏0.3、明膠1.2，調(diào)pH 6.87.0耐鹽培養(yǎng)基（%）：蛋白胨1 牛肉膏0.3 氯化鈉1 瓊脂1.5 2.0 蒸餾水 蛋白胨1 牛肉膏0.3 氯化鈉2 瓊脂1.5 2.0 蒸餾水 蛋白胨1 牛肉膏0.3 氯化鈉3 瓊脂1.5 2.0 蒸餾水 蛋白胨1 牛肉膏0.3 氯化鈉4 瓊脂

9、1.5 2.0 蒸餾水 蛋白胨1 牛肉膏0.3 氯化鈉5 瓊脂1.5 2.0 蒸餾水 加入15%氫氧化鈉溶液約2mL，校正pH至7.27.4。加入瓊脂,加熱煮沸，使瓊脂溶化。溶液或試劑染料革蘭氏染色：草酸銨結(jié)晶紫染色液、盧戈氏碘液、95%乙醇;芽孢染色：5%孔雀綠溶液, 石炭酸復(fù)紅液; 香柏油、二甲苯吲哚試驗(yàn)：乙醚、吲哚試劑V.P.試驗(yàn)：40NaOH溶液、-奈酚，淀粉酶活力測定：1%3, 5- 二硝基水楊酸試劑儀器或其它用具無菌玻璃涂棒 無菌吸管 接種環(huán) 無菌培養(yǎng)皿 土樣 三角瓶 燒杯 洗瓶 玻棒 試管 酒精燈 擦鏡紙 接種環(huán) 酒精燈 載玻片 吸水紙等。恒溫?fù)u床 恒溫培養(yǎng)箱 高壓蒸汽滅菌箱 超

10、凈工作臺 水浴箱 紫外燈照射箱 磁力攪拌器 玻璃珠 移液管 涂布器 顯微鏡四、實(shí)驗(yàn)方法1、土樣的采集取五個土樣點(diǎn)，分別是新運(yùn)動場附近的足球場、溫室旁、b17樓下、演藝中心旁的土壤和實(shí)驗(yàn)室老師用于培養(yǎng)大麥所用的有機(jī)肥土壤。用無菌用具，如用酒精擦拭過的鏟子鏟去表土，取其各自表土5cm左右的深處土壤，裝進(jìn)無菌防水紙袋，編號包裝好。2、菌株的分離提純2.1土壤稀釋液的制備五個土樣分別取5g，放入各自裝有45mL無菌水的三角瓶，振蕩10min,即為稀釋10-1的土壤懸浮液。每個環(huán)境的土樣裝1個錐形瓶，共5個，同時將其分為10組，編號ABCDE。將5個錐形瓶加塞、包扎、搖勻（無菌室里），利用恒溫水浴裝置8

11、0左右水浴，水浴鍋溫度恒定后維持20min（制懸液時就應(yīng)先開始加熱），制成10-1 g/ml的土壤懸液再分別另取裝有9mL無菌水試管5支，用記號筆編上10-2、10-3、10-4、10-5。取已稀釋成10-1土壤液，振蕩后靜止0.5min，用無菌吸管吸取1mL土壤懸液加入10-2的無菌水的試管中，并在試管內(nèi)輕輕反復(fù)吹吸數(shù)次，使之充分混勻，即成10-2土壤稀釋液。同法從10-2的試管中吸取1mL稀釋液加入編號為10-3的無菌水試管中，混勻后即為10-3土壤稀釋液，依次連續(xù)稀釋為10-4、10-5土壤稀釋液。在土壤稀釋過程中，以同一支吸管由濃到稀，稀釋到底。選擇稀釋度10-2、10-3、10-4，

12、加熱8020min處理稀釋液以殺死無芽孢細(xì)菌，濃縮芽孢桿菌。2.2分離土壤中的細(xì)菌及純化制作平板 每組取無菌培養(yǎng)皿2副，各在培養(yǎng)皿底部貼上標(biāo)簽，注明分離菌名、稀釋度、組別、班級。取已溶化的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，倒入無菌培養(yǎng)皿中，制成平板。涂布平板 用一支新的無菌槍頭，由低濃度開始，從各濃度土壤稀釋液中各吸取100ul，對號較均勻地放入已寫好稀釋度的牛肉蛋白胨培養(yǎng)基平板上，用灼燒冷卻后的無菌玻璃涂棒涂勻。每個濃度做3個平板（重復(fù)）。劃線接種（分區(qū)劃線法） 平板凝固后，各組分別用接種環(huán)以無菌操作挑取平板上長出的單菌落分區(qū)劃線，先在平板培養(yǎng)基的一邊作第1次平行劃線34條，再轉(zhuǎn)動培養(yǎng)皿約60角，并將接種

