生物化學(xué)教學(xué)課件第十四章dna的生物合成劉皓

1、第三篇 遺傳信息的傳遞 第十九章 細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子機(jī)制,主要內(nèi)容,email:,第三篇 遺傳信息的傳遞,DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯 基因表達(dá)調(diào)控 基因重組與基因工程,（1958，F(xiàn).Crick）,Reverse transcription (1970, H.Temin),第十四章 DNA的生物合成 DNA Biosynthesis (DNA Replication),復(fù)制(replication) 是指遺傳物質(zhì)的傳代，以母鏈DNA為模板合成子鏈DNA的過程。,主要內(nèi)容,復(fù)制的基本特征 DNA復(fù)制的酶學(xué)和拓?fù)鋵W(xué)變化 復(fù)制的過程 逆轉(zhuǎn)錄和其他復(fù)制方式 DNA損傷（突變）與修復(fù),復(fù)制的基本特征 Bas

2、ic Rules of DNA Replication,第一節(jié),半保留復(fù)制(semi-conservative replication) 雙向復(fù)制(bidirectional replication) 半不連續(xù)復(fù)制(semi-discontinuous replication),復(fù)制的基本特征,一、半保留復(fù)制,DNA生物合成時，母鏈DNA解開為兩股單鏈，各自作為模板(template)按堿基配對規(guī)律指導(dǎo)合成與模板互補(bǔ)的子鏈。子代細(xì)胞的DNA，一股單鏈從親代完整地接受過來，另一股單鏈則完全從新合成。由于堿基互補(bǔ)，兩個子細(xì)胞的DNA都和親代DNA堿基序列一致。這種復(fù)制方式稱為半保留復(fù)制。,半保留復(fù)

3、制的概念:,N15 - yellow strand N14 - black strand,G0 G1 G2,heavy,intermediate,light,Meselson-Stahl experiment,DNA centrifuged in Cesium Chloride, heavy DNA settles lower in tube,RP5,N15-DNA,N14-DNA,A G G T A C T G C C A C T G G,T C C A T G A C G G T G A C C,C C A C T G G,G G T G A C C,A G G T A C T G,T C

4、 C A T G A C,T C C A T G A C,A G G T A C T G,A G G T A C T G C C A C T G G,T C C A T G A C G G T G A C C,A G G T A C T G C C A C T G G,T C C A T G A C G G T G A C C,+,母鏈DNA,復(fù)制過程中形成的復(fù)制叉,子代DNA,復(fù)制的分子基礎(chǔ)：堿基配對規(guī)律和DNA雙螺旋結(jié)構(gòu),按半保留復(fù)制方式，子代DNA與親代DNA的堿基序列一致，即子代保留了親代的全部遺傳信息，體現(xiàn)了遺傳的保守性。,半保留復(fù)制的意義:,遺傳的保守性，是物種穩(wěn)定性的分子基礎(chǔ)，但

5、不是絕對的。,二、雙向復(fù)制,復(fù)制時，DNA從特定的起始點(diǎn)(origin，ori)開始向兩個方向解鏈，形成兩個延伸方向相反的復(fù)制叉，稱為雙向復(fù)制。 復(fù)制叉(replication fork)：復(fù)制時DNA雙鏈解開成雙股，各自作為模板，子鏈沿模板延長時所形成的一種字形結(jié)構(gòu)。,A. 環(huán)狀雙鏈DNA及復(fù)制起始點(diǎn) B. 復(fù)制中的兩個復(fù)制叉 C. 復(fù)制接近終止點(diǎn)(termination, ter),真核生物每個染色體有多個起始點(diǎn)，是多復(fù)制子的復(fù)制。習(xí)慣上把兩個相鄰起始點(diǎn)之間的距離定為一個復(fù)制子(replicon) 。復(fù)制子是獨(dú)立完成復(fù)制的功能單位。,三、半不連續(xù)復(fù)制,領(lǐng)頭鏈 (leading strand

