現(xiàn)代動物生物化學3(1).ppt

1、一、核酸的結(jié)構(gòu),第三講 核酸化學,（一）DNA的結(jié)構(gòu),1DNA的一級結(jié)構(gòu) 動物染色質(zhì)DNA是雙螺旋線型。線粒體、細菌及某些病毒是雙螺旋環(huán)狀。少數(shù)幾種病毒是單鏈線型或環(huán)狀。DNA主要由A、G、C、T和少量稀有堿基如m5C組成。 各種生物堿基組成規(guī)律： （1）腺嘌呤與胸腺嘧啶完全相等。G與C完全相等。嘌呤總數(shù)與嘧啶總數(shù)完全相等。A+C=G+T A/T=G/C； （2）堿基組成具有種的特異性，既不同的物種DNA具有自己獨特的堿基組成； （3）堿基組成不具有組織器官特異性，同一生物各組織器官具有相同的堿基組成； （4）年齡、環(huán)境、營養(yǎng)狀態(tài)不影響DNA堿基組成。,DNA的一級結(jié)構(gòu)是4種脫氧核苷酸按一定的

2、方式、數(shù)量、排列順序形成的多核苷酸鏈。 一個脫氧核苷酸的C3-OH與一個C5-P以35磷酸二酯鍵相連形成糖-磷酸骨架，堿基在內(nèi)側(cè)，3端為-OH，5端為-P，書寫時按53方向。書寫用縮寫式如dACGT或5 dACGT3等，表式脫氧核苷酸的結(jié)構(gòu)。 真核生物DNA一級結(jié)構(gòu)中，常有一些重復序列。,高重復序列： 重復頻率高，從幾十萬次到幾百萬次，重復序列較短，5300bp，多數(shù)為515bp。重復序列中有些是反向重復序列，即該片段堿基順序在互補鏈方向正讀反讀都相同，稱回文結(jié)構(gòu)。 有些反向重復序列中間被一些不相關(guān)的順序隔開，形成十字形結(jié)構(gòu)，在十字形兩頭形成發(fā)夾環(huán)。,回形結(jié)構(gòu),十字結(jié)構(gòu),高重復序列中還有一種由

3、簡單重復單位組成的重復序列，重復單位由210 bp，成串排列。 高重復序列堿基組成不同于其它部分，可用等密度梯度離心法將其與主體部分分開，稱為衛(wèi)星DNA。根據(jù)重復頻率和重復序列長度不同又分為小衛(wèi)星DNA和微衛(wèi)星DNA。衛(wèi)星DNA是一種較好的分子遺傳標記。 高重復序列可參與DNA復制及基因表達調(diào)控。,中重復序列： 重復頻率和序列長度有很大差異，平均長度為6105bp，平均重復350次，在DNA一級結(jié)構(gòu)中可成串的排列在一個大的區(qū)域，也有的與單拷貝序列間隔排列，有些序列不編碼蛋白質(zhì)，有些序列編碼蛋白質(zhì)。 中重復序列具有種的特異性，可作為探針區(qū)分不同種哺乳動物細胞DNA。,低重復序列單拷貝序列 序列不

4、重復或只重復幾次、十幾次，長度大于1000bp，攜帶大量遺傳信息，編碼多種蛋白質(zhì)，有的是基因間隔序列。 DNA序列測定： 雙脫氧末端終止法，化學法，熒光標記及自動測序。,2、DNA的二級結(jié)構(gòu) DNA的二級結(jié)構(gòu)是Waston和Crick于1953年提出的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型。其要點如下： 主鏈：有兩條反向平行的脫氧多核苷酸鏈組成。雙鏈圍繞螺旋軸以右手方向盤繞成雙螺旋。磷酸-脫氧核糖位于螺旋的外側(cè)，構(gòu)成螺旋的主鏈，堿基位于螺旋的內(nèi)側(cè)。 堿基對：兩條鏈的堿基通過氫鍵聯(lián)系在同一平面上形成堿基對，A-T,G-C。兩種堿基對氫鍵間的距離、堿基兩側(cè)與其C-1連接之間距離及C-1與核苷酸構(gòu)成的角度相同。,螺距：雙螺

5、旋螺距為3.4nm，包含10個堿基對。每兩個相鄰堿基平面的垂直距離為0.34nm，直徑為2.0nm 。相鄰堿基對之間的螺旋角度為36。 大溝和小溝：兩條主鏈和堿基并不充滿雙螺旋的空間，表面形成大小兩條凹下去的槽，稱大溝和小溝。這是由于堿基對上下大小不同及堿基對兩側(cè)的脫氧核糖是不對稱的而形成的。兩種溝內(nèi)都具有形成氫鍵的氫供體和受體，但結(jié)構(gòu)不同。大溝比小溝寬而深，易于DNA蛋白質(zhì)酶等相互作用。,DNA雙螺旋示意圖,這種模型為B-DNA，隨著DNA分析技術(shù)的發(fā)展，DNA的雙螺旋不是均勻的，整個螺旋不是垂直而是彎曲的，許多結(jié)構(gòu)參數(shù)是隨堿基序列的不同而有一定范圍的波動，如旋轉(zhuǎn)角度等。 穩(wěn)定雙螺旋結(jié)構(gòu)穩(wěn)定

