塊狀非晶態(tài)Mg-Zn-Ca合金在細胞的反應(yīng)與腐蝕.doc

文獻翻譯塊狀非晶態(tài)Mg-Zn-Ca合金在細胞的反應(yīng)與腐蝕摘要：通過塊狀非晶態(tài)Mg-Zn-Ca合金（主要有Mg66Zn30Ca4與Mg70Zn25Ca5）的微觀組織結(jié)構(gòu)觀察、表面性能測試、機械性能檢測、腐蝕與生物毒性的測試，研究驗證其作為生物植入材料的可行性。研究發(fā)現(xiàn)，通過觀察微觀尺度下均勻分布的蝕孔中的腐蝕產(chǎn)物，Mg66Zn30Ca4合金具有與冷軋純鎂和Mg70Zn25Ca5合金相同的腐蝕形態(tài)。其腐蝕產(chǎn)物主要都是與Mg（OH）2和Zn（OH）2，并且腐蝕機理都是一致的。利用L929和MG63細胞株系在合金上進行間接的細胞毒性測試和直接的細胞培植試驗，結(jié)果顯示，Mg-Zn-Ca合金上的細胞存活率較冷軋純鎂上的高，并且發(fā)現(xiàn)L929和MG63細胞在Mg66Zn30Ca4表面上有明顯的黏附和增生。關(guān)鍵詞：鎂合金非晶態(tài)合金機械性能腐蝕細胞毒性1、引言近年，鎂合金作為生物植入材料廣受關(guān)注1-5。引起眾多興趣的原因在于鎂合金具有良好的機械力學性能、生物相容性和可降解性6。有些研究者將人體必需的元素Zn和Ca加入鎂中形成的鎂合金應(yīng)用于鎂合金的生物安全性和生物相容性的研究3-5,7。例如，張等，研究報道過Mg-Zn合金具有很高的抗拉強度（278.5MPa），并且鋅離子的釋放不會對人體造成傷害。我們的研究表明Mg-1Ca合金在骨骼的植入部位的腐蝕降解速率為2.28mg/mm2/yr。并且在鎂合金還會促進植入部位周圍的骨骼組織的生長5。然而，在實際應(yīng)用中，鎂合金的腐蝕降解仍面臨更多的挑戰(zhàn)。第一，原本必需的鎂合金固有的機械強度會隨著腐蝕降解的進行會降低7。張等，曾發(fā)表Mg-Zn合金的機械強度在腐蝕的最初階段下降的速度很快（當合金失重6%時，強度有625MPa降至390MPa）。第二，鎂合金經(jīng)常遭受不同類型的腐蝕。點蝕是鎂合金在中性或堿性溶液中腐蝕的典型模式8，并且腐蝕沿著蝕坑的方向向周圍擴展造成鎂合金在一定的腐蝕時間過后失效5,9。Witte等2，研究表明LAE442和AZ91D合金植入豬腿骨18周后，其表面會呈現(xiàn)不規(guī)則的粗糙表面。我們以前的研究也發(fā)現(xiàn)Mg-1Ca合金在骨骼中的腐蝕出現(xiàn)不同的腐蝕產(chǎn)物5，并且由于點蝕造成的合金表面缺陷也會加快鎂合金機械強度的下降。第三，現(xiàn)在常用的鎂合金在生物體液環(huán)境中的腐蝕降解速度大于骨骼組織的自我恢復(fù)速度5,6,10，并且腐蝕過程會釋放氫氣并使腐蝕環(huán)境的堿化1,11對周圍的生物組織造成危害。因而，研究一種新的鎂基生物材料，使它具有良好的機械性能，較低的腐蝕速度的同時產(chǎn)生同樣的腐蝕產(chǎn)物，應(yīng)用于臨床應(yīng)用是非常必要的。由于鎂基非晶態(tài)合金只具有一種相態(tài)而廣受關(guān)注，其具有與普通鎂合金相同的化學性質(zhì)并且沒有第二相12-14，這些性質(zhì)會使合金的機械性能和腐蝕阻抗增加，并且其腐蝕產(chǎn)物是相同的。鎂基非晶態(tài)合金有著長足的發(fā)展研究，產(chǎn)生包括Mg-Cu-Y、Mg-Ni-Y、Mg-Cu-Gd和Mg-Zn-Ca在內(nèi)的各種合金12。