下游技術(shù) 綜合.pptx

1、,生物工程下游技術(shù),第一章 緒論,下游加工過程在生物技術(shù)中的地位,組成： 下游加工過程是生物技術(shù)的重要組成部分，發(fā)酵液或反應(yīng)液需要經(jīng)過下游加工過程才能成為成品 費(fèi)用： 傳統(tǒng)發(fā)酵工業(yè)中下游部分的費(fèi)用占整個(gè)工廠投資費(fèi)用的60，而對(duì)重組DNA生產(chǎn)蛋白質(zhì)等基因工程產(chǎn)品， 下游加工的費(fèi)用可占整個(gè)生產(chǎn)費(fèi)用的8090,下游技術(shù)（工程） （downstream processing）：對(duì)于由生物界自然產(chǎn)生的或由微生物菌體發(fā)酵的、動(dòng)植物細(xì)胞組織培養(yǎng)的、酶反應(yīng)等各種生物工業(yè)生產(chǎn)過程獲得的生物原料，經(jīng)提取分離、加工并精制目的成分，最終使其成為產(chǎn)品的技術(shù)。 下游加工過程的重要性。（組成、費(fèi)用和關(guān)注程度）,生物工業(yè)下游

2、技術(shù)的發(fā)展歷程,古代釀造業(yè),古代釀造業(yè)包括釀酒、制醬（油）、醋、酸奶和干酪等。技術(shù)原始、家庭式作坊、產(chǎn)物基本不經(jīng)過后處理而直接使用 無下游技術(shù),2. 第一代生物技術(shù) 主要指19世紀(jì)60年代-20世紀(jì)40年代青霉素等抗生素出現(xiàn)之前的生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)。 發(fā)現(xiàn)了發(fā)酵的本質(zhì)是微生物的作用，掌握了純種培養(yǎng)技術(shù)，生物技術(shù)進(jìn)入近代釀造產(chǎn)業(yè)的發(fā)展階段。,以20世紀(jì)40年代出現(xiàn)的青霉素產(chǎn)品為代表。 無菌空氣制備技術(shù)、大型好氧發(fā)酵裝置開發(fā) 一大批通風(fēng)發(fā)酵技術(shù)產(chǎn)品相繼投入了工業(yè)生產(chǎn)，如抗生素（鏈霉素）、氨基酸（谷氨酸）、有機(jī)酸（核酸、檸檬酸）、酶制劑（淀粉酶）、微生物多糖和單細(xì)胞蛋白等。,3. 第二代生物技術(shù),以20世

3、紀(jì)70年代末崛起的DNA重組技術(shù)及細(xì)胞融合技術(shù)為代表。 生物技術(shù)在其主要領(lǐng)域：基因工程、酶工程、細(xì)胞工程和微生物發(fā)酵工程取得了長(zhǎng)足進(jìn)步，一批高附加值的產(chǎn)品開始面世，如乙肝疫苗、干擾素等。 80年代，發(fā)現(xiàn)了一大批生理功能性物質(zhì)，如活性糖質(zhì)、活性肽、高度不飽和脂肪酸等，生物技術(shù)在深度和廣度上都取得了很大的進(jìn)展。,4. 第三代生物技術(shù),下游加工過程的一般流程,產(chǎn)品的收得率和質(zhì)量控制。,第二章 下游技術(shù)的理論基礎(chǔ),第一節(jié) 下游技術(shù)中的物理學(xué)過程,一、基礎(chǔ)物性 “分離”可利用各種物質(zhì)固有性質(zhì)的差異。物性差異越大，利用價(jià)值越大。 二、分類 以物理學(xué)過程為基礎(chǔ)的分離操作，大致可分為以下三類： 1平衡分離過程

4、 建立在相平衡關(guān)系上的。利用相的組成差別進(jìn)行混合物體系的分離。表2-1為平衡分離的代表性單元操作。,2擬平衡分離操作 在混合物體系本身所占有的空間之外加一個(gè)能引起物質(zhì)分離的勢(shì)能場(chǎng)，在它的作用下，形成分離場(chǎng)如表2-2所示。 3 非平衡分離操作 除 1、2以外的均劃歸其中，利用物質(zhì)移動(dòng)速度差和廣義的、基于“屏蔽效應(yīng)”的分離操作。 如表2-3所示。,第二節(jié) 下游技術(shù)中的化學(xué)過程,一、化學(xué)性分子識(shí)別 液液萃取： 利用物質(zhì)在溶劑中溶解度不同的分離。 如果在萃取溶劑中加入對(duì)原料中目標(biāo)物質(zhì)有特異性作用的成分(萃取劑、抽提劑)，能達(dá)到高選擇性。,1分子間相互作用 分子間的相互作用力除了眾所周知的范德華力氫鍵力

5、等，近年來備受注目的分子間作用力是“疏水性”相互作用力，即在水性介質(zhì)中，各分子的疏水性相互作用的凝聚力，屬于熱力學(xué)性質(zhì)。 2 分子識(shí)別 最典型：酶和底物的專一性結(jié)合。 鑰匙和鎖的關(guān)系。只有底物分子才能進(jìn)入這個(gè)口袋。酶分子正是通過對(duì)底物的多點(diǎn)識(shí)別才顯示出它高效、專一的底物識(shí)別功能。,第三章 發(fā)酵液的預(yù)處理,微生物菌體及殘存的固體培養(yǎng)基外，還有未被微生 物完全利用的糖類、無機(jī)鹽、蛋白質(zhì)，以及微生物的各 種代謝產(chǎn)物。,發(fā)酵液成分,目 的,分離菌體和其他懸浮顆粒，除去部分可溶性雜質(zhì)和 改變?yōu)V液的性質(zhì)，以利于提取和精制后繼各工序的順利 進(jìn)行。,對(duì)于胞外產(chǎn)物，經(jīng)預(yù)處理應(yīng)盡可能使目的產(chǎn)物 轉(zhuǎn)移到液相，然后經(jīng)

6、固液分離除去固相； 對(duì)于胞內(nèi)產(chǎn)物，則應(yīng)首先收集菌體或細(xì)胞， 經(jīng)細(xì)胞破碎后，目的產(chǎn)物進(jìn)入液相，隨后再將細(xì)胞 碎片分離。,方 法 選 擇,一 、發(fā)酵液過濾特性的改變,發(fā)酵產(chǎn)物濃度較低，大多為1一10，懸浮液 中大部分是水； 懸浮物顆粒小，相對(duì)密度與液相相差不大； 固體粒子可壓縮性大； 液相粘度大，大多為非牛頓型流體； 性質(zhì)不穩(wěn)定，隨時(shí)間變化，如易受空氣氧化、微生 物污染、蛋白酶水解等作用的影響。 這些特性使得發(fā)酵液的過濾與分離相當(dāng)困難。,（一）微生物發(fā)酵液的特性,（二）改善發(fā)酵液過濾特性的物理化學(xué)方法,通過對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行適當(dāng)?shù)念A(yù)處理，即可改善其流體 性能，降低濾餅比阻，提高過濾與分離的速率。 1.

7、降低液體粘度： 根據(jù)流體力學(xué)原理，濾液通過濾餅的速率與液體的 粘度成反比，降低液體粘度可有效提高過濾速率。注意加 熱溫度與時(shí)間，不影響產(chǎn)物活性和細(xì)胞的完整性。 有加水稀釋法和加熱法,pH值直接影響發(fā)酵液中某些物質(zhì)的電離度和電荷 性質(zhì)，適當(dāng)調(diào)節(jié)pH值可改善其過濾特性。 氨基酸、蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的調(diào)節(jié)；在膜過濾中，發(fā) 酵液中的大分子物質(zhì)易與膜發(fā)生吸附，通過調(diào)整pH值 改變易吸附分子的電荷性質(zhì)，即可減少堵塞和污染； 細(xì)胞、細(xì)胞碎片及某些膠體物質(zhì)等在某個(gè)pH值下 也可能趨于絮凝而成為較大顆粒，有利于過濾的進(jìn)行。,2. 調(diào)整pH,（1） pH直接影響發(fā)酵液中某些物質(zhì)的電離程度和電荷性質(zhì)，因此適當(dāng)調(diào)節(jié)pH值可