6、的因素有：互補堿基間氫鍵，堿基堆積力（堿基平面之間的范德華力和疏水作用力），離子鍵（外側(cè)磷酸基的負電荷與介質(zhì)中的陽離子之間形成的離子鍵）。,DNA雙螺旋的多態(tài)性： DNA在不同條件下存在有不同的雙螺旋結(jié)構(gòu)，具有多態(tài)性。如：A、A、B、B、C、C、D、E、Z等。 A-DNA： DNA纖維鈉鹽在濕度為75%時，B-DNA轉(zhuǎn)變?yōu)锳-DNA。 A-DNA的右手螺旋比B-DNA大且較平，每轉(zhuǎn)一圈的螺距為2.8nm，每一圈的堿基對數(shù)為11，堿基距離0.255nm，堿基旋轉(zhuǎn)33。堿基平面不與中心軸不垂直，而成20傾斜，大溝窄而深小溝淺。,Z-DNA結(jié)構(gòu)特征： a：以二聚體dGC或dCG為一個單位，由六個這樣

7、的單位構(gòu)成一個左手螺旋。磷酸基團走向成Z型。螺旋直徑為1.8nm。每轉(zhuǎn)一圈包括12個堿基對，螺距為4.5nm。 b：G-C堿基對不是對稱的位于螺旋軸附近移向邊緣，G位于DNA分子表面成六面對稱排布，表面有窄而深的小溝。,影響Z-DNA形成與穩(wěn)定的因素： 單價、二價金屬離子有利于Z-DNA的形成與穩(wěn)定。多胺等促進Z-DNA的形成與穩(wěn)定。 具有嘧啶、嘌呤交替相間的序列有利于Z-DNA的形成。 胞嘧啶或鳥嘌呤的甲基化可形成穩(wěn)定的Z-DNA。 組蛋白H2A、H2B、H3、H4穩(wěn)定Z-DNA，而組蛋白H1和H5不利于Z-DNA的形成。 在有適當堿基序列的部位解旋時，促進Z-DNA的形成。,三螺旋DNA結(jié)

8、構(gòu)：分子間、分子內(nèi)、平行三螺旋 堿基組成及配對： 三螺旋是在雙螺旋的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上形成的。 三鏈區(qū)的三條鏈均由同型嘌呤或同型嘧啶組成。根據(jù)堿基組成及結(jié)構(gòu)的不同分為嘧啶-嘌呤-嘧啶型（Y.RY型）：TAT、CGC，嘌呤-嘌呤-嘧啶型（R.RY型）：AAT、GGC。堿基配對方式，第三個堿基以A-T、G-C配對，只形成兩對氫鍵，在R.RY型上還存在G-G、AA，每一型中堿基配對具有高度的序列特異性。,分子間三螺旋DNA： 合成的脫氧多核苷酸在一定條件下DNA雙螺旋的特定區(qū)插入雙螺旋結(jié)構(gòu)的大溝內(nèi)，通過氫鍵的形成局部的分子間三螺旋結(jié)構(gòu)，并與雙螺旋一起旋轉(zhuǎn)。 分子內(nèi)三螺旋DNA： DNA雙螺旋特定區(qū)通過氫鍵作

9、用發(fā)生自身折疊形成局部分子內(nèi)三股螺旋結(jié)構(gòu)，同時游離出一段DNA單鏈。如H-DNA，其內(nèi)的主要序列成為H-回文序列。 平行的三螺旋結(jié)構(gòu)： 三螺旋結(jié)構(gòu)中的第三條鏈的序列，方向與第一條鏈的相同，稱為R-DNA。,分子間三螺旋 分子內(nèi)三螺旋,近年來的研究表明，在真核細胞染色質(zhì)中，發(fā)現(xiàn)許多基因的調(diào)控區(qū)和染色質(zhì)的重組部位含有三螺旋DNA結(jié)構(gòu)，應(yīng)用單鏈DNA片段可將切割劑攜帶到DNA的特定位點，從而達到選擇性切斷有害基因或病毒基因的轉(zhuǎn)錄。對三螺旋DNA的研究有助于認識真核基因結(jié)構(gòu)、復制、轉(zhuǎn)錄、調(diào)控和重組的機理。,3、DNA的三級結(jié)構(gòu),DNA的三級結(jié)構(gòu)是指DNA雙螺旋進一步扭曲盤繞所形成的構(gòu)象。包括線型雙鏈中

