組化3第三章酶組化.ppt

第三章 酶組織化學(xué)方法 第一節(jié)概述,酶是生物體內(nèi)具有催化作用的特異性蛋白質(zhì)，細(xì)胞內(nèi)新陳代謝的合成和分解的生物化學(xué)反應(yīng)都有酶的參與，因此，又稱其為生物催化劑。 組織化學(xué)中的酶反應(yīng)是指在一定的條件下，使組織細(xì)胞內(nèi)的酶通過作用于酶的底物，使后者被分解形成某種初級反應(yīng)產(chǎn)物，這種產(chǎn)物被捕捉劑所捕獲而沉淀于原位上，然后將這種沉淀物變成具有可見性的最終產(chǎn)物，從而間接證明酶的定位。,酶酶的底物 最初的反應(yīng)物另外物質(zhì) （金屬鹽） 不溶于水的顯色產(chǎn)物,酶的分類： 1.氧化還原酶：是催化氧化還原反應(yīng)的酶。 2.轉(zhuǎn)移酶:是催化功能基團(tuán)轉(zhuǎn)移的酶。 3.水解酶:是催化水解反應(yīng)的酶。 4.裂解酶:是催化分裂或合成化合物的酶。 5.異構(gòu)酶:是催化同分異構(gòu)體相互轉(zhuǎn)化的酶。 6.合成酶:是催化將兩種物質(zhì)合成一各物質(zhì),并必 須與ATP分解相偶聯(lián)的酶。,酶組織化學(xué)反應(yīng)中注意事項(xiàng),在制備標(biāo)本及組化實(shí)驗(yàn)中必須做到既要最大限度地保存酶的活性，又要保存好組織細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)，以保證酶在組織細(xì)胞中準(zhǔn)確定位。 酶反應(yīng)的溫度、時間、PH必須控制好。 試劑的濃度配制必須準(zhǔn)確。 所用器皿必須清潔，以防污染及出現(xiàn)假陽性。 必須做陽性或陰性對照試驗(yàn)。,第二節(jié) 若干酶組織化學(xué)反應(yīng)程序,一、 堿性磷酸酶 （一）名稱： 常用名：堿性磷酸酶（alkaline phosphatase, ALP） 水解酶，在堿性環(huán)境下催化水解磷酸脂生成磷酸和醇。在運(yùn)輸較為活躍的細(xì)胞膜上廣泛分布，如毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、肝內(nèi)毛細(xì)膽管膜、腎近曲小管的刷狀緣、腸上皮的紋狀緣和神經(jīng)細(xì)胞的突觸膜等。,(二) 反應(yīng)原理：,ALP在有激活劑（Mg 2 +）存在和PH9.4時，將其磷酸鹽底物（如一甘油磷酸鈉、一苯酚磷酸鈉）分解產(chǎn)生甘油鈉和磷酸離子，后者被孵育液中的氯化鈣所捕獲，在有酶活性存在處生成磷酸鈣沉淀，但為非金屬鹽，需要加入硝酸鈷，從而生成無色磷酸鈷沉淀，再通過硫化銨處理，形成棕黑色硫化鈷。,（三） 光鏡顯示法 Gomori 改良鈣鈷法 1）溶液的配制： 孵育液： 3甘油磷酸鈉 10ml 2巴比妥鈉 10ml 2氯化鈣（2.7%CaCl22H2O）20ml 5%硫酸鎂(MgSO47H2O) 1ml 蒸餾水 5ml 調(diào)此液pH至9.4,可冰箱保存。 2硝酸鈷（Co(NO3) 2） 0.5%硫化銨(NH4)2S)(新配),2)染色步驟: 石蠟切片脫蠟入水,或冰凍切片或 經(jīng)10%福爾馬林固定 15min; 入孵育液,37 30-40min (腎組織 10min, 肝組織60min); 流水沖洗5min ;, 2%（Co(NO3) 2)5 min; 蒸餾水洗; 1%(NH4)2S 1 min; 蒸餾水洗; 甘油明膠封片; 3）對照:孵育液中去除-甘油磷酸鈉 。 4）染色結(jié)果： ALP活性的最終反應(yīng)產(chǎn)物為棕黑色硫化鈷沉淀。