13、環(huán)上剩余物燒掉，待冷卻后通過第1次劃線部分作第2次平行劃線，再用同法通過第2次平行劃線部分作第3次平行劃線和通過第3次平行劃線部分作第4次平行劃線（如右圖）。劃線完畢，蓋上皿蓋，倒置于2829C溫室中培養(yǎng)約20h.。再繼續(xù)分區(qū)劃線2-3次，以獲得較純的菌種。將純化得到的單菌落分為兩部分，其中一部分接種到培養(yǎng)基內(nèi)，用以保存菌種，另一部分用來做染色實(shí)驗(yàn)。2.3獲產(chǎn)淀粉酶芽孢桿菌純種：上述劃線接種后的菌落中各挑取形態(tài)特征不一致的點(diǎn)接于倒好的淀粉牛肉膏培養(yǎng)基中，一個土樣取8個平板兩兩標(biāo)記同一位置同序號標(biāo)記，一平板分5個區(qū)域，點(diǎn)接重復(fù)兩次，在37培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。上述點(diǎn)接后的平板中取出一組四個分好區(qū)域

14、的淀粉牛肉膏培養(yǎng)基平板于實(shí)驗(yàn)室，其他置于無菌室。實(shí)驗(yàn)室里，四個平板均加入碘液，立即觀察記錄陽性和陰性菌落所在位置，并可同時記錄透明圈的大小。根據(jù)所記錄的陽性菌的編號，利用另一組中的營養(yǎng)瓊脂平板上其對應(yīng)的菌落繼續(xù)劃線接種，培養(yǎng)后將出現(xiàn)的形態(tài)特征不一致的菌落進(jìn)行編號，然后挑取部分出來進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，若發(fā)現(xiàn)視野內(nèi)出現(xiàn)形態(tài)、大小、顏色一致且為桿菌的菌體，則將其對應(yīng)的菌種劃線接種到新的營養(yǎng)瓊脂平板上，標(biāo)記，37下培養(yǎng)24h。否則繼續(xù)進(jìn)行劃線分離，培養(yǎng)后再經(jīng)革蘭氏染色鏡檢直至得到純種桿菌后進(jìn)行芽孢染色。篩選出芽孢純種后進(jìn)行斜面接種。其中革蘭氏染色步驟：涂片、干燥及固定初染：在做好的涂面上滴加草酸銨結(jié)晶

15、紫染液，染1分鐘，傾去染液，流水沖洗至無紫色。媒染：先用新配的路哥氏碘液沖去殘水，而后用其覆蓋涂面1分鐘，后水洗。脫色：除去殘水后，滴加95%酒精進(jìn)行脫色約1520秒，后立即用流水沖洗。復(fù)染：滴加番紅染色液，染35分鐘，水洗后用吸水紙吸干。 鏡檢：油鏡觀察染色結(jié)果。芽孢染色染色鏡檢：取37培養(yǎng)1824h的枯草芽孢桿菌涂片，干燥，固定。于涂片上滴人35滴5%孔雀綠水溶液。用試管夾夾住載玻片在火焰上用微火加熱，自載玻片上出現(xiàn)蒸汽時，開始計(jì)算時間約45min。加熱過程中切勿使染料蒸干，必要時可添加少許染料。傾去染液，待玻片冷卻后，水沖洗至孔雀綠不再褪色為止。用石炭酸復(fù)紅液復(fù)染l min，水洗。制片干

16、燥后用油鏡觀察。芽孢呈綠色，菌體紅色。觀察莢膜2.4斜面保存菌種貼標(biāo)簽 取各種無菌斜面試管數(shù)支，將注有菌株名稱和接種日期的標(biāo)簽貼上，貼在試管斜面的正上方，距試管口23cm處。（每種菌接3管，標(biāo)上相同編號也要與平板上菌落編號相對應(yīng)）。進(jìn)行斜面接種操作，加塞、包扎好到37培養(yǎng)箱里培養(yǎng)24h。3、菌種的鑒定3.1所得的斜面菌種接種到新的平板上培養(yǎng)以觀察篩選出的產(chǎn)淀粉酶芽孢桿菌菌落的大小、顏色、干濕情況、形態(tài) 、高度 、透明程度、邊緣、是否易被挑起、氣味等。然后進(jìn)行一系列的鏡檢革蘭氏染色、芽孢染色（具體步驟同上）觀察是否符合附表中芽孢桿菌的指標(biāo)3.2生理生化試驗(yàn)溫度對菌種培養(yǎng)的影響；淀粉水解試驗(yàn)；溫度