8、以改善發(fā)酵液的過濾特性。 （2）氨基酸和蛋白質(zhì)在酸性條件下帶正電，堿性條件下帶負(fù)電，等電點(diǎn)時(shí)凈電荷為零，兩性物質(zhì)在等電點(diǎn)下的溶解度最小，等電點(diǎn)沉淀法在生物工業(yè)分離中廣泛使用。 （3）如味精生產(chǎn)，利用等電點(diǎn)沉淀法提取谷氨酸，一般蛋白質(zhì)也在酸性范圍達(dá)到等電點(diǎn)；膜分離中可通過調(diào)整pH值改變易吸附分子的電荷性質(zhì)，減少膜堵塞和膜污染； 此外，細(xì)胞、細(xì)胞碎片及某些膠體物質(zhì)等在特定pH下也可能趨于絮凝而成為較大顆粒，有利于過濾進(jìn)行。,pH對(duì)發(fā)酵液過濾特性的影響（重點(diǎn)）,采用凝聚和絮凝技術(shù)能有效改變細(xì)胞、細(xì)胞碎 片及溶解大分子物質(zhì)的分散狀態(tài)，使其聚結(jié)成較 大的顆粒，便于提高過濾速率。另外，還能有效地除 去雜蛋

9、白和固體雜質(zhì)，提高濾液質(zhì)量。,3. 凝聚與絮凝,助濾劑是一種不可壓縮的多孔微粒，它能使濾餅疏 松，濾速增大。懸浮液中大量的細(xì)微膠體粒子被吸附到 助濾劑的表面上，改變了濾餅結(jié)構(gòu)，降低了過濾阻力。,4. 加入助濾劑,常用的助濾劑,硅藻土、纖維素、石棉粉、白土、炭粒、淀粉等。 最常用的是硅藻土，使用時(shí)，通常細(xì)粒用量為500 g/m3； 中等粒度用量為700 g/m3；粗粒用量為700-1000 g/m3。,加入反應(yīng)劑和某些可溶性鹽類發(fā)生反應(yīng)生成不溶性沉淀，如CaSO4，AlPO4等。生成的沉淀能防止菌絲體粘結(jié)，使菌絲具有塊狀結(jié)構(gòu)，沉淀本身可作為助濾劑，且能使膠狀物和懸浮物凝固，改善過濾性能；如發(fā)酵液

10、中含有不溶性多糖物質(zhì)，用酶將其轉(zhuǎn)化為單糖，以提高過濾速率。 不影響目的產(chǎn)物，可消除發(fā)酵液中某些雜質(zhì)對(duì)過濾的影響，提高過濾速率。,5. 加入反應(yīng)劑：,（三）凝聚與絮凝,凝聚和絮凝技術(shù)能有效地改變細(xì)胞、菌體和蛋白質(zhì)等膠體粒子的分散狀態(tài)，使聚集起來，增大體積，以便于過濾，常用于菌體細(xì)小而且粘度大的發(fā)酵液的預(yù)處理中。 通常發(fā)酵液中細(xì)胞或菌體帶有負(fù)電荷，由于靜電引力的 作用使溶液中帶相反電荷的粒子（即正離子）被吸附在其周 圍，在界面上形成了雙電層。但是這些正離子還受到使它們 均勻分布開去的熱運(yùn)動(dòng)的影響，具有離開膠粒表面的趨勢(shì)， 在這兩種相反作用的影響下，雙電層就分裂成兩部分。,在相距膠核表面約一個(gè)離子半

11、徑的Stern平面以內(nèi)， 正離子被緊密束縛在膠核表面，稱為吸附層或緊密層； 在stern平面以外，剩余的正離子則在溶液中擴(kuò)散開 去，距離越遠(yuǎn)，濃度越小，最后達(dá)到主體溶液的平均濃 度，稱為擴(kuò)散層。這樣就形成了擴(kuò)散雙電層的結(jié)構(gòu)模型， 如圖所示。,凝聚：指在電解質(zhì)作用下，由于膠粒之間雙電層電排 斥作用降低，電位下降，而使膠體體系不穩(wěn) 定的現(xiàn)象。 凝聚值：使膠粒發(fā)生凝聚作用的最小電解質(zhì)濃度。 反離子的價(jià)數(shù)越高，該值就越小，即凝聚能 力越強(qiáng)。,1、凝 聚,硫酸鋁 Al2(SO4)318H2O（明礬）； 氯化鋁 AlCl36H2O; 三氯化鐵 FeCl3; 硫酸亞鐵 FeSO47H2O ； 石灰；ZnSO

12、4；MgCO3,陽離子對(duì)帶負(fù)電荷的膠粒凝聚能力的次序,Al3+ Fe3+ H+ Ca2+ Mg2+ K+ Na+ Li+,常用的凝聚劑電解質(zhì)有：,2、絮 凝,絮凝：指在某些高分子絮凝劑存在下，基于橋架作用，使膠粒形成較大絮凝團(tuán)的過程。 絮凝劑：是一種能溶于水的高分子聚合物，其相對(duì)分子質(zhì)量可高達(dá)數(shù)萬至一千萬以上，它們具有長(zhǎng)鏈狀結(jié)構(gòu)， 其鏈節(jié)上含有許多活性官能團(tuán)， 包括帶電荷的陰離子或陽離子基團(tuán)以及 不帶電荷的非離子型基團(tuán)。,它們通過靜電引力、范德華引力或氫鍵的作 用，強(qiáng)烈地吸附在膠粒的表面。 當(dāng)一個(gè)高分子聚合物的許多鏈節(jié)分別吸附在不同 的膠粒表面上，產(chǎn)生橋架聯(lián)結(jié)時(shí)，就形成了較大的絮 團(tuán)，這就是絮

13、凝作用。,工業(yè)上使用的絮凝劑可分為三類： 1）有機(jī)高分子聚合物，如聚丙烯酰胺類衍生物、聚苯乙烯類衍生物； 2）無機(jī)高分子聚合物，如聚合鋁鹽、聚合鐵鹽等； 3）天然有機(jī)高分子絮凝劑，如聚糖類膠粘物、海藻酸鈉、明膠、骨膠、殼多糖、脫乙酰殼多糖等。,1）有機(jī)高分子聚合物，如聚丙烯酰胺類衍生物、 聚苯乙烯類衍生物； 2）無機(jī)高分子聚合物，如聚合鋁鹽、聚合鐵鹽等； 3）天然有機(jī)高分子絮凝劑，如聚糖類膠粘物、海藻酸鈉、明膠、骨膠、殼多糖、脫乙酰殼多糖等。,工業(yè)上使用的絮凝劑,絮凝的效果與絮凝劑的加量、相對(duì)分子質(zhì)量和類型、 溶液的pH、攪拌轉(zhuǎn)速和時(shí)間等因素有關(guān)。在絮凝過程中， 常需加入一定量助凝劑以增加絮凝

14、效果。 較多的絮凝劑有助于增加橋架數(shù)量，但過多的添加量 反而會(huì)引起吸附飽和，絮凝劑爭(zhēng)奪膠粒而使絮凝團(tuán)的粒徑 變小，絮凝效果下降。,對(duì)于帶負(fù)電荷的菌體或蛋白質(zhì)來說，采用陽離子型高分子絮凝劑同時(shí)具有降低膠粒雙電層電位和產(chǎn)生吸附橋架的雙重機(jī)理； 對(duì)于非離子型和陰離子型高分子絮凝劑，要采用凝聚和絮凝雙重機(jī)理才能提高過濾效果，這種包括凝聚和絮凝機(jī)理的過程，稱為混凝。,3、混 凝,（四）加入助濾劑,1）助濾劑： 最常用：硅藻土 2）使用方法： 在過濾介質(zhì)表面預(yù)涂助濾劑 直接加入發(fā)酵液 也可兩種方法同時(shí)兼用,（五）加入反應(yīng)劑,不影響目的產(chǎn)物 作用機(jī)理： 加入反應(yīng)劑和某些可溶性鹽類發(fā)生反應(yīng)生成不溶性沉淀，生成

15、的沉淀能防止菌絲體粘結(jié)，使菌絲具有塊狀結(jié)構(gòu)，沉淀本身可作為助濾劑，并且能使膠狀物和懸浮物凝固，從而改善過濾性能。 正確選擇反應(yīng)劑和反應(yīng)條件，能使過濾速率提高3-10倍,二、 發(fā)酵液的相對(duì)純化,發(fā)酵液中雜質(zhì)很多，其中有些雜質(zhì)不僅直接影響產(chǎn) 品質(zhì)量利收得率，同時(shí)對(duì)后繼提取和精制有很大影響。,發(fā)酵液中的雜質(zhì),（1）高價(jià)無機(jī)離子（Ca2+、Mg2+、Fe2+） 在采用離子交換提煉時(shí)，會(huì)影響樹脂對(duì)生化物質(zhì) 的交換容量。,在采用離子交換和吸附法提取時(shí)會(huì)降低其交換容量和吸附能力， 在有機(jī)溶劑法或雙水相萃取時(shí)，易產(chǎn)生乳化現(xiàn)象使兩相分離不清。 在常規(guī)過濾或膜過濾時(shí)，易使過濾介質(zhì)堵塞或受污染，影響過濾效率。 因此