其中，Mg-Zn-Ca展現(xiàn)了非常合適的機械強度，其單位體積質(zhì)量強度（）在250-300MPa.cm3/g范圍內(nèi)15，其比常規(guī)晶態(tài)鎂合金高出40%（鑄造AZ91D和WE43的強度分別為220MPa.cm3/g、176MPa.cm3/g16）。通過增加人體必需的Zn和Ca17,18元素增加合金的生物相容性，使得Mg-Zn-Ca非晶態(tài)合金稱為最合適的生物植入鎂合金。在本次的研究中，著重研究鎂基非晶態(tài)合金具有良好的非晶態(tài)形成能力（GFA），和Mg66Zn30Ca4與Mg70Zn25Ca5的腐蝕產(chǎn)物與細胞相容性。2、試驗2.1.合金制備以純度大于99.9%的Mg、Ca和Zn粒，在氬氣的氣氛的熔爐中進行熔煉，形成均勻的混合（按原子比例混合）的合金。將熔化的合金通過石英管注入直徑為2mm的銅模具中。利用X衍射儀鑒定鑄造Mg-Zn-Ca合金的非晶態(tài)性，通過Rigaku的DMAX2400衍射儀，射線源為CuK靶進行樣品組織分析，并且利用差示掃描量熱法（DSC）（Perkin-Elmer公司，Diamond-DSC測量儀）控制溫差為40K/min的熱傳導進行樣品與參比物的功率差和溫度的關(guān)系。將鑄造Mg66Zn30Ca4和Mg70Zn25Ca5合金樣品切割為2mm厚度的圓盤并用2000號砂紙將其表面打磨光滑，然后進行電化學試驗。所有的樣品必須經(jīng)過丙酮、無水乙醇和蒸餾水的超聲波清洗。對于要進行細胞培植試驗的磁盤狀樣品，必須在紫外線輻射下照射至少2h進行滅菌處理。2.2.機械性能測試拉伸性能測試試驗是按照ASTM標準進行，試樣為2mm長為4mm的圓柱。在室溫中，利用8562拉伸輕度試驗儀在210-4s-1的應(yīng)變率的速度下進行單向靜壓縮試驗。2.3.電化學測試電化學特征常用三電極電池裝置測量，試驗用鉑作輔助電極，飽和甘汞電極（SCE）作為參比電極。在試樣上連接導線，除試樣末端的表面（裸露部分表面積為3.14mm2）暴露在溶液中，其他部位用環(huán)氧樹脂嚴格密封。電化學試驗都是在CHI600C電化學工作站，在溫度為37的模擬體液（SBF，NaCl8.035g,NaHCO30.355g,KCl0.225g,K2HPO4.3H2O0.231g,MgCl2.6H2O0.311g,CaCl20.292g,Na2SO40.072g,(HOCH2)3CNH26.118g）中進行。測量開路電位（OCP）4000s。鎂合金的動電位極化曲線測試時電位掃描速度為1mv/s,并且在4000s的開路電位測量之后用小于腐蝕電位（Ecorr）的300mv初始電壓開始測量。極化曲線測量完成后樣品經(jīng)丙酮、蒸餾水清洗干凈后風干。用掃描電子顯微鏡（ESEM，Quanta200FEG）進行樣品表面腐蝕形貌的觀察。之后，將試樣浸入含三價鉻的溶液（180g/lCrO3）中5-10分鐘，用來清洗表面的腐蝕產(chǎn)物。將清洗風干后的試樣再次放在掃描電子顯微鏡（ESEM）下觀察并記錄腐蝕形貌。采用Kratos的AXIS-Ultra標準分析有X射線光電子能譜采集的數(shù)據(jù)，X射線光電子能譜儀的射線源為單色AlK(225W,15mA,15kV),同時采用低能量的電子流進行電荷補償。為了消除表面荷電效應(yīng)的影響，利用C1s譜峰值為284.80eV的標準烴進行校準。最后將實驗數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為VAMAS格式輸入CasaXPS軟件進行曲線擬合與數(shù)據(jù)分析。