,5）說明： 鈣鈷法在一般實(shí)驗(yàn)室仍是常用的方法，但因其化學(xué)反應(yīng)多次轉(zhuǎn)換，容易造成定位不準(zhǔn)確；石蠟切片雖然也能顯示ALP活性，但經(jīng)石蠟包埋處理（包括酒精、二甲苯、高溫等），酶活性喪失大部分。,二、酸性磷酸酶 （一）名稱： 常用名：酸性磷酸酶（acid phosphaatase, ACP） 主要位于細(xì)胞內(nèi)的溶酶體內(nèi)，是溶酶體 的標(biāo)志酶。此外，尚有非溶酶體性ACP。 ACP在細(xì)胞退變過程中活性最強(qiáng)，在核酸和蛋白質(zhì)代謝活動增強(qiáng)時，也見ACP活性增強(qiáng)。ACP也參與脂肪代謝。在神經(jīng)傳導(dǎo)沖動時，ACP參與Ca 2 +依賴的神經(jīng)遞質(zhì)釋放過程?？傊?，在疾病、免疫反應(yīng)和細(xì)胞損傷與修復(fù)過程中ACP均具有一定的生物學(xué)意義。,（二）反應(yīng)原理,顯示酸性磷酸酶，先將切片放入含有酶底物（ -甘油磷酸鈉 ）的溶液（PH5.0）中孵育，底物經(jīng)酶水解，釋放磷酸，用捕捉劑硝酸鉛與磷酸反應(yīng)，形成微細(xì)的磷酸鉛，沉淀于酶存在的部位，再用硫化銨處理，磷酸鉛被置換形成粗顆粒狀的黑色硫化鉛沉淀物，便可用光鏡看到。,（三）光鏡顯示ACP有鉛法和偶氮偶聯(lián)法： 1、 鉛法： 1）孵育液的配制： 0.05mol/L醋酸鹽緩沖液,pH5.0 10ml 蔗糖 0.8 g 硝酸鉛 Pb(NO3)2 10mg 3%(約0.1mol/ L)-甘油磷酸鈉 1 ml 按上述順序加入,待硝酸鉛完全溶解后再逐滴 加入底物,邊加邊攪至溶液完全透明。,2) 染色步驟： 石蠟切片脫蠟到水；冰凍切片或冰凍切 片冷福爾馬林鈣固定10 min后水洗； 入孵育液24 h（肝組織1 h左右）， 37； 雙蒸餾水洗； 入1硫化銨（新配）溶液內(nèi)12 min 流水洗。,1 3）對照： 在孵育液內(nèi)加入0.01 mol/L氟化鈉 (NaF)抑制劑后,ACP 反應(yīng)呈陰性。 M 4）染色結(jié)果： ACP呈棕黑色硫化鉛顆粒。 5）說明： ACP是可溶性酶，以冷固定后結(jié)果 較滿 意.石蠟切片制作過程易使酶 失活。,三、核苷酸酶 （一）名稱 常用名： 核苷酸酶（Nucleotidase）,核苷酸酶是一種特異性的磷酸單酯酶，它能水解核糖核苷和去氧核糖核苷在5位置的磷酸酯，如一磷酸腺苷（），一磷酸肌苷（），尿苷磷酸（UMP）,胞苷磷酸（）等，水解產(chǎn)生核苷和磷酸，但不能分解甘油磷酸，葡萄糖磷酸。核苷酸酶是一種最適p值相當(dāng)廣泛的酶。,（二）反應(yīng)原理,底物經(jīng)酶水解，用金屬離子捕捉生成的磷酸離子而形成沉淀。即：腺苷磷酸水 腺苷磷酸。,（三）光鏡顯示方法 鉛法（Wachs和Meisel 1956） （1） 取材：新鮮組織冰凍切片 （2） 孵育液的配制： 腺苷磷酸鈉 4mg 0.2M Tris-蘋果酸緩沖液 （Tris-maleate buffer）p7.4 4ml 0.1M MgSO4(2.5%） 1ml 2%硝酸鉛 0.6ml 蒸餾水 0.4ml,（1）方法與步驟： 新鮮組織冰凍切片,或冷10%福爾馬林 固定冰凍切片; 蒸餾水水洗; 入孵育液,恒溫37,孵育2060分鐘; 自來水洗; 入1%硫化銨1分鐘; 蒸餾水沖洗; 甘油明膠封固。,(4)結(jié)果與評價: 棕黑色硫化鉛沉淀為酶活性所在部位。 (5)對照: 可除去底物,或以甘油磷酸鈉代替底 物,或加入堿性磷酸酶抑制劑溴化四唑草 酸鹽可防止雜入的堿性磷酸酶起作用。,四、 葡萄糖6磷酸酶 (一)名稱 常用名: 葡萄糖6磷酸酶（Glucose-6- phosphatase Phosphohydro- lase）,葡萄糖6磷酸酶是一種催化多種磷酸化合物水解的磷酸酶。