17、對菌種的影響；明膠液化試驗(yàn)；糖發(fā)酵試驗(yàn)；乙酰甲基甲醇試驗(yàn)(V.P試驗(yàn))；吲哚試驗(yàn)；耐鹽性試驗(yàn)；檸檬酸鹽利用試驗(yàn)。溫度對微生物生長的影響 將牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基熔化倒平板。（培養(yǎng)基厚度為一般培養(yǎng)基的1.5 到2倍） 取30 套牛肉膏蛋白胨平板，分別進(jìn)行標(biāo)號。 在上述各平板中分別劃線接種不同的菌種，每個菌種重復(fù)接種六個平板。各取每個菌種兩套平板倒置于4 （冰箱）、37（或者室溫），60下保溫培養(yǎng)24 小時，觀察細(xì)菌的生長狀況。（“”不生長，“+”生長較差 ， “+”生長一般，“+”生長良好。淀粉水解實(shí)驗(yàn)以18-24h的純培養(yǎng)物，涂布接種于淀粉瓊脂斜面或平板（一個平板可分區(qū)劃“+“字接種，）或直接移種

18、于淀粉肉湯中，于361培養(yǎng)24-48h，或于20培養(yǎng)5天。然后將碘試劑直接滴浸于培養(yǎng)表面，若為液體培養(yǎng)物，則加數(shù)滴碘試劑于試管中。立即檢視結(jié)果，陽性反應(yīng)（淀粉被分解）為瓊脂培養(yǎng)基呈深藍(lán)色、菌落或培養(yǎng)物周圍出現(xiàn)無色透明環(huán)、或肉湯顏色無變化。陰性反應(yīng)則無透明環(huán)或肉湯呈深藍(lán)色。淀粉水解系逐步進(jìn)行的過程，因而試驗(yàn)結(jié)果與菌種產(chǎn)生淀粉酶的能力、培養(yǎng)時間，培養(yǎng)基含有淀粉量和pH等均有一定關(guān)系。培養(yǎng)基pH必須為中性或微酸性，以pH7.2最適。淀粉瓊脂平板不宜保存于冰箱，因而以臨用時制備為妥。明膠水解試驗(yàn)穿刺接種、培養(yǎng) 先用接種針在斜面上挑取少量菌苔。左手拿直立柱試管，在火焰旁用右手小指和掌邊拔出棉塞。隨之將試

19、管口朝下，同時將接種針從直立柱培養(yǎng)基中央自下而上直刺到離管底11.5cm處（切勿穿透培養(yǎng)基）。然后沿原穿刺線拔出接種針。管口過火，塞上棉塞，插在試管架上。灼燒接種針上殘菌。各種桿菌分別接種2支直立柱試管，標(biāo)記，要與斜面菌種標(biāo)記相對應(yīng)。另設(shè)一支不接種，作為空白對照。觀察記錄 將已接種的直立柱試管置37培養(yǎng)24h后取出，通過透射光目測細(xì)菌在穿刺線上的生長情況，并記錄結(jié)果。凡能產(chǎn)生蛋白酶的細(xì)菌，可使明膠自表面開始沿穿刺線逐漸分離，使明膠柱液化呈火山口狀，蕪菁狀，漏斗狀、囊狀或?qū)訝畹炔煌男螤?。糖類發(fā)酵試驗(yàn)（葡萄糖、木糖和乳糖發(fā)酵）用小砂輪輕輕切割發(fā)酵管沒有標(biāo)簽和標(biāo)識的另外一端，注意保留標(biāo)簽和糖的名稱

20、。用接種針將各種桿菌分別接種于兩種發(fā)酵管內(nèi)，每種發(fā)酵管重復(fù)兩次，標(biāo)記，要與斜面菌種標(biāo)記相對應(yīng)。兩種發(fā)酵管各設(shè)一支不接種，作為空白對照。注意接種的整個過程中，不能人為的制造氣泡，若發(fā)酵管內(nèi)有氣泡，則輕輕甩動發(fā)酵管直至氣泡消失。若氣泡不能退去，則該管作廢應(yīng)重做一管。接種后，每一管外包一層無菌紙，以防污染。接種完畢后，將全部發(fā)酵管倒置于干凈小燒杯內(nèi)，37培養(yǎng)24h。觀察記錄：與對照管比較，若接種培養(yǎng)液保持原有顏色，其反應(yīng)結(jié)果為陰性，表明該菌不能利用該種糖，記錄用“”表示；如培養(yǎng)液呈黃色，反應(yīng)結(jié)果為陽性，表明該菌能分解該種糖產(chǎn)酸，記錄用“”表示。培養(yǎng)液中的杜氏小管內(nèi)有氣泡為陽性反應(yīng)，表明該菌分解糖能產(chǎn)

