核酸分子雜交技術(shù).ppt

1、核酸分子雜交技術(shù)第一節(jié) 核酸分子雜交的基本原理,具有互補(bǔ)序列兩條單鏈核酸分子在一定條件下 按堿基互補(bǔ)配對(duì)原則退火形成雙鏈的過程。 雜交的雙方是待測(cè)核酸和已知核酸序列，已知 核酸序列稱探針。,核酸雜交,一、DNA變性與復(fù)性,（一）DNA變性 1、定義：某些理化因素導(dǎo)致兩條DNA鏈間的氫鏈斷裂變?yōu)閱捂湹倪^程，稱DNA變性,2、變性的方法： （1）熱變性：溫度升高到90100時(shí)，雙鏈核酸 分子鏈間的氫鍵完全斷裂。 （2）酸堿變性：pH值低于3或高于10時(shí)，雙鏈核 酸分子鏈 間的氫鍵斷裂。 （3）化學(xué)試劑變性：如尿素、甲酰胺、甲醛等使 雙鏈核酸分子鏈間的氫鍵斷裂。,（二）復(fù)性 定義：變性的單鏈核酸分子

2、在一定條件下按堿基互補(bǔ)原則重新結(jié)合為雙鏈核酸的過程，稱復(fù)性或雜交。 具有互補(bǔ)序列的兩條單鏈核酸都可互補(bǔ)形成雙鏈： DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA、寡核苷酸/DNA和寡核苷酸/RNA。,二、影響雜交的因素,1. 核酸分子的濃度和長(zhǎng)度,2. 溫度：比Tm低2530較適宜,3. 離子強(qiáng)度：離子強(qiáng)度雜交反應(yīng)率,4. 雜交液中的甲酰胺 甲酰胺能降低核酸雜交的Tm， 含30%50%甲酰胺的雜交溶液溫度能降低到3042。 使用甲酰胺的優(yōu)點(diǎn)：,低溫下探針更穩(wěn)定； 能更好地保留非共價(jià)結(jié)合的核酸。,5、核酸分子的復(fù)雜性： （1）核酸的復(fù)雜性是指存在于反應(yīng)體系中不同順序的總長(zhǎng)度 （2）Cot與反應(yīng)體

3、系中核酸復(fù)雜性成正比 （3）兩個(gè)DNA樣品濃度絕對(duì)一致時(shí)，變性后的相對(duì)雜交率取決于DNA的相對(duì)復(fù)雜性,6、非特異性雜交反應(yīng)： （1）雜交前封閉非特異性雜交位點(diǎn)，減少其對(duì)探針的非特異性吸附 （2）常用的封閉物有兩類：即非特異性DNA和高分子化合物。如鮭精DNA或小牛胸腺DNA，Denharts溶液或脫脂奶粉,第二節(jié) 探針,一、探針的種類,基因組DNA探針 cDNA探針 RNA探針 寡核苷酸探針,基因組DNA探針,從基因組DNA文庫中選取某一基因片段, 與載體連接（質(zhì)粒、噬菌體）, 克隆(PCR擴(kuò)增), 酶切,優(yōu)點(diǎn)：無性繁殖、制備方法簡(jiǎn)單；不易降解（與RNA比較）；標(biāo)記方法成熟。,cDNA探針（c

4、omplementary DNA）,S1核酸酶切平兩端,優(yōu)點(diǎn)： 不含內(nèi)含子及高度 重復(fù)序列,但不易獲得, 克隆,通過逆轉(zhuǎn)錄,加接頭 限制酶 粘性末端, 雙鏈cDNA, 載體連接,優(yōu)點(diǎn)：雜交效率高，穩(wěn)定性高，非特異性 雜交較少,未雜交探針可用RNase 降解，減少本底的干擾。,缺點(diǎn)：易降解，標(biāo)記方法復(fù)雜,RNA探針：檢測(cè)DNA和mRNA,寡核苷酸探針,優(yōu)點(diǎn)：可根據(jù)需要合成相應(yīng)序列； 探針短,序列復(fù)雜性低,分子量小，因此雜交時(shí)間短; 長(zhǎng) 度只有1050bp，該識(shí)別序列內(nèi)1個(gè)堿基的變化可明顯降低雜交Tm值。 可大量合成，價(jià)格低，能夠用酶學(xué)或化學(xué)方法進(jìn)行非放射性標(biāo)記。,二、標(biāo)記物 （一）理想標(biāo)記物應(yīng)具

