2.大腸菌群[課堂資料]

1、食品中大腸菌群的測定,1,業(yè)界薈萃,一 大腸菌群的概念及組成,大腸菌群的概念 大腸菌群系指一群需氧及兼性厭氧，在37能分解乳糖產(chǎn)酸、產(chǎn)氣的革蘭氏陰性無芽胞桿菌。 大腸菌群的組成 大腸埃希氏菌屬、檸檬酸桿菌屬、產(chǎn)氣克雷伯氏菌屬和陰溝腸桿菌。,2,業(yè)界薈萃,二、大腸菌群的測定意義,1、糞便污染的指標(biāo)菌： 大腸菌群或大腸桿菌 2、以大腸菌群作為糞便指標(biāo)菌原因 （1）在糞便中數(shù)量最大； （2）在外環(huán)境中存活的時(shí)間與致病菌大體相同； （3）檢測方法簡便容易。,3,業(yè)界薈萃,二、大腸菌群的測定意義,3、大腸菌群的測定意義 （1）判斷食品中否受到糞便污染。 （2）有利于控制腸道傳染病的發(fā)生和流行。 （3）有

2、利于控制食品在生產(chǎn)加工、運(yùn)輸、保存等過程中的衛(wèi)生狀況。,4,業(yè)界薈萃,三、大腸菌群的生物學(xué)特性,1.形態(tài)與染色：革蘭氏染色陰性，無芽胞桿菌。 2.發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣 3.培養(yǎng)特性：在瓊脂上的典型菌落:呈深紫黑色或中心深紫色，圓形，稍凸起，邊緣整齊，表面光滑，常有金屬光澤； 在麥康凱瓊脂上的典型菌落:呈桃紅色或中心桃紅、圓形，扁平，光滑濕潤。,5,業(yè)界薈萃,糖發(fā)酵試驗(yàn),大腸桿菌革蘭氏染色鏡下照片,6,業(yè)界薈萃,大腸桿菌在伊紅美藍(lán)瓊脂平板上的特征,7,業(yè)界薈萃,麥康凱瓊脂平板照片,8,業(yè)界薈萃,中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.32010,食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸菌群計(jì)數(shù) 201

3、0-03-26 發(fā)布2010-06-01 實(shí)施 中 華 人 民 共 和 國 衛(wèi) 生 部 發(fā)布,9,業(yè)界薈萃,前言,本標(biāo)準(zhǔn)代替GB/T 4789.3-2008食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸菌群計(jì)數(shù)。 本標(biāo)準(zhǔn)與GB/T 4789.3-2008相比，主要修改如下： 修改了標(biāo)準(zhǔn)的中英文名稱； “第二法大腸菌群平板計(jì)數(shù)法”的平板菌落數(shù)的選擇范圍修改為“15 CFU150 CFU”； 刪除了“第三法大腸菌群PetrifilmTM 測試片法”。 本標(biāo)準(zhǔn)的附錄A、附錄B為規(guī)范性附錄。 本標(biāo)準(zhǔn)所代替標(biāo)準(zhǔn)的歷次版本發(fā)布情況為： GB 4789.3-1984、GB 4789.3-1994、GB /T 4789.3-200

4、3、GB /T 4789.3-2008。,10,業(yè)界薈萃,食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸菌群計(jì)數(shù),1 范圍 本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中大腸菌群（Coliforms）計(jì)數(shù)的方法。 本標(biāo)準(zhǔn)適用于食品中大腸菌群的計(jì)數(shù)。 2 術(shù)語和定義 2.1 大腸菌群coliforms 在一定培養(yǎng)條件下能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣的需氧和兼性厭氧革蘭氏陰性無芽胞桿菌。 2.2 最可能數(shù)most probable number，MPN 基于泊松分布的一種間接計(jì)數(shù)方法。,11,業(yè)界薈萃,3 設(shè)備和材料,除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下： 3.1 恒溫培養(yǎng)箱：36 1 。 3.2 冰箱：2 5 。 3.3

5、恒溫水浴箱：46 1 。 3.4 天平：感量0.1 g。 3.5 均質(zhì)器。 3.6 振蕩器。 3.7 無菌吸管：1 mL（具0.01 mL 刻度）、10 mL（具0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸頭。 3.8 無菌錐形瓶：容量500 mL。 3.9 無菌培養(yǎng)皿：直徑90 mm。 3.10 pH 計(jì)或pH 比色管或精密pH 試紙。 3.11 菌落計(jì)數(shù)器。,12,業(yè)界薈萃,4 培養(yǎng)基和試劑,4.1 月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（Lauryl Sulfate Tryptose，LST）肉湯：見附錄A 中A.1。 4.2 煌綠乳糖膽鹽（Brilliant Green Lactose Bile，BGLB）肉湯