16、，在預(yù)處理時(shí)，應(yīng)盡量除去這些物質(zhì)。,（2）雜蛋白,1. Ca2+ ：草酸、草酸鈉形成草酸鈣沉淀 草酸價(jià)格較貴。 可加入硫酸鉛，在60下反應(yīng)生成草酸鉛。后者在 9095下用硫酸分解，經(jīng)過濾冷卻、結(jié)晶后可以回收草酸。,（一）高價(jià)無機(jī)離子的去除方法,2.Mg2+： 草酸鎂的溶解度較大。故加入草酸不能除盡鎂離子要除去鎂離子，可以加入三聚磷酸鈉，它和鎂離子形成可溶性絡(luò)合物 Na5P3O10Mg2Mg Na3P3O102Na十 用磷酸鹽處理，也能大大降低鈣離子和鎂離子的濃度 3.Fe2+ 黃血鹽，普魯士蘭沉淀 要除去鐵離子，可加入黃血鹽，使形成普魯士藍(lán)沉淀: 4Fe3+ + 3K4Fe(CN)6 Fe4F

17、e(CN)63+ 12K+,蛋白質(zhì)一般以膠體狀態(tài)存在于發(fā)酵液中。 在酸性溶液中帶正電荷； 在堿性溶液中帶負(fù)電荷。 在某一pH下，凈電荷為零，溶解度最小， 稱為等電點(diǎn)。,（二）雜蛋白的去除方法,在酸性溶液中，蛋白質(zhì)與一些陰離子，如三氯乙酸鹽、水楊酸鹽、鎢酸鹽、苦味酸鹽、鞣酸鹽、過氯酸鹽等形成沉淀； 在堿性溶液中，蛋白質(zhì)與一些陽離子，如Ag+、Cu2+、Zn2+Fe3+和Pb+等形成沉淀。 由于羧基的電離度比氨基大，故蛋白質(zhì)的酸性性質(zhì)通常強(qiáng)于堿性，因而很多蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)都在酸性范圍內(nèi)（pH 4.05.5）。但單靠調(diào)節(jié)pH至等電點(diǎn)的辦法不能將大部分蛋白質(zhì)除去。,1. 酸堿調(diào)節(jié)，使蛋白質(zhì)與鹽或離子形成

18、沉淀,加熱， 大幅度調(diào)節(jié)pH值， 加酒精、丙酮等有機(jī)溶劑或表面活性劑等。 不足之處: 加熱法只適合于對(duì)熱較穩(wěn)定的目的產(chǎn)物； 極端pH值也會(huì)導(dǎo)致某些目的產(chǎn)物失活，且要消耗大量酸堿； 有機(jī)溶劑法通常只適用于所處理的液體數(shù)量較少的場(chǎng)合,2. 變性法,加入某些吸附劑或沉淀劑吸附雜蛋白質(zhì)而除去。 在四環(huán)素類抗生素中，采用黃血鹽和硫酸鋅的協(xié)同作用生成亞鐵氰化鋅鉀的膠狀沉淀來吸附蛋白質(zhì)； 在枯草桿菌發(fā)酵液中，加入氯化鈣和磷酸氫二鈉，兩者生成龐大的凝膠，把蛋白質(zhì)、菌體及其他不溶性粒子吸附并包裹在其中除去。,3. 吸附法,三、 固液分離工程及設(shè)備,范圍：培養(yǎng)基、發(fā)酵液、某些中間產(chǎn)品和半成品。 其中發(fā)酵液由于種類

19、多、粘度大和成分復(fù) 雜，分離 最為困難。 方法：分離篩、重力沉降、浮選分離、離心分離和過濾等，其中用于發(fā)酵液固液分離的主 要是離心分離和過濾分離。,重力沉降 浮 選 通氣，產(chǎn)生氣泡，使固體附著在氣泡表面除去。 用于固液比重差小、直徑530m顆粒的分離，污水處理 旋液分離 懸浮液以較高速度沿切線方向進(jìn)入旋風(fēng)分離器輕相由分離器中央排出，重相由分離器下部排出， 但不適合直徑5 m顆粒去除（可用絲網(wǎng)分離器）。,介質(zhì)過濾 霉菌和放線菌為絲狀菌，體形較大，發(fā)酵液采用過濾方法 細(xì)菌和酵母菌為單細(xì)胞，體形較小，其發(fā)酵液采用高速離心分離 如對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行預(yù)處理，也可用過濾進(jìn)行固液分離。,1.原理：利用轉(zhuǎn)鼓高速轉(zhuǎn)動(dòng)

20、所產(chǎn)生的離心力， 來實(shí)現(xiàn)懸浮液、乳濁液的分離或濃縮。 2.優(yōu)點(diǎn)：分離速率快、分離效率高、液相澄清度好等。 3.缺點(diǎn)：設(shè)備投資高、能耗大。此外，連續(xù)排料時(shí)， 固相干度不如過濾設(shè)備。 4.種類：種類多，按其作用原理不同，可分為過濾式 離心機(jī)和沉降式離心機(jī)兩大類。,（一）離心分離,基于固體顆粒和周圍液體密度存在差異，在離心場(chǎng)中使不同密度的固體顆粒加速沉降的分離過程 不同密度或不同大小及形狀的物質(zhì)在重力作用下的沉降速率不同，在形成密度梯度的液相體系中的平衡位置不同。 離心分離過程就是以離心力加速不同物質(zhì)沉降分離的過程。被分離物質(zhì)之間必須存在或經(jīng)人為處理產(chǎn)生的密度或沉降速率差異才能以離心方法進(jìn)行分離。

21、離心分離方法中差速離心法操作最簡(jiǎn)便，使用最廣泛，但其分離純化分辨率低于密度梯度離心。,離心分離法（重點(diǎn)）,（1）差速離心,采用不同的離心速度和離心時(shí)間，使沉降速度不同的顆粒分批分離的方法。 主要用于分離大小和密度差異較大的顆粒。,（2）密度梯度離心,樣品在密度梯度介質(zhì)中進(jìn)行離心，使沉降系數(shù)比較接近的物質(zhì)得以分離的一種區(qū)帶分離方法。 密度梯度系統(tǒng)：梯度介質(zhì)有足夠大的溶解度，不與分離組分反應(yīng)，不會(huì)引起分離組分的凝集、變性或失活。 常用介質(zhì)：蔗糖、甘油等。 樣品鋪在密度梯度溶液表面，離心后形成若干條界面清楚的不連續(xù)區(qū)帶。,（3）等密度離心,當(dāng)欲分離的不同顆粒的密度范圍在離心介質(zhì)的密度梯度范圍內(nèi)時(shí)，不

22、同浮力密度的物質(zhì)顆粒在離心力作用下一直移動(dòng)到與各自浮力密度相等的位置（等密度點(diǎn)），形成區(qū)帶。 等密度離心常用的介質(zhì)：銫鹽，如CsCl，Cs2SO4，CsBr,（二) 過濾,微生物發(fā)酵液中含有大量菌體、細(xì)胞或 細(xì)胞碎片以及殘余的固體培養(yǎng)基成分。 過濾就是將懸浮在發(fā)酵液中的固體顆粒與液體進(jìn)行分離的過程。 在過濾操作中，要求濾速快、濾液澄清，并且有高的收率。,1.原理：懸浮液通過過濾介質(zhì)時(shí)，固態(tài)顆粒與溶液分離。 2.類型： 澄清過濾 濾餅過濾,過濾介質(zhì)為硅藻土、砂、顆?；钚蕴?、玻璃珠、 塑料顆粒等。 當(dāng)懸浮液通過濾層時(shí)，固體顆粒被阻攔或吸 附在濾層的顆粒上，使濾液得以澄清。 適合于固體含量少于0.1

23、g/100mL、顆粒直徑在 5-100um的懸浮液的過濾分離，如河水、麥芽汁、酒 類和飲料等的澄清。,（1）澄清過濾：,過濾介質(zhì)為濾布，包括天然或合成纖維織布、金屬織布、玻璃纖維紙、合成纖維等無紡布。 當(dāng)懸浮液通過濾布時(shí)，固體顆粒被濾布阻攔而逐漸形成濾餅（濾渣）。當(dāng)濾餅至一定厚度時(shí)即起過濾作用，此時(shí)即可獲得澄清的濾液，這種方法叫做濾餅過濾。 在濾餅過濾中，懸浮液本身形成的濾餅起著主要的過濾作用，適合于固體含量大于0.1g/100mL的懸浮液的過濾分離。,（2）濾餅過濾：,廣泛應(yīng)用于培養(yǎng)基制備的過濾及霉菌、放線菌、 酵母菌和細(xì)菌 等多種發(fā)酵液的固液分離。適合 于固體含量1-10%的懸浮液的分離。