10、的扭結(jié)、超螺旋、多重螺旋、分子內(nèi)局部單鏈環(huán)、連環(huán)等。超螺旋是最常見的一種。 （1）超螺旋 環(huán)狀DNA、線形雙螺旋兩端連接進一步扭曲可形成負超螺旋。向右手扭曲形成正超螺旋。 天然存在的超螺旋多為負超螺旋。如細菌質(zhì)粒、噬菌體、大腸桿菌染色體DNA、真核細胞染色體DNA等。,雙鏈環(huán)狀DNA及超螺旋結(jié)構(gòu),自然界中大多數(shù)DNA分子都以超螺旋結(jié)構(gòu)存在。其意義在于： 1、密度大、體積小，在 細胞中所有體積較為經(jīng)濟； 2、能影響雙螺旋的解鏈程度，因而影響DNA分子與其他分子的相互作用，參與DNA的復制、重組、轉(zhuǎn)錄等功能。 生物體內(nèi)某些小病毒、細菌質(zhì)粒、真核線粒體、葉綠體、噬菌體PM2及某些細菌的DNA為雙鏈環(huán)

11、狀，在細胞內(nèi)進一步扭曲形成超螺旋三級結(jié)構(gòu)。,（2）染色體DNA的三級結(jié)構(gòu) 真核細胞染色體DNA的二級結(jié)構(gòu)是線性雙螺旋，三級結(jié)構(gòu)是雙螺旋盤繞在組蛋白上的負超螺旋結(jié)構(gòu)。這種以組蛋白為核心，盤繞以DNA片段的顆粒稱核小體。 核小體是染色體的基本結(jié)構(gòu)單位，每一個核小體上的DNA數(shù)量是因生物種類和組織不同而異。完整的核小體由核小體核心與連接蛋白組成，核心是由組蛋白H2A/H2B、H3/H4與DNA結(jié)合形成的八聚體，連接蛋白由組蛋白H1和20-80bp的DNA構(gòu)成。許多核小體形成念珠線形結(jié)構(gòu)的核小體煉，然后盤繞形成染色質(zhì)纖維，再進行盤曲形成染色單體。,（3）線粒體DNA的結(jié)構(gòu) 線粒體DNA是雙鏈環(huán)狀分子，

12、兩個鏈的堿基組成顯著不同。重鏈含有較多的G，輕鏈含有較多的C。有一個長度不同的D環(huán)。D環(huán)含有2個啟動基因（P1、P2），3個保守序列CSB（I、II、III）和一個終止序列；有2個復制起始點（OH、OL）；重鏈是2種rRNA、14種tRNA和12種多肽的模板，輕鏈是8種tRNA和1種多肽的模板。線粒體基因排列緊密，沒有間隔區(qū)，基因長度變化小，兩端不存在非編碼序列，很少有重復序列，無內(nèi)含子。,4、DNA的理化特性,（1）分子大?。?分子量104107，堿基對107bp。長度可達數(shù)厘米，由于分子很長，有一定脆性，極易受剪切力的作用而折斷。 （2）紫外吸收特性： 由于嘌呤和嘧啶堿基形成共軛雙鏈而具有

13、紫外吸收性質(zhì)，最大吸收波長260nm，此特性可用于測量核酸的濃度及其純度。,（3）變性與復性： 變性：能破壞氫鍵和疏水鍵的因素都能導致雙螺旋的破壞。 變性因素：加熱、極端PH、有機溶劑、尿素、酰胺等。 DNA由雙螺旋結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變成無規(guī)則卷曲單鏈，稱DNA變性。變性理化性質(zhì)發(fā)生很大變化，260nm處紫外吸收值增高、黏度下降、沉降系數(shù)增加、浮力密度上升等。 熱變性在較窄的溫度范圍內(nèi)發(fā)生，引起DNA變性溫度稱熔點（Tm）。DNA Tm在7085度之間。,溶液離子種類和強度影響DNA的穩(wěn)定性，離子強度低時，Tm值低，熔點范圍較窄；離子強度高時 ，熔點范圍較寬。 DNA分子堿基組成的均一性和分子中G+C的含

14、量可影響其Tm 值。均一性DNA Tm值較窄，非均一性DNA Tm值較寬。G+C含量高的DNA，Tm值較高。亦較穩(wěn)定，所以，Tm值可作為測定DNA樣品均一性的指標，及推算DNA堿基組成。,復性：除去變性因素后，變性DNA的兩條鏈重新結(jié)合起來，恢復到原來雙螺旋結(jié)構(gòu)的過程稱為DNA復性。 復性后DNA的一系列理化性質(zhì)得到恢復，真核DNA重復頻率高的序列復性速度快，重復頻率低的則慢。序列簡單、濃度高、片段大的DNA復性快。,天然DNA,變性DNA,加 熱,緩慢冷卻,（4）核酸分子雜交： 相同或不同來源的兩個DNA或DNA和RNA分子如果含有彼此互補的序列，混合在一起，通過變性和復性處理，DNA-DN