2.4.生物毒性測試小鼠的成纖維細胞（L929）與人體骨肉瘤細胞（MG63）常用于體外細胞培植試驗。它們在Dulbecco-Eagle培養(yǎng)液（DMEM）中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)液包括10%的胎牛血清（FBS）、100U.ml-1青霉素、100ug.ml-1鏈霉素，在37，含5%CO2的加濕氣氛中試驗。常用體外培養(yǎng)液為無血清的DMEM培養(yǎng)液中進行，其表面積與浸提介質(zhì)比值為1cm2/ml，在37、含5%CO2的加濕氣氛中進行72h的細胞培植，并且經(jīng)過離心機分離，將上層的清液去除，然后在4溫度下保存。利用DMEM培養(yǎng)液與含10%DMSO的DMEM培養(yǎng)液作為對比試驗的陰性對照液和陽性對照液進行細胞毒性試驗。細胞培養(yǎng)于96孔的細胞培養(yǎng)板上，每孔附著的細胞與培養(yǎng)液數(shù)量比為5103個細胞/100ul，培養(yǎng)24h。去除培養(yǎng)液，每孔加入100ul的提取液，在37，含5%CO2的加濕氣氛中培養(yǎng)的第1、3、5天，用光學顯微鏡觀察96孔培養(yǎng)板各孔的情況，隨后在每孔中添加10ulMTT溶液。試樣在MTT溶液中繼續(xù)在37，5%CO2中培養(yǎng)4h,然后在每孔中添加甲臜溶解液（含每毫升10%SDS的HCl）。通過酶標儀（Bio-RAD680）測定吸光度，采用雙波長測定利用波長為570nm和630nm進行測定。并且在不同的時間點進行PH值測定和提取Mg、Zn、Ca離子進行測定。2.5.細胞黏附測試將200ul細胞懸浮液接種到Mg66Zn30Ca4、Mg70Zn25Ca5和冷軋純鎂試樣（對照）的表面，細胞密度為1105個細胞/ml（L929），5104個細胞（MG63）。分別在37，5%CO2中的96孔培養(yǎng)板上培養(yǎng)1,3和5天后，在室溫下的2.5%戊二醛溶液中浸泡2h，之后用磷酸鹽緩沖液（PBS，PH=7.4）沖洗3次。隨后在不同梯度的乙醇/蒸餾水（50%，60%，70%，80%，90%，100%）中進行脫水，接著在六甲基二硅胺烷試劑（HMDS）中干燥。對細胞黏附的樣品表面用掃描電子顯微鏡觀察并記錄形貌特征。并增加不同PH值下的鎂合金的對照試驗。3、試驗結(jié)果3.1.微觀組織和機械性能圖1所示為Mg66Zn30Ca4、Mg70Zn25Ca5和鑄態(tài)純鎂的XRD譜，由圖可以發(fā)現(xiàn)兩種Mg-Zn-Ca合金具有典型的非晶態(tài)花樣，其XRD譜沒有晶粒體的衍射峰，反而在38和66方向出現(xiàn)明顯的散射信號。相對于Mg66Zn30Ca4試樣，Mg70Zn25Ca5在低角度出現(xiàn)更寬闊的散射峰，其原因可能在于其鎂的含量高的緣故，我們都知道鎂的原子半徑大于鋅原子15。圖1.Mg66Zn30Ca4、Mg70Zn25Ca5和鑄態(tài)純鎂的XRD譜圖2所示為Mg66Zn30Ca4、Mg70Zn25Ca5和鑄態(tài)純鎂的曲線DSC（差示掃描量熱法）曲線。Mg66Zn30Ca4的玻璃花溫度（Tg）和第一個結(jié)晶化溫度（Tx1）都高于Mg70Zn25Ca5。趙等19，也發(fā)現(xiàn)在Mg-Zn-Ca合金中隨著鎂的增加，合金的Tg與Tx1都會下降。