24、 優(yōu)點(diǎn)：過濾面積大，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，價(jià)格低，動(dòng)力消耗少， 對(duì)不同過濾特性的發(fā)酵液適應(yīng)性強(qiáng)。 缺點(diǎn)：不能連續(xù)操作，設(shè)備笨重，勞動(dòng)強(qiáng)度大，衛(wèi)生 條件差，非過濾的輔助時(shí)間較長(zhǎng)。,3. 常用過濾設(shè)備,（1）板框壓濾機(jī),（3）硅藻土過濾機(jī),硅藻土：較純二氧化硅礦石?；瘜W(xué)性能穩(wěn)定，具有極 大的吸附和滲透能力，是良好的介質(zhì)和助濾劑。 使用方法： a. 作為深層過濾介質(zhì)，以過濾含少量(01)懸 浮固形物的液體。硅藻土不規(guī)則粒子間形成許多曲折的毛細(xì)孔道，篩分和吸附作用除去懸浮液中的固體粒子。,(三)其他固液分離方法,又稱交叉過濾和十字流過濾，是一種 維持恒壓下高速過濾的技術(shù)。 其操作特點(diǎn)是使懸浮液在過濾介質(zhì)表面作切向

25、流動(dòng)， 利用流動(dòng)的剪切作用將過濾介質(zhì)表面的固體(濾餅)移走， 過濾速率就近似恒定。 (1)用泵循環(huán)使懸浮液流經(jīng)過濾介質(zhì)。 (2)在過濾介質(zhì)表面加以攪拌造成流動(dòng)，產(chǎn)生切向流。,1錯(cuò)流過濾（切向流過濾）,向水相中加入溶于水的某些高分子化合物（如葡聚糖、聚乙二醇等）后，形成密度不同的兩相 輕相中富含某種高分子化合物 重相中富含鹽類或另一種高分子化合物，從而達(dá)到分離和提純某種高分子化合物的目的。,2雙水相萃取,3吸附法,優(yōu)點(diǎn) 在于設(shè)備簡(jiǎn)單 能耗低 主要的問題是很難選擇合適的吸附劑，以保證目的產(chǎn)物不致于吸附而損失。,化學(xué)滲透法,優(yōu)點(diǎn)： (1) 對(duì)產(chǎn)物釋放具有一定選擇性。 (2) 細(xì)胞外形保持完整，碎片少

26、，漿液粘度 低，易 于固液分離和進(jìn)一步提取。 缺點(diǎn)： (1) 通用性差，某種試劑只能作用于某些特定類型的細(xì)胞。 (2) 時(shí)間長(zhǎng)，效率低，一般胞內(nèi)物質(zhì)釋放率不超過50 。 (3) 有些化學(xué)試劑有毒性，在其后的產(chǎn)物提取精制過程中 需設(shè)法分離除去。,層析技術(shù)（重點(diǎn)）,層析技術(shù)是利用混合物中各組分物理化學(xué)性質(zhì)的差異，使各組分在固定相與流動(dòng)相兩相中的分布程度不同，從而使各組分以不同的速度移動(dòng)而達(dá)到分離的技術(shù)。 四種基本的層析技術(shù)： 分配層析、吸附層析、離子交換層析和排阻層析,分配層析：以互補(bǔ)相溶而極性相異的為固定相和流動(dòng)相，其原理是通過各組分溶解度的不同進(jìn)行分離； 吸附層析：以吸附劑為固定相通過疏水力和

27、靜電引力來分離組份； 離子交換層析：以離子交換劑為固定相，通過離子鍵結(jié)合力來分離各組份； 排阻層析：以分子篩為固定相，通過排阻效應(yīng)來分離各組份。,第四章 細(xì)胞的破碎與分離,一、細(xì)胞壁結(jié)構(gòu),細(xì)胞的結(jié)構(gòu)：細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、細(xì)胞核 細(xì)胞破碎是指選用物理、化學(xué)、酶或機(jī)械的方法來破壞細(xì)胞壁或細(xì)胞膜。 其中細(xì)胞壁的破碎最為關(guān)鍵。主要是破碎細(xì)胞壁網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的共價(jià)鍵。,外層：甘露聚糖（約占30%，以-糖苷鍵聯(lián)結(jié)（并非所有酵母菌都有） 內(nèi)層：葡聚糖（約占30-40%，由D-葡萄糖以-糖苷鍵聯(lián)結(jié)） 中間層：蛋白質(zhì)（含6-8%，多為酶類）,細(xì)胞壁,a.細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)： 酵母細(xì)胞壁呈“三明治”結(jié)構(gòu),酵母細(xì)胞的細(xì)胞壁,b.壁外

28、成分： 有些菌壁外含有由多糖構(gòu)成的類似莢膜的結(jié)構(gòu)。 包括異多糖、甘露聚糖和淀粉類物質(zhì)。 c.細(xì)胞壁的少量組分脂類和幾丁質(zhì)（chitin)：為聚乙酰氨基葡萄糖 幾丁質(zhì)并不是所有的酵母菌中都有，其含量也因種而異。裂殖酵母一般不含幾丁質(zhì)，釀酒酵母含12%，有的假菌絲酵母含量超過了2%。,植物細(xì)胞壁,植物細(xì)胞壁由胞間層、初生壁、次生壁組成。 胞間層位于兩個(gè)相鄰細(xì)胞之間，為兩細(xì)胞共有的一層膜； 隨著細(xì)胞生長(zhǎng)，原生質(zhì)分泌纖維素、果膠質(zhì)及結(jié)構(gòu)蛋白，形成初生壁； 初生壁內(nèi)繼續(xù)積累纖維素和半纖維素，稱為次生壁。,二、細(xì)胞破碎動(dòng)力學(xué),細(xì)胞破碎的目的： 使細(xì)胞壁和細(xì)胞膜受到不同程度的破壞或破碎，增大其通透性，使細(xì)胞

29、內(nèi)的目標(biāo)產(chǎn)物得到釋放。,破碎率的評(píng)價(jià),直接計(jì)數(shù)： 直接對(duì)適當(dāng)稀釋后的樣品進(jìn)行計(jì)數(shù)，可以通過平板計(jì)數(shù)技術(shù)或在血球細(xì)胞器上用顯微鏡觀察來實(shí)現(xiàn)最終染色細(xì)胞的計(jì)數(shù)。 （1）計(jì)數(shù)器 （2）平板計(jì)數(shù) （3）顯微鏡,三、細(xì)胞破碎方法,主要采用各種機(jī)械破碎法和非機(jī)械法（化學(xué)破碎法），或機(jī)械破碎法和化學(xué)破碎法相結(jié)合。 機(jī)械破碎中細(xì)胞所受的機(jī)械作用力主要有壓縮力和剪切力。 化學(xué)破碎又稱化學(xué)滲透，利用化學(xué)或生化試劑（酶）改變細(xì)胞壁或細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，增大胞內(nèi)物質(zhì)的溶解速率；或者完全溶解細(xì)胞壁，形成原生質(zhì)體后，在滲透壓作用下使細(xì)胞膜破裂而釋放胞內(nèi)物質(zhì)。,（一）機(jī)械破碎 主要有高壓勻漿法、珠磨法、撞擊破碎和超聲波破碎 特點(diǎn)

30、：處理量大，破碎效率高，速度快。,細(xì)胞化學(xué)破碎法,細(xì)胞物理破碎法,1、高壓勻漿法,結(jié)構(gòu)和原理高壓勻漿器，由高壓泵和勻漿閥組成。,原理：細(xì)胞懸浮液在高壓作用下從閥座與閥之間的環(huán)隙高速噴出后撞擊到碰撞環(huán)上，細(xì)胞在受到高速撞擊作用后，急劇釋放到低壓環(huán)境，從而在撞擊力和剪切力的綜合作用下破碎。 操作壓力：5070MPa,2) 影響破碎率的因素,3) 適用范圍和操作注意點(diǎn) 酵母和大多數(shù)細(xì)菌細(xì)胞的破碎，料液細(xì)胞濃度可達(dá)到20%左右，團(tuán)狀和絲狀及小的G+菌不適。,壓力 循環(huán)操作次數(shù)溫度 細(xì)胞濃度 細(xì)胞生長(zhǎng)速率,2、珠磨法,1)研磨是常用的一種方法，它將細(xì)胞懸浮液與玻璃小珠、石英砂或氧化鋁一起快速攪拌或研磨，