15、A同源序列間及DNA-RNA異源序列間形成DNA-DNA或DNA-RNA雜交體，稱為核酸分子雜交。 核酸探針（基因探針）：有目的合成從基因組中分離一段已知序列的DNA，使帶上標記，經(jīng)變性后成為單鏈，在一定條件下與待測DNA單鏈雜交，如兩序列有同源性即互補，形成帶有標記的雙鏈DNA分子，以達到探測位知DNA的目的。,（二）RNA結(jié)構(gòu),1RNA的結(jié)構(gòu)特征 （1）堿基組成：A、G、C、U及少量稀有堿基，堿基含量沒有A-U、G-C的比例關(guān)系。 （2）一級結(jié)構(gòu)：四種單核苷酸按一定方式、數(shù)量和排列順序形成多核苷酸鏈稱為RNA一級結(jié)構(gòu)。細胞RNA分子一般為線形單鏈分子。 （3）RNA構(gòu)象：RNA二級結(jié)構(gòu)由雙

16、螺旋或堿基對區(qū)、內(nèi)部環(huán)、單堿基突起和突環(huán)、發(fā)夾環(huán)或多分支環(huán)、單鏈區(qū)、假結(jié)構(gòu)成。,雙螺旋區(qū)：RNA單鏈迂回折疊形成，一個或數(shù)個長短不一的局部雙螺旋結(jié)構(gòu)。 內(nèi)部環(huán)：RNA鏈中不互補的堿基突出形成環(huán)狀突起。內(nèi)部環(huán)的堿基數(shù)目可以是對稱的也可以是不對稱的。 單堿基突起：在一個連續(xù)的雙螺旋中突起一個堿基。 發(fā)夾環(huán)：對于雙螺旋末端兩面連接的雙鏈區(qū)域，類似發(fā)夾結(jié)構(gòu)。 多分支環(huán)：是連接三個以上螺旋的環(huán)區(qū)。 假結(jié)：是二級結(jié)構(gòu)中環(huán)區(qū)再加上堿基配對形成。是幾個螺旋區(qū)交叉的一種形式。 單鏈區(qū)：位于RNA分子的端部。,（4）RNA的空間結(jié)構(gòu)： 單鏈RNA分子通過折疊形成二級和三級結(jié)構(gòu)。二級結(jié)構(gòu)既有單鏈區(qū)又有雙鏈區(qū)。種類和

17、功能不同的RNA有其特征的二級或三級結(jié)構(gòu)，種類和功能相同的RNA二級或三級相同或相似。,2mRNA 二級結(jié)構(gòu)沒有共同的形態(tài)和規(guī)律。原核生物和真核生物mRNA結(jié)構(gòu)不同。 （1）原核生物mRNA的結(jié)構(gòu) 典型的多順反子結(jié)構(gòu)即一個操縱子編碼的幾條多肽鏈。5端無帽子結(jié)構(gòu)，沒有修飾核苷酸，不含稀有堿基，3端沒有多聚A序列，二級結(jié)構(gòu)存在豐富的自身回折形成的雙鏈區(qū)，有發(fā)夾結(jié)構(gòu)。,（2）真核生物mRNA結(jié)構(gòu) 含有少量稀有堿基，由5的帽子結(jié)構(gòu)、5非編碼區(qū)、編碼區(qū)、3非編碼區(qū)和3多聚A尾組成。 5帽子結(jié)構(gòu)：是5存在甲基化核苷，即：m7GpppNm.，對mRNA的翻譯活性很重要。 3多聚A結(jié)構(gòu)：存在于3端的多聚A結(jié)構(gòu)

18、，是轉(zhuǎn)錄后由腺苷酸聚合酶催化加上的，對mRNA的穩(wěn)定、翻譯效率有調(diào)控作用。 編碼區(qū)：帶有特異性蛋白質(zhì)遺傳信息的翻譯區(qū)，是肽鏈氨基酸序列的編碼序列。 非編碼區(qū)：存在5和3端，兩個非編碼區(qū)分別包括5帽子結(jié)構(gòu)、起始密碼和終止密碼、多聚A結(jié)構(gòu)，非編碼區(qū)參與翻譯過程和起調(diào)控作用。,非編碼區(qū),順販子1,順反子2,順反子3,間隔序列,非編碼區(qū),非編碼區(qū),非編碼區(qū),編碼區(qū),A 原核生物mRNA B 真核生物mRNA,3tRNA （1）tRNA一級結(jié)構(gòu)特征 單鏈小分子 含有較多的稀有堿基或修飾堿基，其中以甲基化堿基較多； 3端都是CCA-OH結(jié)構(gòu)； 5端總是磷酸化的，大多數(shù)為pG； 表現(xiàn)出進化的保守性，有二十多