圖2.Mg66Zn30Ca4、Mg70Zn25Ca5和鑄態(tài)純鎂的DSC曲線圖3所示為Mg66Zn30Ca4與Mg70Zn25Ca5在壓縮試驗中的典型應(yīng)力應(yīng)變曲線。Mg66Zn30Ca4與Mg70Zn25Ca5的斷裂強度分別為（565.823.2）MPa和（531.222.8）MPa，二者都高于鑄態(tài)純鎂的（198.14.5）MPa20。圖3.Mg66Zn30Ca4和Mg70Zn25Ca5的壓縮時應(yīng)力應(yīng)變圖3.2.電化學行為測量結(jié)果圖4所示為Mg66Zn30Ca4、Mg70Zn25Ca5和鑄態(tài)純鎂在模擬體液中的OCP（開路電位）圖。兩種Mg-Zn-Ca合金的OCP在開始的1000s時快速增加，而且很明顯發(fā)現(xiàn)二者都高于鑄態(tài)純鎂。Mg66Zn30Ca4試樣呈現(xiàn)比Mg70Zn25Ca5更高的開路電位，其原因可能在于合金中Zn含量不同，由于Zn的電極電位（-1.02VSCE）高于Mg的電極電位（-1.65VSCE）9。另外，Mg70Zn25Ca5和鑄態(tài)純鎂的開路電位有明顯的波動，而Mg66Zn30Ca4得開路電位要穩(wěn)定的多。如圖4（b）所示，兩種Mg-Zn-Ca合金的陰陽極反應(yīng)的動態(tài)極化電位高于鑄態(tài)純鎂。隨著合金中的Zn的含量增加，會使合金的穩(wěn)定性增加并降低Mg的析氫反應(yīng)21,22。Mg66Zn30Ca4、Mg70Zn25Ca5和鑄態(tài)純鎂的腐蝕電流密度Icorr分別是3.53uA/cm2，11.2uA/cm2和36.8uA/cm2。通過試驗結(jié)果可以推斷兩種Mg-Zn-Ca合金的腐蝕阻抗比鑄態(tài)純鎂高，并且Mg66Zn30Ca4的阻抗高于Mg70Zn25Ca5。圖5所示為浸泡10min前后試樣的SEM圖，Mg66Zn30Ca4浸泡前后的腐蝕形貌比較類似，而且裂紋很少，然而Mg70Zn25Ca5和鑄態(tài)純鎂可以發(fā)現(xiàn)很明顯很深的裂紋。在去除腐蝕產(chǎn)物后，在Mg66Zn30Ca4的表面發(fā)現(xiàn)很多微觀孔洞（2-10um），而鑄態(tài)純鎂會出現(xiàn)更大的不對稱分布的孔洞（10-60um）。而XPS試驗結(jié)果顯示Mg-Zn-Ca合金的腐蝕產(chǎn)物由Mg、Zn、Ca和O組成，并且在Mg66Zn30Ca4的表面發(fā)現(xiàn)的ZnO和O2-含量高于Mg70Zn25Ca5。3.3.浸泡測試圖6所示為鑄態(tài)純鎂和Mg-Zn-Ca合金在模擬體液中腐蝕時對溶液PH值的改變。結(jié)果顯示Mg66Zn30Ca4對PH值的改變速度慢于鑄態(tài)純鎂和圖4.（a）開路電位圖（b）Mg66Zn30Ca4、Mg70Zn25Ca5和鑄態(tài)純鎂的動態(tài)電位極化曲線Mg70Zn25Ca5。并且，鑄態(tài)純鎂和Mg66Zn30Ca4在部分區(qū)域出現(xiàn)穩(wěn)定的上升速度。圖7所示為Mg66Zn30Ca4、Mg70Zn25Ca5和鑄態(tài)純鎂在模擬體液中不同時間的表面腐蝕形貌圖。Mg66Zn30Ca4試樣在37的模擬體液中浸泡3天后其表面較為平坦，表面腐蝕產(chǎn)物包含C、O、Mg、P、Ca、Zn元素，并且Zn的含量比Mg還高。在Mg70Zn25Ca5的表面可以觀察到可見的微觀孔洞，并且其EDS（能量色散譜）結(jié)果顯示Zn的含量高于Mg，圖5.(a)Mg6