6、),隨從鏈 (lagging strand),順著解鏈方向生成的子鏈，復(fù)制是連續(xù)進(jìn)行的，這股鏈稱為領(lǐng)頭鏈(leading strand) 。 另一股鏈因?yàn)閺?fù)制的方向與解鏈方向相反，不能順著解鏈方向連續(xù)延長，這股不連續(xù)復(fù)制的鏈稱為隨從鏈(lagging strand) 。復(fù)制中的不連續(xù)片段稱為岡崎片段(okazaki fragment)。 領(lǐng)頭鏈連續(xù)復(fù)制而隨從鏈不連續(xù)復(fù)制，就是復(fù)制的半不連續(xù)性。,DNA復(fù)制的酶學(xué)和拓?fù)鋵W(xué)變化,第 二 節(jié),The Enzymology and Topology of DNA Replication,DNA復(fù)制的反應(yīng)體系:,底物(substrate): dATP,

7、dGTP, dCTP, dTTP； 聚合酶(polymerase): 依賴DNA的DNA聚合酶，簡寫為 DNA-pol； 模板(template): 解開成單鏈的DNA母鏈； 引物(primer): 提供3-OH末端使dNTP可以依次聚合； 其他的酶和蛋白質(zhì)因子。,參與DNA復(fù)制過程的酶或蛋白質(zhì)因子： a. DNA 聚合酶 (DNA polymerase) b. 與DNA解旋和解鏈有關(guān)的酶： 解螺旋酶 (Helicase) 引物酶 (Primase) 拓?fù)涿?(DNA topoisomerase) 單鏈DNA結(jié)合蛋白 (Single-strand DNA-binding protein , S

8、SB) c. DNA連接酶 (DNA ligase),一、DNA聚合酶,全稱：依賴DNA的DNA聚合酶 (DNA-dependent DNA polymerase) 簡稱：DNA-pol,1.復(fù)制的基本化學(xué)反應(yīng),(dNMP)n + dNTP (dNMP)n+1 + PPi,DNA聚合酶的作用特點(diǎn):,以四種脫氧三磷酸核苷(dNTP)作底物； 需要接受模板的指導(dǎo); DNA新鏈生成需引物3-OH的存在； 新鏈的延長只可沿5 3方向進(jìn)行。,（一）原核生物的DNA聚合酶,DNA-pol (1958, A. Kornberg) DNA-pol DNA-pol ,DNA-pol （109kD）,323個氨基

9、酸,小片段,5 核酸外切酶活性,大片段/Klenow 片段,604個氨基酸,DNA聚合酶活性 5 核酸外切酶活性,N 端,C 端,DNA-pol ,Klenow片段是實(shí)驗(yàn)室合成DNA，進(jìn)行分子生物學(xué)研究中常用的工具酶。,3 5外切酶活性:,5 3外切酶活性:,?,切除引物和突變的 DNA片段。,能辨認(rèn)錯配的堿基對，并將其水解。,核酸外切酶活性:,DNA-pol 功能：對復(fù)制中的錯誤進(jìn)行校讀，對復(fù)制和修復(fù)中出現(xiàn)的空隙進(jìn)行填補(bǔ)。,DNA-pol （120kD）,DNA-pol II基因發(fā)生突變，細(xì)菌依然能存活。 DNA-pol 對模板的特異性不高，即使在已發(fā)生損傷的DNA模板上，它也能催化核苷酸聚

10、合。因此認(rèn)為，它參與DNA損傷的應(yīng)急狀態(tài)修復(fù)。,功能：,DNA-pol (250kD),是原核生物復(fù)制延長中真正起催化作用的酶。,核心酶：，和亞基,原核生物的DNA聚合酶,共性：都具有5-3聚合酶活性和3-5核酸外切酶活性,（二）真核細(xì)胞DNA聚合酶：五種,DNA-pol ,起始引發(fā)，有引物酶活性。,延長子鏈的主要酶，有解螺旋酶活性。,參與低保真度的復(fù)制 。,在復(fù)制過程中起校讀、修復(fù)和填補(bǔ)缺口的作用。,在線粒體DNA復(fù)制中起催化作用。,DNA-pol ,DNA-pol ,DNA-pol ,DNA-pol ,真核生物的DNA聚合酶,(三) DNA聚合酶與復(fù)制的保真性 (fidelity),復(fù)制按