31、使達(dá)到細(xì)胞的某種程度破碎。 適用大多數(shù)微生物的細(xì)胞破碎,將細(xì)胞在珠磨機(jī)中破碎被認(rèn)為是最有效的一種細(xì)胞物理破碎法。 破碎微生物細(xì)胞用的珠磨機(jī)有多種形式。,影響破碎效果的因素： 磨珠大小、攪拌速度、流量、細(xì)胞濃度、裝珠量、溫度等。要想獲得一個(gè)最大破碎率，要有較高的裝珠量、較高的攪拌速度、較小的磨珠直徑和適中的細(xì)胞濃度。 珠磨的細(xì)胞破碎效率隨細(xì)胞種類而異，隨攪拌速度和懸浮液停留時(shí)間的增大而增大。 珠磨法適用于絕大多數(shù)微生物細(xì)胞的破碎。,對(duì)于釋放胞內(nèi)酶而言，細(xì)胞完全破碎是不必要的，胞內(nèi)酶的釋放速率取決于其在細(xì)胞中的位置； 細(xì)胞濃度對(duì)破碎過程有著非常重要的影響，一般通過響應(yīng)曲面法分析優(yōu)化，得到一個(gè)最佳細(xì)

32、胞濃度和珠磨時(shí)間。,(3)噴霧撞擊破碎,細(xì)胞是彈性體，難于破碎，將其冷凍成為剛性球體，可以降低破碎難度。 懸浮液以噴霧狀高速凍結(jié)，形成微粒子，在高速載氣作用下送入破碎室，高速撞擊撞擊板，使凍結(jié)的細(xì)胞發(fā)生破碎。,聲頻高于1525KHZ的超聲波在高強(qiáng)度聲能輸入下，利用空化現(xiàn)象引起的沖擊波和剪切力使細(xì)胞破碎。 超聲波氣泡形成氣泡長(zhǎng)大破碎 超聲波的聲頻、聲能、處理時(shí)間、細(xì)胞濃度及菌種類型均影響破碎效率。 缺點(diǎn)：產(chǎn)生化學(xué)自由基團(tuán)氧化產(chǎn)物，且噪聲大。,4、超聲波破碎,4、其他類型機(jī)械破碎法,X-press法： 將濃縮的細(xì)胞懸浮液低溫冷卻形成冰晶，再施以高壓，高壓力沖擊造成冰晶磨損使細(xì)胞破裂。 微波法： 胞

33、內(nèi)物質(zhì)局部受熱，內(nèi)壓升高使細(xì)胞表面出現(xiàn)孔洞或裂紋，小分子能夠出入細(xì)胞，細(xì)胞仍保持其形態(tài)。此法處理蛋白質(zhì)分子三維結(jié)構(gòu)隨微波場(chǎng)方向變化而被破壞，蛋白質(zhì)分子纏繞成球，改變?nèi)芙庑?，便于包含體中重組蛋白的回收。,（二）化學(xué)和生物化學(xué)滲透,酸堿法 加入酸或堿調(diào)節(jié)溶液pH值，改變兩性物質(zhì)的電荷性，從而使蛋白質(zhì)之間或蛋白質(zhì)與其他物質(zhì)之間的相互作用力下降而易于溶解。 鹽法： 高濃度鹽可產(chǎn)生高的滲透壓，破壞細(xì)胞壁的通透性，使細(xì)胞失水，質(zhì)壁分離，造成細(xì)胞自身破裂釋放出內(nèi)容物（化學(xué)滲透學(xué)說）。,酶溶法 利用溶解細(xì)胞壁的酶處理菌體細(xì)胞，使細(xì)胞壁受到部分或完全破壞后，再利用滲透壓沖擊等方法進(jìn)一步破壞。 酶的主要作用是破壞

34、細(xì)胞壁上特殊的鍵，從而達(dá)到破碎目的。,誘發(fā)微生物產(chǎn)生過剩的溶胞酶或激發(fā)自身溶胞酶的活力，以達(dá)到細(xì)胞自溶的目的。 影響自溶過程的主要因素有溫度、時(shí)間、pH值、激活劑和細(xì)胞代謝途徑等。 缺點(diǎn)是：對(duì)不穩(wěn)定的微生物，易引起所需蛋白質(zhì)的變性，自溶后細(xì)胞懸浮液粘度增大，過濾速度下降。,（2）自溶法（Autolysis）,某些化學(xué)試劑，如有機(jī)溶劑、變性劑、表面活性劑、抗生素、金屬螯合劑等，可以改變細(xì)胞壁或膜的通透性（滲透性），從而使胞內(nèi)物質(zhì)有選擇地滲透出來。,4.化學(xué)滲透法（Chemical permeation）,該法取決于化學(xué)試劑的類型以及細(xì)胞壁膜的結(jié)構(gòu)與組成。,通用性差； 時(shí)間長(zhǎng)，效率低，一般胞內(nèi)物質(zhì)

35、釋放率不超過50%； 有些化學(xué)試劑有毒 。,化學(xué)滲透法優(yōu)點(diǎn)：,缺點(diǎn)：,對(duì)產(chǎn)物釋放有一定的選擇性，可使一些較小分子量的溶質(zhì)如多肽和小分子的酶蛋白透過，而核酸等大分子量的物質(zhì)仍滯留在胞內(nèi)； 細(xì)胞外形完整，碎片少，漿液粘度低，易于固液分離和進(jìn)一步提取。,變性劑法 加入變性劑，可削弱氫鍵作用，使胞內(nèi)產(chǎn)物相互之間的作用力減弱而易于釋放。如鹽酸胍。 溫和化學(xué)滲透劑處理 滲透劑一般采用分子量較小的非極性甘氨酸、丙氨酸，其更易滲透到細(xì)胞壁中，通過氫鍵、范德華力、靜電引力等化學(xué)親和力改變細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，從而改變細(xì)胞的通透性。同時(shí)能維持ADH的高活性，有廣泛的應(yīng)用前景。,（三）物理破碎法,凍融法 將細(xì)胞凍結(jié)后再融化。

36、破壞細(xì)胞膜的疏水鍵，增加親水性和通透性。同時(shí)由于細(xì)胞內(nèi)水結(jié)晶使細(xì)胞內(nèi)外產(chǎn)生濃度差，而導(dǎo)致滲透壓產(chǎn)生，并且細(xì)胞內(nèi)形成的冰晶也會(huì)破壞細(xì)胞壁。 低溫玻璃化法 低溫?cái)嗔咽菑某⒔Y(jié)構(gòu)上損傷細(xì)胞，使細(xì)胞壁、細(xì)胞膜等成分破壞。避免了高溫高壓、強(qiáng)酸強(qiáng)堿對(duì)營(yíng)養(yǎng)活性成分的破壞。,選擇細(xì)胞破碎方法的依據(jù)（重點(diǎn)）,機(jī)械法依靠專用設(shè)備，利用機(jī)械力的作用將細(xì)胞切碎，所以細(xì)胞碎片細(xì)小、胞內(nèi)物質(zhì)一般都全部釋放，故細(xì)胞漿液中核酸、雜蛋內(nèi)等含量高，料液黏度大，給固液分離帶來較大困難；但也具有很多優(yōu)點(diǎn)，如設(shè)備通用性強(qiáng)，破碎效率高，操作時(shí)間短，成本低，大多數(shù)方法都適合大規(guī)模工業(yè)化等。 非機(jī)械法是利用化學(xué)試劑或物理因素等來破壞局部的細(xì)

37、胞壁或提高壁的通透性，故細(xì)胞破碎率低胞內(nèi)物質(zhì)釋放的選擇性好，固液分離容易。但往往破碎率較低，耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)，某些方法成本高，一般僅適合小規(guī)模。,選擇細(xì)胞破碎方法的依據(jù),1）細(xì)胞的處理量：若具大規(guī)模應(yīng)用前景的，則采用機(jī)械法。若僅需實(shí)驗(yàn)室規(guī)模則選非機(jī)械法。 2）細(xì)胞壁的強(qiáng)度和結(jié)構(gòu)：細(xì)胞壁的強(qiáng)度除取決于網(wǎng)狀高聚物結(jié)構(gòu)的交聯(lián)程度外，還取決于構(gòu)成壁的聚合物種類和壁的厚度，如酵母和真菌的細(xì)胞壁與細(xì)菌相比，含纖維素和幾丁質(zhì)強(qiáng)度較高，故在選用高壓勻漿法時(shí)，后者就比較容易破碎。某些植物細(xì)胞纖維化程度大、纖維層厚、強(qiáng)度很高，破碎也較因難。 3）在機(jī)械法破碎中，破碎的難易程度還與細(xì)胞的形狀和大小有關(guān)，如高壓勻漿法對(duì)酵母

