細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)

1、細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)1實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)和掌握外源基因?qū)胝婧思?xì)胞的主要方法脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染。了解外源基因進(jìn)入的一般性方法，觀測(cè)外源蛋白的表達(dá)（綠色熒光蛋白），為染色準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)材料。2實(shí)驗(yàn)原理Transfect上圖所示是脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染的示意圖，它顯示了外源質(zhì)粒進(jìn)入細(xì)胞的一般過程。外源基因進(jìn)入細(xì)胞主要有四種方法：電擊法、磷酸鈣法和脂質(zhì)體介導(dǎo)法和病毒介導(dǎo)法。電擊法是在細(xì)胞上短時(shí)間暫時(shí)性的穿孔讓外源質(zhì)粒進(jìn)入；磷酸鈣法和脂質(zhì)體法是利用不同的載體物質(zhì)攜帶質(zhì)粒通過直接穿膜或者膜融合的方法使得外源基因進(jìn)入細(xì)胞；病毒法是利用包裝了外源基因的病毒感染細(xì)胞的方法使得其進(jìn)入細(xì)胞。但是由于電擊法和磷酸鈣法的實(shí)驗(yàn)條件控制較嚴(yán)、難度較大

2、；病毒法的前期準(zhǔn)備較復(fù)雜、而且可能對(duì)于細(xì)胞有較大影響；所以現(xiàn)在對(duì)于很多普通細(xì)胞系，一般的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染方法多采用脂質(zhì)體法。利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法最重要的就是防止其毒性，因此脂質(zhì)體與質(zhì)粒的比例，細(xì)胞密度以及轉(zhuǎn)染的時(shí)間長(zhǎng)短和培養(yǎng)基中血清的含量都是影響轉(zhuǎn)染效率的重要問題，通過實(shí)驗(yàn)摸索的合適轉(zhuǎn)染條件對(duì)于效率的提高有巨大的作用。上圖是本次實(shí)驗(yàn)采用的脂質(zhì)體中陽離子組分的結(jié)構(gòu)的示意圖。本次實(shí)驗(yàn)采用的脂質(zhì)體是promega公司的TransFast脂質(zhì)體試劑，它是一種陽離子脂質(zhì)體和中性脂質(zhì)體的混合物，是對(duì)于本次實(shí)驗(yàn)中采用的293T細(xì)胞優(yōu)化的轉(zhuǎn)染試劑。3. 實(shí)驗(yàn)材料與器材1）材料293T細(xì)胞MyoD表達(dá)質(zhì)粒和EGFP表達(dá)質(zhì)粒

3、DMEM培養(yǎng)基鏈霉素/青霉素（雙抗）FCS（小牛血清）PBS（磷酸鹽緩沖溶液）胰酶/EDTA消化液轉(zhuǎn)染試劑（TransFast）2）器材20ul/200ul/1ml微量移液器和Tip頭酒精燈廢液缸血球計(jì)數(shù)板渦旋振蕩器恒溫水浴箱臺(tái)式離心機(jī)35mm培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)染管15ml離心管觀察用倒置顯微鏡熒光顯微鏡和CCD4. 實(shí)驗(yàn)步驟細(xì)胞傳代(1) 試驗(yàn)準(zhǔn)備：200ul/1mlTip頭各一盒（以上物品均需高壓滅菌），酒精棉球，廢液缸，試管架，微量移液器，記號(hào)筆，培養(yǎng)皿，離心管。(2) 棄掉培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，用1ml的PBS溶液洗滌兩次。(3) 用Tip頭加入1ml Trypsin液，消化1分鐘（37。C，5%C

4、O2 )。用手輕拍培養(yǎng)瓶壁，觀察到細(xì)胞完全從壁上脫落下來為止。(4) 加入1ml的含血清培養(yǎng)基終止反應(yīng)。(5) 用Tip頭多次吹吸，使細(xì)胞完全分散開。(6) 將培養(yǎng)液裝入離心管中，1000rpm離心5min。(7) 用培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)后選擇0.8X106個(gè)細(xì)胞加入一個(gè)35mm培養(yǎng)皿。(8) 將合適體積完全培養(yǎng)液加入離心管中，混勻細(xì)胞后輕輕加入培養(yǎng)皿中，使其均勻分布。(9) 將培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，第二天轉(zhuǎn)染。細(xì)胞轉(zhuǎn)染1）轉(zhuǎn)染試劑的準(zhǔn)備 A. 將400ul去核酸酶水加入管中，震蕩10秒鐘，溶解脂狀物。 B.震蕩后將試劑放在20攝氏度保存，使用前還需震蕩，。2） 選擇合適的混合比例（1：11：2/脂質(zhì)體體積：DNA質(zhì)量）來轉(zhuǎn)染細(xì)胞。在一個(gè)轉(zhuǎn)染管中加入合適體積的無血清培養(yǎng)基。加入合適質(zhì)量的MyoD或者EGFP的DNA，震蕩后在加入合適體積的轉(zhuǎn)染試劑，再次震蕩。5） 將混合液在室溫放置1015分鐘。6) 吸去培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基，用PBS或者無血清培養(yǎng)基清洗一次。7） 加入混合液，將細(xì)胞放回培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一個(gè)小時(shí)。8） 到時(shí)后，根據(jù)細(xì)胞種類決定是否移除混合液，之后加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2448小時(shí)。第二次細(xì)胞傳代1） 在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果并記錄綠色熒光蛋白表達(dá)情況。2） 再次進(jìn)行細(xì)胞傳代，按照免疫染色合適的密度0.8X10