5、備的特性：,高度靈敏性 不影響堿基配對(duì)的特異性 不影響探針分子的主要理化性質(zhì) 對(duì)酶促反應(yīng)活性無影響或影響不大 檢測(cè)方法具有高度靈敏性和高度特異性,(二) 標(biāo)記物種類,核素標(biāo)記物：32p、35s、3H 非核素標(biāo)記物 半抗原：生物素、地高率 配體：生物素是親和素的配體 熒光素：異硫氰酸熒光素、羅丹明等 化學(xué)發(fā)光探針：標(biāo)記物與某種底物反應(yīng)發(fā)光， 如生物素酰化的堿性磷酸酶 可使發(fā)光底物發(fā)光,三、標(biāo)記方法 體內(nèi)標(biāo)記法：將核素標(biāo)記的化合物作為合成代謝的底物，在細(xì)胞合成代謝時(shí)使 核素?fù)饺氲叫潞铣傻暮怂岱肿又?，?H-胸苷可摻入到DNA中， 3H-尿苷可摻入到RNA中,體外標(biāo)記法： 化學(xué)標(biāo)記法：標(biāo)記物分子上的

6、活性基因與 探針分子上的某些基因反應(yīng)， 標(biāo)記物直接結(jié)合到探針分子上 酶促標(biāo)記法：標(biāo)記物預(yù)先標(biāo)記核苷酸，然 后利用酶促法將標(biāo)記的核苷酸 摻入到探針上,四、探針的純化 1、乙醇沉淀法：無水乙醇可以沉淀DNA片段，可去除dNTP和蛋白質(zhì) 2、凝膠過濾柱層析法：利用凝膠的分子篩作用，將大分子DNA和小分子dNTP、磷酸根離子及寡核苷酸（80bp)等物質(zhì)分離，常用凝膠基質(zhì)是Sephadex G-50 3、微柱離心法：其原理與上述凝膠過濾柱層析法相同，不同的是上述采用洗脫的方式純化探針，而此法則是利用離心的方式來純化探針,第三節(jié) 核酸分子雜交的方法,按待測(cè)核酸是否固定在固相支持物上分： 固相雜交 sout

7、hern印跡雜交 northern印跡雜交 斑點(diǎn)雜交 原位雜交 液相雜交,一、Southern印跡雜交 （一）待測(cè)核酸樣品的制備 1、裂解或破碎細(xì)胞 2、抽取純化基因組DNA 3、限制酶消化DNA為大小不同的DNA片段,（二）待測(cè)DNA樣品的電泳分離 1、瓊脂糖濃度：分離大片段用低濃度膠 分離小片段用高濃度膠 2、凝膠電泳：凝膠具有分子篩效應(yīng)，大分子 DNA泳動(dòng)慢,小分子DNA泳動(dòng)快， 大小 相同的分子處于同一條帶 3、分子量標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)Hind消化的DNA，雜交 所用分子量標(biāo)準(zhǔn)可用核素標(biāo)記,（三）凝膠中核酸的變性（堿變化） 凝膠置于NaOH溶液中使DNA變性斷裂為較短的 單鏈 DNA,中性緩沖液

8、中和凝膠中的緩沖液,（四）Southern印跡 指將電泳分離的DNA片段轉(zhuǎn)移到一定的固 相支持物上的過程,1、固相支持物的選擇 理想的固相支持物應(yīng)具備的特性 具有較強(qiáng)結(jié)合核酸分子的能力 不影響與探針的雜交反應(yīng) 與核酸分子結(jié)合穩(wěn)定牢固 具有良好的機(jī)械性能 非特異吸附少,常用的固相支持物 硝酸纖維素膜：優(yōu)點(diǎn)是吸附能力強(qiáng)，雜交信號(hào)本 底低。缺點(diǎn)是DNA分子結(jié)合不牢固 尼龍膜：優(yōu)點(diǎn)是結(jié)合單鏈，雙鏈DNA的能力比硝酸 纖維素膜強(qiáng)；缺點(diǎn)：雜交信號(hào)本底高 化學(xué)活化膜：優(yōu)點(diǎn)：DNA與膜共價(jià)結(jié)合；對(duì)不同 大小的DNA片段有同等結(jié)合能力；缺點(diǎn)：結(jié)合能 力較上述兩種膜低,2.Southern印跡的常用方法 毛細(xì)管虹