38、菌、大腸桿菌、巨大芽孢桿菌和黑曲霉等微生物細(xì)胞都能很好適用，但對(duì)某些高度分枝的微生物，由于會(huì)堵塞勻漿器閥而不能適用。,三、胞內(nèi)產(chǎn)物的溶解及復(fù)性,利用微生物大規(guī)模生產(chǎn)蛋白質(zhì)藥物或多肽，成為一個(gè)有效的蛋白質(zhì)生產(chǎn)新途徑，其中以大腸桿菌為宿主最為常用。 大腸桿菌中高效表達(dá)的蛋白質(zhì)常在胞內(nèi)聚集，形成不可溶、無生物活性的包含體。包含體必須經(jīng)過變性、復(fù)性才能獲得生物學(xué)功能。,1、包含體及其形成,包含體是聚集蛋白形成的濃密顆粒， 在適當(dāng)條件下，其中蛋白可達(dá)細(xì)胞中總蛋白的50%甚至更多。 包含體中主要是重組蛋白，幾乎不含宿主蛋白、核糖體組分或DNA、RNA片段。,包含體是蛋白的沉積與溶解的不平衡狀態(tài)形成的一種動(dòng)

39、力學(xué)結(jié)構(gòu)。 包含體蛋白的聚體是個(gè)可逆過程，蛋白質(zhì)水平的表達(dá)、蛋白質(zhì)形成錯(cuò)誤的二硫鍵、重組蛋白在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)，缺乏相應(yīng)的翻譯后加工功能，蛋白折疊過程中缺乏酶和輔助因子等是包含體形成的主要原因。,2、包含體的分離和溶解,包含體蛋白沒有生物活性，需要有效的溶解、折疊和純化工藝恢復(fù)其活性。 細(xì)胞破碎后，分離出來的包含體中主要是重組蛋白，也含有上些細(xì)胞碎片、膜蛋白、脂類、核酸及其他雜質(zhì)，需要進(jìn)行分離。包含體密度較大，用低速離心即可分離純化。,包含體中重組蛋白處于錯(cuò)誤折疊狀態(tài),主要靠非共價(jià)鍵連接,唯一的共價(jià)鍵是二硫鍵，因此要獲得正確的折疊首先要破壞二硫鍵和非共價(jià)鍵。 方式：蛋白質(zhì)解體變性，不溶的聚體成

40、為可溶性蛋白。強(qiáng)變性劑破壞次級(jí)鍵，引起構(gòu)象解體。去污劑與蛋白質(zhì)疏水區(qū)作用，避免蛋白形成疏水核心。還原劑有助于半胱氨酸維持還原態(tài)，可防止堿性條件下形成二硫鍵而聚集。螯合劑可防止金屬催化的半胱氨酸空氣氧化。,3、蛋白質(zhì)復(fù)性,變性劑去除或濃度降低后，蛋白質(zhì)會(huì)自發(fā)地從不穩(wěn)定狀態(tài)向穩(wěn)定狀態(tài)轉(zhuǎn)變，形成具有生物學(xué)活性的天然結(jié)構(gòu)。 復(fù)性步驟： 包含體自大腸桿菌中分離； 聚集蛋白的溶解； 溶解蛋白的折疊和純化。,（一）蛋白質(zhì)復(fù)性方法（重點(diǎn)）,1、稀釋與透析復(fù)性法 （1）稀釋復(fù)性： 將變性蛋白質(zhì)溶液直接加入到復(fù)性緩沖液中，蛋白質(zhì)周圍變性劑濃度降低，從而使蛋白質(zhì)折疊成天然構(gòu)象。 優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單、快速。是目前最常用的

41、蛋白質(zhì)復(fù)性方法之一。 缺點(diǎn)：變性蛋白質(zhì)會(huì)發(fā)生錯(cuò)誤折疊或重新形成聚集體，造成復(fù)性率下降。 改進(jìn)：將變性蛋白質(zhì)加入到復(fù)性液中。 現(xiàn)狀：需大容器、大量緩沖液和濃縮，成本較高，不適用于大規(guī)模。,（2）透析復(fù)性： 將變性蛋白質(zhì)裝入透析袋中，對(duì)復(fù)性緩沖液進(jìn)行透析。也是基于去除變性劑的機(jī)理使蛋白質(zhì)復(fù)性。 特點(diǎn)：透析過程主要是擴(kuò)散作用，需時(shí)間較長(zhǎng)，易造成蛋白質(zhì)聚集。 改進(jìn)：緩慢透析法，使變性劑濃度下降連續(xù)，不會(huì)出現(xiàn)變性劑濃度突變，可減少蛋白質(zhì)復(fù)性中產(chǎn)生沉淀，提高活性蛋白效率。,3色譜復(fù)性技術(shù) （1）凝膠過濾色譜 也稱體積排阻色譜，可實(shí)現(xiàn)變性劑去除與蛋白質(zhì)復(fù)性同時(shí)進(jìn)行。 采用適宜大小的凝膠過濾體系，根據(jù)折疊中間

42、體的半徑，通過捕獲其不同形式將蛋白分子相互分開，減少中間體的相互作用，提高復(fù)性率。梯度緩沖液可有效增加活性蛋白質(zhì)得率。,（2）吸附色譜 利用色譜固相介質(zhì)對(duì)變性蛋白的吸附作用，將其固定在介質(zhì)表面，使蛋白質(zhì)分子彼此分開。 疏水作用基質(zhì)有提高復(fù)性率的效果。疏水作用基質(zhì)與變性蛋白大量暴露疏水基團(tuán)之間有疏水作用，能進(jìn)一步降低聚集。,3、反膠束萃取復(fù)性法 將變性蛋白萃取到反膠束中，達(dá)到蛋白質(zhì)分子彼此分開，從而提高蛋白質(zhì)的復(fù)性率。 變性劑存在會(huì)抑制變性蛋白萃取過程。,第五章 沉淀分離,一 概 述,1、定義 沉淀分離法是利用沉淀反應(yīng)有選擇地沉淀某些離子，而其它離子則留于溶液中從而達(dá)到分離的目的。它發(fā)生的必要條

43、件是溶液體系對(duì)某些離子是飽和的。 沉降：指當(dāng)懸浮液靜置時(shí)，密度較大的固體顆粒在重力的作用下逐漸下沉，這一過程成為沉降。 2、沉淀分離法分類 沉淀法主要包括：沉淀分離法和共沉淀分離法 。 兩種方法的區(qū)別主要是：沉淀分離法主要使用于常量組分的分離（毫克數(shù)量級(jí)以上或一般0.01mol/L)；而共沉淀分離法主要使用于痕量組分的分離和富集（小于1mg/mL )。,3、共沉淀現(xiàn)象及其分類,1） 共沉淀現(xiàn)象 當(dāng)沉淀從溶液中析出時(shí)，溶液中的某些原本可溶的組分被沉淀載帶而混雜于沉淀中，這種現(xiàn)象稱為共沉淀現(xiàn)象。,共沉淀現(xiàn)象常使沉淀被污染，是重量分析中誤差的主要來源,但是，正是利用共沉淀劑對(duì)某些微痕量組分的定量沉淀

44、能力，產(chǎn)生了在分離和富集上有廣泛應(yīng)用的共沉淀分離法。,2） 共沉淀現(xiàn)象的分類,按其機(jī)理的不同可分為：結(jié)晶共沉淀和吸附共沉淀 結(jié)晶共沉淀： 微量物質(zhì)的離子、分子或小的晶格單位取代沉淀物晶格上的常量物質(zhì)，并進(jìn)入到晶格內(nèi)部而從液相轉(zhuǎn)移到固相的一種現(xiàn)象。 (選擇性比較高) 吸附共沉淀： 微量物質(zhì)吸附在常量物質(zhì)沉淀表面而從溶液相轉(zhuǎn)移到固相的一種現(xiàn)象。（選擇性不高）,4、共沉淀分離法,1） 定義 共沉淀分離法是加入某種離子與沉淀劑生成沉淀，加入的某種離子作為載體，將痕量組分定量地沉淀下來，然后將沉淀分離（溶解在少量溶劑中、灼燒等方法），以達(dá)到分離和富集的目的的一種分析方法。,2） 共沉淀劑要求及分類 (1