19、個位點上的核苷酸是不變的； 大多數(shù)tRNA第54到57位存在TCG序列。,（2）tRNA二級結(jié)構(gòu) 是三葉草結(jié)構(gòu)，有5個臂組成 ，即：氨基酸臂、二氫尿嘧啶臂、反密碼子臂、胸苷假尿苷胞苷臂和可變臂。每個臂由兩部分組成，一部分堿基配對形成雙螺旋，另一不分以單鏈形式形成一個小環(huán)。,氨基酸臂：由7個堿基對組成的局部雙螺旋區(qū)和3端CCA-OH組成，可接受活化的氨基酸。 二氫尿嘧啶臂：由三個堿基對組成的短雙螺旋區(qū)和由7到10個核苷酸形成的二氫尿嘧啶環(huán)。 反密碼子臂：由5個堿基對構(gòu)成的短雙螺旋區(qū)和7個核苷酸形成的反密碼子環(huán)，其中三個核苷酸組成反密碼子，與mRNA相應(yīng)的密碼子互補。 胸苷甲尿苷胞苷臂：由5對堿基

20、組成的雙螺旋區(qū)和7個核苷酸圍成的TCG組成。TCG環(huán)使tRNA與線粒體的大亞基相互結(jié)合。 可變臂：有3到21個核苷酸組成的可變環(huán)，含量多者可形成小雙螺旋。,反密碼子,反密碼子,tRNA二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu),4、rRNA 是核糖體的組成成分，對核糖體的裝配和活性，及在蛋白質(zhì)生物合成過程中起重要作用。所有原核和真核生物rRNA都能折疊成相似的二級結(jié)構(gòu)。 有5S rRNA 、5.8S rRNA 、23S rRNA 、16S rRNA等。,5hnRNA、snRNA、snoRNA （1）hnRNA 又稱不均一核RNA存在于真核生物細胞核中，分子量不均一，是mRNA的前體，在核質(zhì)中由RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄而成，初

21、級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物不含5帽子和3polyA結(jié)構(gòu)。在核質(zhì)中經(jīng)過加工修飾成有帽尾結(jié)構(gòu)的hnRNA，再經(jīng)剪接和甲基化修飾轉(zhuǎn)變成成熟的mRNA. hnRNA與蛋白質(zhì)結(jié)合成核內(nèi)不均一的核糖核蛋白顆粒（hnRNP），參與mRNA剪接加工成熟過程。,（2）snRNA 又稱作核內(nèi)小RNA，是一類小分子RNA，分布于細胞核中，與蛋白質(zhì)結(jié)合在一起形成小分子細胞核核蛋白顆粒（snRNA），與mRNA前體組成剪接體，參與mRNA的剪切，加工。 （3）snoRNA 又稱作小分子核仁RNA，存在于真核生物細胞核內(nèi)，參與rRNA的加工，影響rRNA，及其前體的形成等。,6反義RNA 指能與有義mRNA互補結(jié)合的單鏈RNA。廣泛存在

22、于自然界。原核生物由反義基因轉(zhuǎn)錄而來。真核生物來自于mRNA同一DNA區(qū)。即由反鏈轉(zhuǎn)錄而來。 反義RNA是生物體內(nèi)重要的調(diào)控物質(zhì)，可在多層次對基因的表達進行調(diào)控。,二 、DNA的復制,（一）DNA復制過程基本要點,1半保留復制 復制過程中，DNA兩條鏈分開，分別以每一條鏈為模板合成新的互補鏈，產(chǎn)生兩個與原來DNA分子堿基順序完全一樣的子代DNA分子，每個子代DNA分子的一條鏈來自親代DNA，另一條鏈是新合成的，這種復制方式稱半保留復制。 半保留復制是雙鏈DNA的普遍復制機制。單鏈DNA在復制時，也要先形成雙鏈的復制形式。,2復制的起始點、方向和方式 復制是從DNA分子上特定位置開始的。這一位置

23、稱復制原點。方向大多以雙向進行，也有一些以單向進行。復制正在發(fā)生的位點叫復制叉，雙向復制可形成兩個復制叉。 （1） 復制的起始點 原核生物只有一個起始點，真核生物有幾個或多個復制起點。其共同特點是都富含A.T序列。是引發(fā)復制的蛋白因子結(jié)合的位點。不同生物中A.T序列長度不同。 （2） 復制的方向 復制從特定位置開始，大都雙向進行，也有一些是單向的。向一側(cè)單方向進行的復制稱為單方向復制，向兩側(cè)進行的復制叫做雙向復制，向兩側(cè)復制但移動是不對稱的稱不對稱雙向復制。,（3）復制方式 眼型：復制區(qū)域形如一個眼睛，復制隨眼形結(jié)構(gòu)的擴張最終擴張到整個復制子，有單向和雙向兩種。 型：復制眼形成類似結(jié)構(gòu)，發(fā)生在