6、：見附錄A 中A.2。 4.3 結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（Violet Red Bile Agar，VRBA）：見附錄A 中A.3。 4.4 磷酸鹽緩沖液：見附錄A 中A.4。 4.5 無菌生理鹽水：見附錄A 中A.5。 4.6 無菌1 mol/L NaOH：見附錄A 中A.6。 4.7 無菌1 mol/L HCl：見附錄A 中A.7。,13,業(yè)界薈萃,第一法 大腸菌群MPN 計(jì)數(shù)法,5 檢驗(yàn)程序 大腸菌群MPN計(jì)數(shù)的檢驗(yàn)程序見下圖1。,14,業(yè)界薈萃,15,業(yè)界薈萃,6 操作步驟,6.1 樣品的稀釋 6.1.1 固體和半固體樣品：稱取25 g 樣品,放入盛有225 mL 磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的

7、無菌均質(zhì)杯內(nèi),8000 r/min10000 r/min 均質(zhì)1 min2 min,或放入盛有225 mL 磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1 min2 min，制成1:10 的樣品勻液。 6.1.2 液體樣品：以無菌吸管吸取25 mL 樣品置盛有225 mL 磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌錐形瓶（瓶內(nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無菌玻璃珠）中，充分混勻，制成1:10 的樣品勻液。 6.1.3 樣品勻液的pH 值應(yīng)在6.57.5 之間，必要時(shí)分別用1 mol/L NaOH 或1 mol/L HCl 調(diào)節(jié)。,16,業(yè)界薈萃,6.1.4 用1 mL 無菌吸管或微量移液器吸取1:10 樣品勻

8、液1 mL，沿管壁緩緩注入9 mL 磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌試管中（注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面），振搖試管或換用1 支1 mL 無菌吸管反復(fù)吹打，使其混合均勻，制成1:100 的樣品勻液。 6.1.5 根據(jù)對(duì)樣品污染狀況的估計(jì)，按上述操作，依次制成十倍遞增系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋1 次，換用1 支1 mL 無菌吸管或吸頭。從制備樣品勻液至樣品接種完畢，全過程不得超過15 min。,17,業(yè)界薈萃,6.2 初發(fā)酵試驗(yàn),每個(gè)樣品，選擇3個(gè)適宜的連續(xù)稀釋度的樣品勻液（液體樣品可以選擇原液），每個(gè)稀釋度接種3管月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LST）肉湯，每管接種1mL（如接種量超過1 mL，則

9、用雙料LST肉湯），361 培養(yǎng)24 h2 h，觀察倒管內(nèi)是否有氣泡產(chǎn)生，24 h2 h產(chǎn)氣者進(jìn)行復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)，如未產(chǎn)氣則繼續(xù)培養(yǎng)至48 h2 h，產(chǎn)氣者進(jìn)行復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)。未產(chǎn)氣者為大腸菌群陰性。,18,業(yè)界薈萃,6.3 復(fù)發(fā)酵試驗(yàn),用接種環(huán)從產(chǎn)氣的LST肉湯管中分別取培養(yǎng)物1環(huán)，移種于煌綠乳糖膽鹽肉湯（BGLB）管中，36 1培養(yǎng)48 h2 h，觀察產(chǎn)氣情況。產(chǎn)氣者，計(jì)為大腸菌群陽性管。,19,業(yè)界薈萃,6.4 大腸菌群最可能數(shù)（MPN）的報(bào)告,按6.3確證的大腸菌群LST陽性管數(shù)，檢索MPN表（見附錄B），報(bào)告每g（mL）樣品中大腸菌群的MPN值。,20,業(yè)界薈萃,第二法 大腸菌群平板計(jì)數(shù)法,

10、7 檢驗(yàn)程序 大腸菌群平板計(jì)數(shù)法的檢驗(yàn)程序見圖2。,21,業(yè)界薈萃,8 操作步驟,8.1 樣品的稀釋 按6.1進(jìn)行。 8.2 平板計(jì)數(shù) 8.2.1 選取2個(gè)3個(gè)適宜的連續(xù)稀釋度, 每個(gè)稀釋度接種2個(gè)無菌平皿，每皿1 mL。同時(shí)取1 mL生理鹽水加入無菌平皿作空白對(duì)照。 8.2.2 及時(shí)將15 mL20 mL冷至46 的結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）約傾注于每個(gè)平皿中。小心旋轉(zhuǎn)平皿，將培養(yǎng)基與樣液充分混勻，待瓊脂凝固后，再加3 mL4 mLVRBA覆蓋平板表層。翻轉(zhuǎn)平 板，置于36 1 培養(yǎng)18 h24 h。,22,業(yè)界薈萃,8.3 平板菌落數(shù)的選擇 選取菌落數(shù)在15 CFU150 CFU 之