45、) 沉淀劑要求 要求對(duì)欲富集的痕量組分回收率高。 要求共沉淀劑不干擾待富集組分的測(cè)定。,1） 氫氧化物沉淀： 如：Fe(OH)3, Al(OH)3, MnO(OH)2等，主要利用表面吸附作用使痕量金屬離子共沉淀。 2） 硫化物沉淀： 如：PbS、HgS等，共沉淀是除吸附、吸留作用 3）某些晶形沉淀： 如：BaSO4，SrSO4，SrCO3等，可與生成相似晶格的離子形成混晶（如BaSO4-RaSO4、BaSO4-PbSO4等）而共沉淀。,(一）無機(jī)共沉淀劑,(2) 沉淀劑按使用載體類型不同分： 無機(jī)共沉淀劑 有機(jī)共沉淀劑,（1）熱飽和溶液冷卻（等溶劑結(jié)晶），適用于溶解度隨溫度升高而增加的體系；同

46、時(shí)，溶解度隨溫度變化的幅度要適中； （2）部分溶劑蒸發(fā)法（等溫結(jié)晶法），適用于溶解度隨溫度降低變化不大的體系，或隨溫度升高溶解度降低的體系； （3）真空蒸發(fā)冷卻法，使溶劑在真空下迅速蒸發(fā)，并結(jié)合絕熱冷卻，是結(jié)合冷卻和部分溶劑蒸發(fā)兩種方法的一種結(jié)晶方法。（ 4）化學(xué)反應(yīng)結(jié)晶，加入反應(yīng)劑產(chǎn)生新物質(zhì)，當(dāng)該新物質(zhì)的溶解度超過飽和溶解度時(shí)，即有晶體析出。,飽和溶液形成的方法（重點(diǎn)）,1、概念 由于處于微量和低濃度狀態(tài)下的放射性物質(zhì)的使用，使得實(shí)驗(yàn)操作很困難，會(huì)帶來非正常實(shí)驗(yàn)誤差，因此常加入非放射性物質(zhì)載體和反載體來克服之。 載體；反載體；體積分配；表面分配；回收率；富集因素,二 結(jié)晶共沉淀,1）載體(C

47、arrier)： 沉淀微量組分時(shí)，往往需要加入某常量組分，當(dāng)常量組分沉淀時(shí)，微量組分也一起被沉淀下來，加入的常量組分起著載帶微量組分的作用，因此稱為載體。 若二者同位素關(guān)系，則稱為同位素載體否則稱為非同位素載體。（例如Ca2+及草酸沉淀劑可使45Ca2+沉淀析出，226Ra2+會(huì)隨Ba2+與SO42-形成Ba(Ra)SO4沉淀，Ba為Ra2+非同位素載體。,6） 包藏（吸留或包埋） 沉淀速度過快，表面吸附的雜質(zhì)來不及離開沉淀表面就被隨后沉積下來的沉淀所覆蓋，包埋在沉淀內(nèi)部，這是一種因吸附而留在沉淀內(nèi)部的共沉淀現(xiàn)象。 減少或消除方法： 包藏是在結(jié)晶內(nèi)部，不能用洗滌方法除去，可通過陳化或重結(jié)晶的方

48、法予以減少。 7） 后沉淀(繼沉淀)現(xiàn)象 溶液中被測(cè)組分析出沉淀之后在與母液放置過程中，溶液中其它本來難以析出沉淀的組分（雜質(zhì)離子)在該沉淀表面繼續(xù)沉積的現(xiàn)象 注：后沉淀經(jīng)加熱、放置后會(huì)更加嚴(yán)重 消除方法： 縮短沉淀與母液的共置時(shí)間,4、重結(jié)晶和分級(jí)結(jié)晶,1） 重結(jié)晶： 在第一次結(jié)晶以后，經(jīng)固液分離，尾液棄去，結(jié)晶固體重新溶解溶液后，在同樣條件下再次結(jié)晶沉淀。以此類推，這種結(jié)晶溶解再結(jié)晶的過程叫多次結(jié)晶。 優(yōu)點(diǎn)：經(jīng)多次結(jié)晶，提高微量組分和常量組分之間的分離效率 缺點(diǎn)：微量組分損失量大一些。 2） 分級(jí)結(jié)晶： 每次結(jié)晶后含有微量組分的尾液蒸發(fā)后重新結(jié)晶，其操作流程類似于分液漏斗模擬的逆流萃取。

49、優(yōu)點(diǎn)及缺點(diǎn)： 由于對(duì)每次結(jié)晶后尾液進(jìn)行了利用，從避免了微量組分的損失,三 吸附共沉淀,吸附：利用吸附劑對(duì)液體或氣體中某一組分具有選擇性吸附的能力，使其富集在吸附劑表面的過程。 吸附共沉淀由于沉淀或結(jié)晶表面對(duì)其它溶質(zhì)的 吸附造成的共沉淀。 吸附共沉淀能力的強(qiáng)弱，與載體沉淀的組成、形 成方式、表面帶電性質(zhì)有關(guān)，還與被吸附物質(zhì)本 身性質(zhì)及外界電解質(zhì)有關(guān)。,四 結(jié)晶動(dòng)力學(xué) 研究結(jié)晶物質(zhì)的結(jié)晶形成方式和過程以及結(jié)晶速率對(duì)時(shí)間、溫度和分子結(jié)構(gòu)等影響因素的依賴關(guān)系。,結(jié)晶過程概括為以下幾步: (1) 溶液達(dá)到過飽和； (2) 晶核生成； (3) 晶核生長(zhǎng)形成晶體。,晶體(沉淀)的形成過程,* 均相成核：構(gòu)晶

50、離子在過飽和溶液中，通過離子的締合 作用，自發(fā)形成晶核。 * 異相成核：溶液中混有的固體微粒，在沉淀過程中起著 晶種的作用，誘導(dǎo)沉淀的形成。,鹽析沉淀法 有機(jī)溶劑沉淀 等電點(diǎn)沉淀法 成鹽沉淀法 高分子聚合物沉淀 選擇性變性沉淀法,五、蛋白質(zhì)沉淀,（一） 鹽析沉淀法,鹽析法： 在高濃度中性鹽存在下，欲分離物質(zhì)在中性鹽水溶液中的溶解度降低而產(chǎn)生沉淀。 鹽析：利用不同物質(zhì)在高濃度的鹽溶液中溶解度的差異，向溶液中加入一定量的中性鹽，使原溶解的物質(zhì)沉淀析出的分離技術(shù)。,（一）基本原理 蛋白質(zhì)的溶解特性取決于其組成、構(gòu)象、周圍環(huán)境的物理化學(xué)性質(zhì)以及溶劑的可利用度。 這些性質(zhì)就本質(zhì)而言是水分子間的氫鍵和蛋白

51、質(zhì)表面所暴露出的N、O原子的相互作用，所以易受溶液溫度、pH值、介電常數(shù)和離子強(qiáng)度等參數(shù)的影響。,蛋白質(zhì)在自然環(huán)境中通常是可溶的， 表面：大部分是親水基團(tuán) 內(nèi)部：大部分是疏水基團(tuán),蛋白質(zhì)呈穩(wěn)定的分散狀態(tài),兩性物質(zhì)，一定pH下表面帶有一定的 電荷，靜電斥力作用使分子間相互排斥,蛋白質(zhì)周圍的水分子有序排列，在表面形成水化膜，這一層能保護(hù)蛋白質(zhì)粒子避免因碰撞而聚沉。,當(dāng)向蛋白質(zhì)溶液中加入中性鹽時(shí)：,低鹽-鹽溶(低鹽情況下，隨著中性鹽離子強(qiáng)度的增加，蛋白質(zhì)溶解度增大),高鹽-鹽析(高鹽濃度時(shí)，蛋白質(zhì)溶解度隨之減小),鹽離子部分中和蛋白質(zhì)的電性，使分子間排斥作用減弱,中性鹽的親水性比蛋白質(zhì)大，鹽離子在水

52、中發(fā)生水化作用從而使蛋白質(zhì)脫去水化膜，暴露出疏水區(qū)域,蛋白質(zhì)在水中的溶解度不僅與中性鹽離子的濃度有關(guān)，還與離子所帶電荷數(shù)有關(guān)，高價(jià)離子影響更顯著。 通常用離子強(qiáng)度表示對(duì)鹽析的影響。,（二）無機(jī)鹽的選擇,在蛋白質(zhì)鹽析中，常用的鹽析劑有(NH4)2SO4, Na2SO4， MgSO4，NaH2PO4，NaCl， Na3PO4, K3PO4。,(NH4)2SO4原因,廉價(jià) 在水中溶解度大，且溶解度隨溫度變化小，低溫下仍具有較大的溶解度 對(duì)大多數(shù)蛋白質(zhì)的活力無損害,鹽析效果：陰離子 陽離子 尤其以高價(jià)陰離子更為明顯。,陽離子對(duì)鹽析效果的影響： Al3+ H+ Ba2+ Sr2+ Ca2+ Cs+ Rb