例如它可以最快的速度催化葡萄糖6磷酸水解,也可以水解阿洛糖-6-磷酸、1,5-山梨醇聚糖-6-磷酸、甘露糖-6-磷酸、半乳糖-6-磷酸、核酸5磷酸及2-甘油磷酸,同時此酶還可水解焦磷酸、核苷三磷酸,果糖-6-磷酸、氨甲?；?磷酸、磷酸烯醇丙酮酸、磷酰胺鹽和某些其它焦磷酸化合物。,（二）光鏡顯示方法 鉛法（Wachstei和Meisel 1956） （1）原理：葡萄糖6磷酸被釋放出磷酸后，為硝酸鉛所捕獲，最終反應(yīng)產(chǎn)物為顆粒狀的硫化鉛沉淀。 （2）孵育液的配制： 0.125%葡萄糖6磷酸鈉 4ml 0.2M Tris-蘋果酸（Tris-Moleate） 緩沖液p6 4ml 2%Pb(N03)2 0.6ml 蒸餾水 1.4ml 新鮮配制,充分混合后使用。,（1）方法與步驟： 新鮮組織,冰凍切片, 3%冷福爾馬林固定5分鐘; 水洗； 入孵育液,恒溫37,孵育520分鐘; 水洗； 入1%硫化胺1分鐘; 水洗； 3中性福爾馬林液后固定10分鐘； 甘油明膠封固。,(4)結(jié)果與評價: 棕色硫化鉛顆粒為活性所在部位。 (5)對照: 除去底物；以甘油磷酸鈉代替葡 萄糖6鈉鹽 ；以0.01M氟化鈉作抑 制劑。,五、三磷酸腺苷酶 (一)名稱 常用名: 三磷酸腺苷酶（Adenosine triphosphatase， ATPase）,(二)反應(yīng)原理 ATP酶是分解ATP產(chǎn)生ADP和磷酸的酶。ATPase水解磷酸之間的高能鍵，釋放大量的能量，而不是水解磷酸與碳之間的鍵。釋放出來的磷酸離子被鉛離子捕獲，而通過形成硫化鉛沉淀顯色。最適p7.2。,根據(jù)ATP酶對激活劑、抑制劑的不同反應(yīng)，以及超微定位觀察，生物體內(nèi)主要有三種三磷酸腺苷酶（ATPase）。 1、膜ATP酶：又分為Na+、K+激活 ATPase 和Mg2+激活A(yù)TPase； 2、肌球蛋白ATP酶：又稱Ca2+激活 ATPase，因?yàn)樗杀籆a2+激活； 3、線粒體ATP酶：由Mg2+激活的ATPase,（三）光鏡顯示方法 1、Mg2+激活的三磷酸腺苷酶鉛法 （1）原理：ATP酶分解ATP釋放出來的磷酸離子被鉛離子捕獲，通過形成硫化鉛沉淀顯色。最適p值為7.2。,（2）孵育液的配制： 三磷酸腺苷鈉鹽 5mg 0.2M Tris-鹽酸（Tris-HCl buffer） 4ml 2%Pb(N03)2 0.6ml 0.1M MgSO4 1ml 蒸餾水 4.4ml 配制時Pb(N03)2 要逐滴加入，并隨時攪拌，使充分混合至無色或淡乳白色。,（1）方法與步驟： 新鮮組織,冰切片； 入孵育液，恒溫37孵育2040分鐘 蒸餾水洗； 入1%硫化胺1分鐘; 流水洗； 甘油明膠封固。,(4)結(jié)果: 酶活性處呈棕黑色硫化鉛沉淀。 (5)對照: 除去底物，則反應(yīng)為陰性；以甘油磷酸鈉代替底物，顯示染色反應(yīng)為堿性磷酸酶的定位。,2、Ca2+激活的三磷酸腺苷酸 鈣-鈷法（肌球蛋白型ATPase Padykula和Herman 1995） （1）原理：此法類似堿性磷酸酶的鈣-鈷法，但底物改用三磷酸腺苷鈉鹽，最適p值為9.0，對Mg2+型ATPase起抑制作用。 （2）孵育液的配制： 三磷酸腺苷鈉鹽 60mg 0.1M巴比妥鈉 4ml 蒸餾水 2ml 0.18M CaCl2 2ml 2,4二硝基苯酚 30mg,（1）方法與步驟： 新鮮組織,冰凍切片； 入孵育液，恒溫37孵育2040分鐘 蒸餾水洗； 1CaCl2溶液換洗三次，每次2分鐘 蒸餾水洗； 入CoCl2液5分鐘; 流水洗； 入硫化胺液1分鐘； 流水洗； 甘油明膠封固。,(4)結(jié)果與評價: 硫化鈷黑色沉淀為酶活性所在部位。 (5)對照: 同鉛法，可除去底物或用甘油磷酸鈉作底物。