21、酸并產(chǎn)氣，記錄用“”表示；如杜氏小管內(nèi)沒有氣泡為陰性反應(yīng)，記錄用“”。乙酰甲基甲醇試驗(yàn)(VP試驗(yàn)) 標(biāo)記試管 ：取裝有葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)液的試管，編號。接種培養(yǎng) 以無菌操作分別接種少量菌苔至以上相應(yīng)試管中，空白對照管不接菌，置37恒溫箱中，培養(yǎng)24h。 觀察記錄 取出以上試管，充分振蕩2min。每管分別加入40NaOH溶液1020滴，并加等量-奈酚，振蕩試管，以使空氣中的氧溶入，置37恒溫箱中保溫1530min后，若培養(yǎng)液呈紅色，記錄為V.P.試驗(yàn)陽性反應(yīng)（用“”表示）；若不呈紅色，記錄為V.P.試驗(yàn)陰性反應(yīng)（用“”表示）。 吲哚試驗(yàn) 試管標(biāo)記 取裝有蛋白胨水培養(yǎng)液的試管，編號。接種培養(yǎng) 以無菌

22、操作分別接種少量菌苔到以上相應(yīng)試管中，空白對照管不接種，置37恒溫箱中培養(yǎng)24h。 觀察記錄 在培養(yǎng)液中加入乙醚12ml，經(jīng)充分振蕩使吲哚萃取至乙醚中，靜置片刻后乙醚層浮于培養(yǎng)液的上面，此時沿管壁緩慢加入510滴吲哚試劑（加入吲哚試劑后切勿搖動試管，以防破壞乙醚層影響結(jié)果觀察），如有吲哚存在，乙醚層呈現(xiàn)玫瑰紅色，此為吲哚試驗(yàn)陽性反應(yīng)，否則為陰性反應(yīng)，陽性用“”、陰性用“”表示。 耐鹽性試驗(yàn)將分離獲得的細(xì)菌分別接種在NaCl濃度為1%，2%，3%，4 %，5%的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中,置37下培養(yǎng),觀察生長情況 5。檸檬酸鹽試驗(yàn)取裝有西蒙斯氏檸檬酸鹽培養(yǎng)基的試管分別標(biāo)記待測菌種的編號和空白對照

23、以無菌操作分別將少量菌苔接種于各支相應(yīng)的管中，然后置于37恒溫箱中培養(yǎng)24h。觀察結(jié)果，若培養(yǎng)基變藍(lán)色，則表明該菌能利用檸檬酸鹽作為碳源而生長，即為陽性反應(yīng)，以“”表示。若培養(yǎng)基仍為綠色則為陰性反應(yīng)，以“”表示。4、產(chǎn)淀粉酶芽孢桿菌產(chǎn)淀粉酶活性的測定將初篩純菌種接種于30/250mL 種子培養(yǎng)基,37 、250r/min搖床培養(yǎng)過夜。種子液以2 %接種量接種于產(chǎn)酶液體培養(yǎng)基50/500mL ,相同條件培養(yǎng)72h ,發(fā)酵液8 000r/min 離心10min ,取上清液測酶活, 每個樣品重復(fù)3 次,最后結(jié)果取平均值。在Young等方法的基礎(chǔ)上作了改進(jìn)：取5ml 0.5%的可溶性淀粉溶液，在40水

24、浴中預(yù)熱10min，然后加適當(dāng)稀釋的酶液0.5ml，反應(yīng)5min后，用5ml 0.1mol/L H2SO4終止反應(yīng)。取0.5ml反應(yīng)液與5ml碘液顯色，在620nm處測光密度。以0.5ml水代替0.5ml反應(yīng)液為空白，以不加酶液（加同樣體積的緩沖液）的管為對照。酶活力根據(jù)下式計(jì)算：酶活力（u/ml）=(R-r)/R*50*D式中R、r分別表示對照和反應(yīng)液的光密度，D為酶的稀釋倍數(shù)。調(diào)整D使（R-r）/R在0.2-0.7之間。確定在40 5min內(nèi)水解1mg淀粉的酶量為一個活力單位。3.2.6 菌種保藏法（斜面冰箱包保藏法） 將菌種接種在新鮮外面培養(yǎng)基上，定溫培養(yǎng)長出豐滿菌苔后（一般形成芽孢的細(xì)菌要形成芽孢），貼上標(biāo)簽，放在試管上，在棉塞部位用尼龍紙或防水紙包好，以防外界污染和水浸濕，放入4冰箱中保藏。五、實(shí)驗(yàn)預(yù)期結(jié)果選擇的五處地方將分離出不完全相同的產(chǎn)淀粉酶芽孢桿菌，但前提是這五處土樣的選取應(yīng)該有一定