53、+ NH4+ K+ Na+ Li+,（三）影響鹽析的各種因素,無機(jī)鹽的加入量 蛋白質(zhì)的濃度 溫度 pH 操作方式,3.溫度的影響,低鹽濃度：溫度升高，溶解度升高 高鹽濃度：溫度升高，溶解度降低,溫度適當(dāng)提高有利于蛋白質(zhì)沉淀。 高溫容易導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性。 蛋白質(zhì)鹽析一般在室溫下進(jìn)行，某些溫度敏感性的蛋白質(zhì)鹽析最好在低溫下進(jìn)行。,4.pH的影響 蛋白質(zhì)在pI時(shí)的溶解度最小，最容易從溶液中析出，因此選擇在被鹽析的蛋白質(zhì)的pI附近。 耗鹽少，蛋白質(zhì)收率也高,6.鹽析法的優(yōu)缺點(diǎn),（1）優(yōu)點(diǎn)： 室溫下沉淀物在硫酸銨鹽析溶液中長(zhǎng)時(shí)間放置不會(huì)失活，且無機(jī)鹽不容易引起蛋白質(zhì)變性失活； 非蛋白的雜質(zhì)很少被夾帶沉淀；

54、 適用范圍廣，幾乎所有蛋白質(zhì)和酶都能采用 設(shè)備簡(jiǎn)單，操作方便。,（2）缺點(diǎn)： 沉淀物中含有大量鹽析劑 硫酸銨容易分解產(chǎn)生氨的惡臭味，產(chǎn)品不能直接用于醫(yī)藥上,鹽析法可以作為初始的提取方法，再與多種精制手段結(jié)合起來，如采用超濾、凝膠色譜、透析等方法將無機(jī)鹽去除，就可制得高純度產(chǎn)品。,（二）有機(jī)溶劑沉淀法,在蛋白質(zhì)等生物大分子的水溶液中加入一定量親水性的有機(jī)溶劑，能顯著降低蛋白質(zhì)等生物大分子的溶解度，使其沉淀析出。 不同蛋白質(zhì)沉淀時(shí)所需有機(jī)溶劑的濃度不同，因此調(diào)節(jié)有機(jī)溶劑的濃度，可以使混合物中的蛋白質(zhì)分段析出，達(dá)到分離純化的目的。 不僅適于蛋白質(zhì)的分離純化，還常用于酶、核酸、多糖等的分離純化。,（一

55、）基本原理,加入有機(jī)溶劑后，會(huì)使系統(tǒng)（水和有機(jī)溶劑的混合液）的介電常數(shù)減小，而使溶質(zhì)分子（如蛋白質(zhì)分子）之間的靜電引力增加，從而促使它們互相聚集，并沉淀出來。 水溶性有機(jī)溶劑的親水性強(qiáng)，它會(huì)搶奪本來與溶質(zhì)結(jié)合的自由水，使其表面的水化層破壞，導(dǎo)致溶質(zhì)分子之間的相互作用增大而發(fā)生凝聚，沉淀析出。,常用于生物大分子沉淀的有機(jī)溶劑： 甲醇、乙醇、異丙醇、丙酮等， 其中乙醇是工業(yè)上最常用的,（二）影響沉淀效果的因素,溫度 pH 中性鹽濃度 金屬離子,1.溫度的影響,有機(jī)溶劑存在下，多數(shù)蛋白質(zhì)的溶解度隨溫度降低而顯著的減小，因此低溫下（最好低于0oC）沉淀得完全，有機(jī)溶劑用量可減少。 實(shí)際操作中： 有機(jī)溶

56、劑與水混合時(shí)，會(huì)放出大量的熱量，使溶液的溫度顯著升高，從而增加對(duì)蛋白質(zhì)的變性作用。,整個(gè)操作過程應(yīng)在低溫下進(jìn)行。 具體操作時(shí)： 將待分離溶液和有機(jī)溶劑分別進(jìn)行預(yù)冷： 蛋白質(zhì)溶液冷卻到0oC左右， 有機(jī)溶劑預(yù)冷到-10oC以下 為避免溫度驟然升高損失蛋白質(zhì)活力，操作時(shí)應(yīng)不斷攪拌、少量多次加入。 使沉淀在低溫下短時(shí)間處理后即進(jìn)行過濾或離心分離，接著真空抽去剩余溶液或?qū)⒊恋砣苋氪罅烤彌_溶液中以稀釋有機(jī)溶劑，旨在減少有機(jī)溶劑與目的物的接觸。,溫度的控制應(yīng)根據(jù)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性而不同，穩(wěn)定性較差的物質(zhì)，冷卻至低溫是必要的；但對(duì)于穩(wěn)定性較好的物質(zhì)，如淀粉酶，溫度不需過低，10-15oC。,2.pH的影響,在等

57、電點(diǎn)時(shí)蛋白質(zhì)溶解度最低，因此有機(jī)溶劑沉淀時(shí)溶液pH多控制在蛋白質(zhì)等電點(diǎn)附近。 pH的控制必須考慮蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性： 某些酶的等電點(diǎn)在pH4-5之間，比其穩(wěn)定的pH范圍低，因此pH應(yīng)首先滿足蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的條件。 控制pH時(shí)應(yīng)使大多數(shù)蛋白質(zhì)分子帶相同電荷，不要讓目的物與主要雜質(zhì)分子帶相反電荷，以免共沉。,3.無機(jī)鹽的離子強(qiáng)度,少量的中性鹽能夠減少蛋白質(zhì)變性。在有機(jī)溶劑沉淀時(shí)中性鹽濃度以0.01-0.05 mol/L為宜。 常用中性鹽: 乙酸鈉、乙酸銨、氯化鈉 中性鹽濃度較高時(shí)（0.2 mol/L以上），由于鹽溶作用會(huì)增大蛋白質(zhì)的溶解度，此時(shí)需增加有機(jī)溶劑的用量才能使沉淀析出。 對(duì)鹽析后的上清液或沉淀

58、物，如進(jìn)一步用有機(jī)溶劑沉淀法純化，必須先脫鹽。,4.金屬離子,一些金屬離子，如Ca2+、Zn2+能與蛋白質(zhì)結(jié)合形成復(fù)合物，使蛋白質(zhì)溶解度大大降低而不影響生物活性，有利于沉淀形成，并減少有機(jī)溶劑用量。 使用時(shí)避免能與這些金屬離子形成難溶鹽的陰離子存在（如磷酸根）。 常用的鋅鹽：醋酸鋅或硫酸鋅,5.有機(jī)溶劑沉淀法的優(yōu)缺點(diǎn),（1）優(yōu)點(diǎn)： 乙醇等有機(jī)溶劑易揮發(fā)除去，不會(huì)殘留于成品中，產(chǎn)品更純凈（不需要脫鹽處理）； 有機(jī)溶劑密度低，沉淀物與母液間的密度差較大，分離容易，適于用離心分離收集沉淀物。,（2）缺點(diǎn)： 容易使蛋白質(zhì)變性，操作需要在低溫下進(jìn)行，使用上有一定的局限； 采用大量有機(jī)溶劑，成本較高。 為

59、節(jié)省用量，通常將蛋白質(zhì)溶液適當(dāng)濃縮，并回收溶劑。 有機(jī)溶劑易燃易爆，工業(yè)生產(chǎn)上車間和設(shè)備都應(yīng)有防護(hù)措施。,等電點(diǎn)沉淀法 成鹽沉淀法 高分子聚合物沉淀 選擇性變性沉淀法,（三） 其他沉淀方法,1.等電點(diǎn)沉淀法 兩性物質(zhì)在pH=pI時(shí)，分子表面凈電荷為零，分子間靜電排斥作用減弱，因此吸引力增大，能相互聚集，發(fā)生沉淀。 不同的兩性物質(zhì)，pI不同，如不同蛋白質(zhì)。根據(jù)這一特性，用依次改變?nèi)芤簆H的方法可將不同的蛋白質(zhì)分別沉淀析出，達(dá)到分離純化的目的。,只適用于水化程度不大、在pI時(shí)溶解度很低的兩性物質(zhì)，如酪蛋白。 對(duì)于親水性很強(qiáng)的兩性物質(zhì)，在pI及pI附近仍有相當(dāng)?shù)娜芙舛?，用該法沉淀不完全，而且許多生物分子的pI很接近，因此很少單獨(dú)使用。 往往與鹽析法、有機(jī)溶劑沉淀法或其他沉淀方法結(jié)合起來。 采用該法時(shí)必須注意：