,六、非特異性酯酶 （一）名稱 常用名： 非特異性酯酶Nonspecific esterase） (二) 反應(yīng)原理 隨各種方法的不同，其原理不相同。,（三）、光鏡顯示方法 1、偶氮色素法（偶聯(lián)偶氮色素法） 由于使用不同的重氮鹽，具體方法也不相同，現(xiàn)分述如下： (1) 萘酚AS乙酸鹽（Naphthol AS acetate）法 1）孵育液的配制： 1萘酚AS乙酸鹽（丙酮溶液） 0.1ml 0.05磷酸緩沖液（pH 7.0） 10ml 堅(jiān)牢藍(lán)B鹽 30mg （攪拌過濾使用）,2）方法與步驟： 新鮮組織恒冷箱切片，適當(dāng)固定； 入孵育液，室溫或37恒溫孵育2030分鐘 流水輕沖洗2分鐘； 2甲基綠復(fù)染細(xì)胞核； 流水沖洗35分鐘； 甘油明膠封固。 3）結(jié)果與評價： 酶活性部位呈黑色，胞核為綠色。活性部位的染色根據(jù)重氮鹽的不同而不同，堅(jiān)牢紅TR為紫紅色，堅(jiān)牢藍(lán)RR為青銅色。,七、脂酶 （一）、名稱 常用名：脂（肪）酶（Lipase） (二)、反應(yīng)原理 脂酶又名甘油酯水解酶，它能催化長鏈脂肪酸甘油（或其它醇）酯水解，Ca2+、Sr2+、Mg2+、半胱氨酸、巰基乙酸和?；悄懰猁}（taurocholate）均能激活脂酶。,（三）、光鏡顯示方法 1、硫化鉛法 （1）原理：以吐溫為底物，在脂酶的作用下，分離出來的脂肪酸可與鈣形成鈣皂沉淀，進(jìn)一步以鉛置換鈣，最后再經(jīng)硫化銨生成棕黑色硫化鉛沉淀。 （2）孵育液的配制： 5吐溫60（或80）水溶液 2ml 0.2M Tris緩沖液（pH7.27.4） 5ml 10%氯化鈣 2ml 蒸餾水 40ml,（3）方法與步驟： 將冰凍切片或福爾馬林固定的冰凍切片 水洗 入孵育液，恒溫37,孵育23小時； 1%CaCl2 液內(nèi)浸洗; 1Pb(NO3)2浸15分鐘; 流水沖洗5分鐘； 0.50.1%硫化銨液內(nèi)1分鐘； 水洗； 甘油明膠封固。,(4)結(jié)果與評價： 磷酸黑色硫化鉛沉淀為酯酶活性所在部位。 （5）對照： 去除底物吐溫60（或80），反應(yīng)即為陰性。,八、乙酰膽堿酯酶和膽堿酯酶 (一) 名稱 常用名:乙酰膽堿酯酶(Acetylcholinesterase), 膽堿酯酶(cholinesl-eraes) (二)反應(yīng)原理 廣義的膽堿酯酶可分為乙酰膽堿酯酶(AChE)和狹義的膽堿酯酶(ChE)兩大類。二者的化學(xué)性質(zhì)不同。用酯來檢測底物特異性時，AchE能最快地促進(jìn)乙酰膽堿分解，也能分解乙?；谆憠A，但不能分解苯甲酰（基）膽堿，同時，此酶能被高濃度的乙酰膽堿所抑制，但是ChE則不同，乙酰膽堿濃度越高，越能被ChE所分解。,（一）光鏡顯示方法 1、亞鐵氰化銅法 （1）原理：利用乙酰膽堿酯酶能將乙（或丁）酰硫膽堿鹽水解產(chǎn)生硫膽堿，使鐵氰化物還原為亞鐵氰化物，后者與銅離子結(jié)合成亞鐵氰化銅（Copper ferrocy anide）而呈色沉淀。證明酶活性的存在。若用四異丙基焦磷酰胺 (Tetra isopropyl pyrophospho ramide),抑制非特異性膽堿酯酶，就可以單獨(dú)顯示膽堿酯酶（AChE）。,（2）孵育液的配制： 乙酰硫膽堿碘鹽(acetyl thiocholine iodide) 5mg 0.1M醋酸緩沖液pH5.5(acetate buffer) 6.5ml 0.1M （2.94%）檸檬酸鈉 0.5ml 30mM(0.75)CuSO4 1.0ml 蒸餾水 1ml 5mM(0.164%)鐵氰化鉀(potassium ferricyanide) 1ml 乙酰硫膽堿碘鹽完全溶解于醋酸緩沖液后， 依次入其他溶液，臨