24、環(huán)狀DNA分子中。有雙向和單向復制，多數(shù)為雙向等速復制。 D環(huán)型：線粒體DNA的復制呈現(xiàn)D環(huán)型。 線粒體DNA是環(huán)狀雙鏈DNA。兩條鏈的復制是不對稱的，先以新代分子中的負鏈為模板，合成一條新鏈，當合成進行到一定距離時，暴露本身一條鏈的復制點，從該點開始，以正鏈為模板，合成一條新鏈，兩者的合成方向相反。由于起始點不在同一位置，所以合成的起始時間不同。復制是不對稱進行的。,滾環(huán)型： 某些病毒、噬菌體DNA復制時形成滾環(huán)型。當環(huán)型DNA分子復制時，先由一核酸內(nèi)切酶從正面的一個位置打開一個缺口，使3和5端游離出來，3端做為引物，在DNA聚合酶催化下，以負鏈為模板，連續(xù)合成一條新鏈，形成環(huán)狀雙鏈子代DN

25、A，以原有的正鏈為模板連續(xù)或不連續(xù)合成一條負鏈最后形成一線形或環(huán)狀雙鏈分子。,直線雙向,多起點雙向,3復制的方向：從53。 4復制的半不連續(xù)性 DNA復制在有條鏈上以53的方向連續(xù)合成，這條鏈成為前導鏈，在另一條鏈上，先按53方向合成許多與復制叉方向相反的崗崎片段（1968年，崗崎發(fā)現(xiàn)），隨著復制叉的移動，許多不連續(xù)的崗崎片段在DNA連接酶的作用下，連接成一條完整的DNA鏈。這條鏈稱隨從鏈。,5模板和引物 模板為DNA。 引物是在DNA的復制過程中，每段崗崎片段復制時都要先合成一小段RNA作為引物，復制才能進行，引物是引發(fā)DNA合成的。,6引發(fā)和引發(fā)體 DNA分子上一段短的區(qū)域發(fā)生熔解反應(yīng)，雙

26、鏈分離成單鏈區(qū)域，由解旋酶使雙螺旋解開，單鏈結(jié)合蛋白使雙鏈解開，并覆蓋在單鏈上。 解旋酶沿DNA移動形成復制叉。 在引物合成酶的作用下，形成一小段RNA引物，引發(fā)復制，引發(fā)過程中由若干蛋白和酶形成一個引發(fā)體。引發(fā)酶在隨從鏈上向復制叉方向前進，在隨從鏈上斷斷續(xù)續(xù)地引發(fā)生成隨從鏈的RNA引物。在前導鏈上引發(fā)只進行一次。,7鏈的延伸 鏈的延伸是在DNA聚合酶催化下，按模板的要求，在引物的3-OH加上新的核苷酸。大腸桿菌DNA聚合酶有I、II、III三種。酶III是延伸的主要酶。 8鏈的終止 在單向復制的環(huán)狀分子中，復制的終點就是復制原點。在雙向復制環(huán)狀分子中沒有固定的終點。 DNA鏈延長結(jié)束后，DN

27、A聚合酶I的作用下切除RNA引物，該酶具有53外切酶的功能。去除引物后留下的空缺由酶I催化填補，然后在又DNA連接酶將DNA片段連接起來。,9復制忠實性的保證 為了保證復制的忠實性，生物體內(nèi)具有確保復制忠實性的機能。DNA聚合酶具有35外切酶活性，可專門水解不配對的堿基，該酶在聚合開始時具有選擇正確堿基的能力，同時有一種校對作用，刪去誤配的堿基，保證復制的高度忠實性。,（二）復制過程所需主要酶類及相關(guān)蛋白,1DNA聚合酶 DNA聚合酶的特點： 以四種脫氧核苷酸三磷酸為底物； 反應(yīng)需接受模板指導； 反應(yīng)需有引物3-OH存在； 雙鏈的伸展方向為53； 產(chǎn)物DNA性質(zhì)與模板相同。,（1）大腸桿菌DN

28、A聚合酶 酶I： DNA聚合酶活性：通過核酸聚合反應(yīng)使DNA鏈沿35方向延長。 35外切酶活性：由3端水解DNA鏈。 53外切酶活性：由5端水解DNA鏈。 35外切酶活性能切除單鏈DNA的3末端。正常聚合反應(yīng)中35外切酶活性受抑制，當出現(xiàn)錯配堿基對，聚合反應(yīng)停止，由35外切酶切除錯配堿基，聚合反應(yīng)才能繼續(xù)進行。 53外切酶活性只用于雙鏈DNA，從5端水解下核苷酸或寡核苷酸，如崗崎片段中5引物的切除。,酶II： 催化由53方向合成DNA反應(yīng)，只有35外切酶活性，而無53外切酶活性。其生理功能還不太清楚。 酶III： 與酶I一樣具有35， 53外切酶活性。酶III在復制過程中起主要作用。該酶是由多