11、照堿基配對規(guī)律進(jìn)行，是遺傳信息能準(zhǔn)確傳代的基本原理。,此外還需酶學(xué)的機(jī)制來保證復(fù)制的保真性。,a. 核酸外切酶活性在復(fù)制中辨認(rèn)切除錯配堿基 并加以校正,核酸外切酶(exonuclease)是指能從核酸鏈的末端把核苷酸依次水解出來的酶，外切酶是有方向性的。,A：DNA-pol的外切酶活性切除錯配堿基；并用其聚合活性摻入正確配對的底物。 B：堿基配對正確， DNA-pol不表現(xiàn)活性。,DNA pol 的校讀功能,b.復(fù)制的保真性依賴正確的堿基選擇,錯配堿基之間難以形成氫鍵 DNA聚合酶對核苷酸的參入有選擇功能,遵守嚴(yán)格的堿基配對規(guī)律； 聚合酶在復(fù)制延長時對堿基的選擇功能； 復(fù)制出錯時DNA-pol

12、的即時校讀功能。,DNA復(fù)制的保真性至少要依賴三種機(jī)制：,二、與DNA解旋與解鏈有關(guān)的酶,DNA分子的堿基埋在雙螺旋內(nèi)部，只有把DNA解成單鏈，它才能起模板作用。,（一）多種酶參與DNA解鏈和穩(wěn)定單鏈狀態(tài),E. Coli 基因圖,1.解螺旋酶(helicase)利用ATP供能，作用于氫鍵，使DNA雙鏈解開成為兩條單鏈。 2.引物酶(primase) 復(fù)制起始時催化游離NTP 聚合生成RNA引物的酶。 3.單鏈DNA結(jié)合蛋白(single stranded DNA binding protein, SSB) 在復(fù)制中維持模板處于單鏈狀態(tài)并保護(hù)單鏈的完整。SSB與DNA單鏈的結(jié)合表現(xiàn)出協(xié)同效應(yīng)。,

13、4.DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶: 改變DNA超螺旋狀態(tài)、理順DNA鏈,復(fù)制過程正超螺旋的形成：,解鏈過程中正超螺旋的形成,既能水解 、又能連接磷酸二酯鍵。,拓?fù)洚悩?gòu)酶 拓?fù)洚悩?gòu)酶,拓?fù)洚悩?gòu)酶分類：,拓?fù)洚悩?gòu)酶作用特點(diǎn)：,拓?fù)洚悩?gòu)酶,切斷DNA雙鏈中一股鏈，使DNA解鏈旋轉(zhuǎn)不致打結(jié)；適當(dāng)時候封閉切口，DNA變?yōu)樗沙跔顟B(tài)。 反應(yīng)不需ATP。,拓?fù)洚悩?gòu)酶,切斷DNA分子兩股鏈，斷端通過切口旋轉(zhuǎn)使超螺旋松弛。 利用ATP供能，連接斷端， DNA分子進(jìn)入負(fù)超螺旋狀態(tài)。,作用機(jī)制：,三、DNA連接酶,催化互補(bǔ)雙鏈DNA中單鏈切口處的相鄰3-OH末端和5-P末端之間生成磷酸二酯鍵，從而把兩段相鄰的DNA鏈連接成一條完

14、整的鏈。,DNA連接酶(DNA ligase)作用方式：,DNA連接酶的作用：,DNA連接酶并不能連接單獨(dú)存在的單鏈DNA缺口，它所連接的都是在堿基互補(bǔ)的基礎(chǔ)上的缺口。 DNA連接酶也可連接DNA兩股鏈都有的缺口，但缺口的堿基必須互補(bǔ)。,a.DNA連接酶在復(fù)制中起最后接合缺口的作用。 b.在DNA修復(fù)、重組及剪接中也起縫合缺口作用。 c.也是基因工程的重要工具酶之一。,功能：,DNA聚合酶，拓?fù)涿负瓦B接酶催化3,5-磷酸二酯鍵生成的比較,DNA生物合成過程 The Process of DNA Replication,第 三 節(jié),（一）復(fù)制起始：DNA解鏈形成引發(fā)體,需要解決兩個問題：,1.