11、間的平板，分別計(jì)數(shù)平板上出現(xiàn)的典型和可疑大腸菌群菌落。 典型菌落為紫紅色，菌落周圍有紅色的膽鹽沉淀環(huán)，菌落直徑為0.5 mm 或更大。 8.4 證實(shí)試驗(yàn) 從VRBA 平板上挑取10 個(gè)不同類型的典型和可疑菌落，分別移種于BGLB 肉湯管內(nèi)，36 1 培養(yǎng)24 h48 h，觀察產(chǎn)氣情況。凡BGLB 肉湯管產(chǎn)氣，即可報(bào)告為大腸菌群陽性。,23,業(yè)界薈萃,8.5 大腸菌群平板計(jì)數(shù)的報(bào)告,經(jīng)最后證實(shí)為大腸菌群陽性的試管比例乘以8.3中計(jì)數(shù)的平板菌落數(shù)，再乘以稀釋倍數(shù)，即為每g（mL）樣品中大腸菌群數(shù)。 例：10-4樣品稀釋液1 mL，在VRBA平板上有100個(gè)典型和可疑菌落，挑取其中10個(gè)接種BGLB

12、肉湯管，證實(shí)有6個(gè)陽性管，則該樣品的大腸菌群數(shù)為：1006/10104/g（mL）=6.0105CFU/g（mL）。,24,業(yè)界薈萃,附錄A（規(guī)范性附錄）培養(yǎng)基和試劑,A.1 月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LST）肉湯 A.1.1 成分 胰蛋白胨或胰酪胨 20.0 g 氯化鈉 5.0 g 乳糖 5.0 g 磷酸氫二鉀（K2HPO4） 2.75 g 磷酸二氫鉀（KH2PO4） 2.75 g 月桂基硫酸鈉 0.1 g 蒸餾水 1 000 mL pH 6.80.2 A.1.2 制法 將上述成分溶解于蒸餾水中，調(diào)節(jié) pH。分裝到有玻璃小倒管的試管中，每管10 mL。121 高壓 滅菌15 min。,25,業(yè)界

13、薈萃,A.2 煌綠乳糖膽鹽（BGLB）肉湯,A.2.1 成分 蛋白胨 10.0 g 乳糖 10.0 g 牛膽粉（oxgall或oxbile）溶液 200 mL 0.1%煌綠水溶液 13.3 mL 蒸餾水 800 mL pH 7.20.1 A.2.2 制法 將蛋白胨、乳糖溶于約500 mL蒸餾水中，加入牛膽粉溶液200 mL（將20.0 g脫水牛膽粉溶于200 mL 蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH至7.07.5），用蒸餾水稀釋到975 mL，調(diào)節(jié)pH，再加入0.1%煌綠水溶液13.3 mL， 用蒸餾水補(bǔ)足到1 000 mL，用棉花過濾后，分裝到有玻璃小倒管的試管中，每管10 mL。121 高壓滅 菌15 m

14、in。,26,業(yè)界薈萃,A.3 結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）,A.3.1 成分 蛋白胨 7.0 g 酵母膏 3.0 g 乳糖 10.0 g 氯化鈉 5.0 g 膽鹽或3號(hào)膽鹽 1.5 g 中性紅 0.03 g 結(jié)晶紫 0.002 g 瓊脂 15 g18 g 蒸餾水 1 000 mL pH 7.40.1A.3.2 制法 將上述成分溶于蒸餾水中，靜置幾分鐘，充分?jǐn)嚢?，調(diào)節(jié)pH。煮沸2 min，將培養(yǎng)基冷卻至45 50 傾注平板。使用前臨時(shí)制備，不得超過3 h。,27,業(yè)界薈萃,A.4 磷酸鹽緩沖液,A.4.1 成分 磷酸二氫鉀（KH2PO4） 34.0 g 蒸餾水 500 mL pH 7.2 A.4.2 制法 貯存液：稱取34.0 g的磷酸二氫鉀溶于500 mL蒸餾水中，用大