29、亞基組成的含不對稱兩臂的大分子。這樣可適于同時催化復制叉的前導鏈和隨從鏈的合成。隨從鏈的模板在復制叉前進處圍繞DNA聚合酶III的一個臂彎曲成環(huán)，使隨從鏈片段在53合成時也于復制叉前進方向一致。當隨從片段合成接近前導片段5末端時，模板被釋放，模板上的環(huán)消除，合成的隨從鏈片段其53方向轉(zhuǎn)為與復制叉方向相反。合成下一片段時，模板再成環(huán)、環(huán)再消除等。,酶III模式圖,前導鏈與隨從鏈合成機制,DNA聚合酶的晶體結(jié)構(gòu),（2）真核生物DNA聚合酶 真核生物DNA聚合酶活性與大腸桿菌DNA聚合酶活性相似。有、和5種。 酶：同與酶III，由多亞基組成，是真核生物DNA復制的主要酶。常伴有引物合成酶。引物可以是

30、DNA或RNA。 酶：能以人工合成的DNA為模板，引物為寡聚脫氧核糖核苷酸?？赡茉贒NA的損傷修復中起作用。 酶：模板與引物與酶相同，可能與線粒體DNA復制相關(guān)。 酶：天然DNA需經(jīng)DNase處理活化后才能作為模板和引物。具有35外切酶活性。 酶：其性質(zhì)與相似。 和的生物功能尚不清楚。,2DNA連接酶 催化DNA切口處形成3，5-磷酸二酯鍵。目前應(yīng)用的有大腸桿菌DNA連接酶、T4DNA連接酶。二者的區(qū)別：輔助的因子不同（大-NAD；T4-ATP）。底物不同，大腸桿菌DNA連接酶，只連接雙鏈DNA中的單鏈缺口，只能實現(xiàn)粘接，不能實現(xiàn)DNA雙鏈間的平接。T4DNA連接酶，既能實現(xiàn)DNA雙鏈間的粘接

31、，有能實現(xiàn)平接。,3單鏈結(jié)合蛋白（SSB） SSB能刺激同源DNA聚合酶的活性。使天然DNA熔點降低，單鏈DNA與其結(jié)合后，能抵抗核酸酶的水解，可與解開的兩條單鏈結(jié)合，穩(wěn)定單鏈以利于其發(fā)揮模板作用，促進復制進行。,4DNA解旋酶 是一類通過水解ATP獲得能量來解開雙鏈DNA的酶。復制時DNA解旋酶可以沿著隨從鏈模板的53方向隨著復制叉的前進而移動。Rep蛋白前導鏈模板的35方向移動. Rep蛋白和DNA解旋酶在DNA兩條鏈上協(xié)同作用,以解開雙鏈DNA.DNA解旋酶還同時有引發(fā)酶的功能。,rep蛋白,DNA解旋酶,5拓撲異構(gòu)酶 酶I：雙鏈DNA超螺旋和送松弛態(tài)之間的轉(zhuǎn)換。 單鏈互補DNA的正鏈與

32、負鏈形成雙環(huán)結(jié)構(gòu)。 單鏈結(jié)狀DNA和無結(jié)狀DNA之間的轉(zhuǎn)換。 雙鏈環(huán)狀DNA的環(huán)連或解環(huán)連作用。 酶II：使DNA的正超螺旋轉(zhuǎn)變?yōu)樨摮菪隣顟B(tài)。使DNA兩條鏈同時切開，同時利用水解ATP的能量，使雙鏈解開，讓一條DNA穿過斷口，再將切斷的末端重新關(guān)閉起來，形成負超螺旋。,超螺旋松弛,打結(jié)與解結(jié),雙鏈環(huán)生成,環(huán)連與解環(huán)連,拓撲異構(gòu)酶I催化作用,拓撲異構(gòu)酶II催化作用,6引物酶 引物是一種特殊的RNA聚合酶，催化RNA引物的合成。引物酶作用需要有其他蛋白質(zhì)因子存在，即需要有引發(fā)前體的存在。 引發(fā)前體包含多種蛋白因子PriA、B、C ,dnaA、B、D、T。引物酶與引發(fā)前體兩者聯(lián)合，組成引發(fā)體。,7