15、DNA解開成單鏈，提供模板。,2. 形成引發(fā)體，合成引物，提供3-OH末端。,一、原核生物的DNA生物合成,E.coli復(fù)制起始點(diǎn) oriC,1. DNA解鏈,富含AT區(qū),識別區(qū),Dna A,Dna B、 Dna C,DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶,引物酶,SSB,3,5,3,5,2. 引發(fā)體(primosome)和引物,含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA復(fù)制起始區(qū)域的復(fù)合結(jié)構(gòu)稱為引發(fā)體。,3,5,3,5,引物是由引物酶催化合成的短鏈RNA分子。,引物,引物酶,復(fù)制起始的順序 DnaA辨認(rèn)結(jié)合Ori識別區(qū)，幾個DnaA蛋白相互靠 近，并使富含AT區(qū)開鏈 DnaC協(xié)同DnaB進(jìn)入起始部位 DnaA 進(jìn)

16、一步解鏈, SSB與解開的單鏈結(jié)合 引物酶（DnaG）進(jìn)入 形成引發(fā)體 以NTP為原料,從5 3合成RNA引物 DNA POL催化第一個dNTP加到RNA引物的3/-OH上,（二）復(fù)制的延長過程：領(lǐng)頭鏈連續(xù)復(fù)制，隨從鏈不連續(xù)復(fù)制,復(fù)制的延長指在DNA-pol催化下，dNTP以dNMP的方式逐個加入引物或延長中的子鏈上，其化學(xué)本質(zhì)是磷酸二酯鍵的不斷生成。,領(lǐng)頭鏈的合成：,領(lǐng)頭鏈的子鏈沿著53方向可以連續(xù)地延長。,隨從鏈的合成,解鏈方向,同一復(fù)制叉上領(lǐng)頭鏈和隨從鏈由相同的DNA-pol催化延長,原核生物基因是環(huán)狀DNA，雙向復(fù)制的復(fù)制片段在復(fù)制的終止點(diǎn)(ter)處匯合。,（三）復(fù)制的終止過程：切除

17、引物、填補(bǔ)空缺、連接切口,隨從鏈上不連續(xù)性片段的連接：,復(fù)制過程簡圖,二、真核生物的DNA合成,端粒(telomere),指真核生物染色體線性DNA分子末端的結(jié)構(gòu)。,端粒的功能：,維持染色體的穩(wěn)定性 維持DNA復(fù)制的完整性,端粒的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：,a.由末端單鏈DNA序列和蛋白質(zhì)構(gòu)成。 b.末端DNA序列是多次重復(fù)的富含G、T堿基的短序列。,TTTTGGGGTTTTGGGG,端粒酶(telomerase),端粒酶RNA (human telomerase RNA, hTR) 端粒酶協(xié)同蛋白(human telomerase associated protein 1, hTP1) 端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hu

18、man telomerase reverse transcriptase, hTRT),組成：,端粒酶兼有提供RNA模板和催化逆轉(zhuǎn)錄的功能。,逆轉(zhuǎn)錄和其他復(fù)制方式 Reverse Transcription 自然進(jìn)化過程中，生物進(jìn)化出一套極其復(fù)雜又高度協(xié)調(diào)的DNA 損傷監(jiān)控和修復(fù)系統(tǒng)，以分別應(yīng)對和修復(fù)種類繁多的DNA損傷,DNA損傷的修復(fù)(repairing)是糾正DNA兩條單鏈間錯配的堿基、清除DNA鏈上受損的堿基或糖基、恢復(fù)DNA的正常結(jié)構(gòu)的過程。,直接修復(fù) 切除修復(fù) 重組修復(fù) SOS修復(fù),修復(fù)的主要類型：,（一）直接修復(fù),光修復(fù)酶(photolyase),UV,嘧啶二聚體的光復(fù)合修復(fù),（二）切除修復(fù):生物界最普遍的一種DNA修復(fù)方式,堿基切除修復(fù) 核苷酸切除修復(fù) 堿基錯配修復(fù),托馬斯林達(dá)爾完成了“堿基切除修復(fù)”的拼圖,在