9、吸印跡法,利用濃鹽轉(zhuǎn)移緩沖液的推動(dòng)作用，將凝膠中的DNA轉(zhuǎn)移到固相支持物上。 其基本原理是：容器中的轉(zhuǎn)移緩沖液含有高濃度的NaCl和檸檬酸鈉，上層吸水紙的虹吸作用使緩沖液通過濾紙橋、濾紙、凝膠、硝酸纖維素濾膜向上運(yùn)動(dòng)，同時(shí)帶動(dòng)凝膠中的DNA片段垂直向上運(yùn)動(dòng)，凝膠中的DNA片段移出凝膠而滯留在膜上,電轉(zhuǎn)法,利用電場(chǎng)的電泳作用將凝膠中的DNA轉(zhuǎn)移到固相支持物上。,真空轉(zhuǎn)移法,此法原理與毛細(xì)管虹吸法相同，只是以濾膜在下，凝膠在上的方式將其放置在一個(gè)真空室上，利用真空作用將轉(zhuǎn)膜緩沖液從上層容器中通過凝膠和濾膜抽到下層真空室中，同時(shí)帶動(dòng)核酸片段轉(zhuǎn)移到凝膠下面的尼龍膜或硝酸纖維素膜上。,（五）Southe

10、rn雜交 1、預(yù)雜交：封閉膜上能與DNA結(jié)合的位點(diǎn) 預(yù)雜交液為不含DNA探針的雜交液 2、雜交：液相中的DNA探針與膜上的待測(cè)DNA雜交 雙鏈DNA探針需加熱變性為單鏈，再雜交 3、洗膜：去除游離的放射性探針或非特異結(jié)合的 DNA,（六）雜交結(jié)果檢測(cè) 1、放射自顯影：適用于放射性核素標(biāo)記的探針 2、比色或化學(xué)發(fā)光檢測(cè)：適于非核素標(biāo)記的探針,二、Northern印跡雜交 1、基本原理和基本過程與Southern blot基本相同 2、鑒別RNA 3、探針可用DNA或RNA片段 4、待測(cè)樣品為總RNA或mRNA,三、斑點(diǎn)及狹縫印跡雜交 1、斑點(diǎn)印跡為圓形 2、狹縫印跡為線狀 3、鑒別DNA、RNA

11、 4、簡(jiǎn)單、快速，同一張膜可檢測(cè)多個(gè)樣品 5、特異性不高、不能鑒別核酸分子量,四、原位雜交 1、定義：將標(biāo)記的核酸探針與固定在細(xì)胞或組織中的核酸進(jìn)行雜交，稱原位雜交。根據(jù)檢測(cè)物分細(xì)胞內(nèi)原位雜交和組織切片內(nèi)原位雜交；根據(jù)探針與待檢核酸分：DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA 雜交,保持組織細(xì)胞的形態(tài) 對(duì)核酸無抽提，修飾與降解作用 不改變核酸在組織細(xì)胞內(nèi)的定位 不阻礙核酸與探針的雜交過程 對(duì)雜交信號(hào)無遮蔽作用 理化性質(zhì)穩(wěn)定,2、雜交過程： （1）組織或細(xì)胞的固定 理想固定液應(yīng)具備：,（2）組織細(xì)胞雜交前的預(yù)處理,去垢劑（如Triton x-100和SDS）和蛋白酶 K去除核酸表面的蛋白質(zhì) 組織細(xì)胞內(nèi)的核酸與蛋白質(zhì)結(jié)合成核酸蛋白復(fù)合體 控制消化時(shí)間，避免細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞和核酸從載玻 片上脫落,（3）探針的選擇與標(biāo)記,以獲得最好雜交效果為依據(jù)選擇探針 探針的長(zhǎng)度一般為50300bp ,有時(shí)達(dá)1.5kb 放射性核素標(biāo)記探針敏感性高，操作簡(jiǎn)便穩(wěn)定 檢測(cè)結(jié)果分辨率高，但信號(hào)檢測(cè)時(shí)間