33、端粒酶 是一種核糖核蛋白酶，是一種特殊的DNA聚合酶，屬于反轉(zhuǎn)錄酶。由RNA和蛋白質(zhì)構(gòu)成，以其中一段RNA序列為模板，延伸染色體的3端解決DNA復制時引起的末端隱縮。 端粒酶RNA亞單位的結(jié)構(gòu)在不同真核生物之間差別很大，其蛋白質(zhì)組分至少有兩個以上多肽亞單位組成。 端粒酶能把端粒序列加到染色體末端，以補充染色體末端的自然丟失。在缺乏有效延伸機制時，端粒在歷經(jīng)每次細胞分裂之后即縮短。,（三）原核生物DNA復制模型和真核生物DNA復制特點,1原核生物DNA復制模型 （1）凱恩斯模型（型）： 大腸桿菌和噬菌體DNA以此模型復制。 復制機制： 復制從雙鏈特定的復制點開始。 分別以正負兩鏈為模板，以雙向方

34、式進行。 正鏈膨大負鏈變形，逐漸形成型DNA分子。新生子鏈隨母鏈正負鏈內(nèi)外側(cè)延伸。 延伸到一定程度閉環(huán)，形成兩個子代DNA分子。,（2）滾環(huán)式模型 如174噬菌體與單鏈環(huán)狀DNA的復制。復制時先以單鏈正鏈為模板合成一條互補鏈，形成環(huán)狀雙鏈復制型。 復制機制：雙鏈DNA分子的正鏈被內(nèi)切酶切開一個缺口，露出3-OH和5磷酸末端； 正鏈的一端固定在細胞膜上，以環(huán)狀閉和的負鏈為模板，以正鏈的3-OH為引物，復制新的正鏈； 負鏈隨正鏈的延長而滾動，使模板上尚未復制的核苷酸轉(zhuǎn)到正鏈的延伸點，使正鏈的復制持續(xù)進行； 拉成現(xiàn)狀的正鏈的5端部分逐漸延長，并進行直線伸展的復制； 新生的子鏈延長到一定程度后，在連接

35、酶作用下成環(huán)，線狀伸展部分也卷曲成環(huán)，形成兩個子代環(huán)狀DNA分子。 這種雙鏈DNA分子可在內(nèi)切酶作用下在正鏈切一切口，使正負鏈分開，形成一個單鏈DNA分子。,2真核生物DNA復制的特點 （1）同原核生物一樣都是半保留復制。 （2）原核生物只有一個復制起始點，一個DNA分子就是一個復制子。真核生物DNA上有許多復制起始點，每個復制起始點，不固定在某一DNA序列處，每個起始點左右各有一個終止點，形成一個復制單位即復制子。不同生物，同一生物不同生長條件下，其復制子大小不同，同一DNA上其復制子大小不均一。,（3）從復制起始點開始向左右進行，形成復制叉。許多復制叉碰在一起，最后完成整個DNA復制過程，

36、形成兩個子代DNA分子。 （4）原核生物DNA復制可以雙向進行，也可以單向進行。真核生物DNA復制絕大多數(shù)雙向進行，少數(shù)單向進行。 （5）原核生物復制起始點可連續(xù)進行新的復制。真核生物DNA在完成生命復制之前 ，每個起始點不能開始新的復制。 （6）真核生物線粒體DNA的復制類似于凱恩斯模型，是單向不對稱的半保留復制，即D環(huán)型。,（四）DNA的損傷及修復,1DNA的損傷： 由于某些物理和化學因素的作用引起DNA序列發(fā)生變化，造成DNA損傷。 這些變化包括：堿基的丟失、堿基的插入、堿基的變化、DNA鏈的斷裂和交聯(lián)、堿基二聚體的形成等。,2DNA損傷的修復 （1）光復活：可見光激活了光復活酶，它能分

37、解由紫外線照射而形成的嘧啶二聚體 這種修復由于高度專一性，只作用于由紫外線照射形成的嘧啶二聚體。從低等生物到鳥類都有，但高等動物沒有。 （2）切除修復：在一系列酶的作用下，將DNA分子中損傷部分切除，并以完整的鏈為模板，合成出切除的部分，使DNA恢復正常結(jié)構(gòu)的過程。 （3）重組修復：損傷的DNA片段上出現(xiàn)缺口，從完整的母鏈上將相應(yīng)的核苷酸序列片段移至缺口處，然后用再合成的序列來補上母鏈的缺失。,形成嘧啶二聚體,光復活酶結(jié)合損傷部位,酶被可見光激活,修復后釋放酶,光復活修復作用,（4）SOS反應(yīng)：是細胞DNA受到損傷或復制系統(tǒng)受到抑制的緊急情況下 ，為求得生存而出現(xiàn)的應(yīng)急效應(yīng)。 SOS反應(yīng)能誘導切除和重組修復中有關(guān)的酶和蛋白質(zhì)的產(chǎn)生，加強切除和重組修復的能力。 SOS反應(yīng)還能誘導產(chǎn)生缺乏校對