【SN商檢標(biāo)準(zhǔn)】snt 1134-2002 進(jìn)出口肉及肉制品中維吉尼霉素 殘留量檢驗(yàn)方法 杯碟法.doc

method for the determination of virginiamycin residues in meats and meat products for impor-t-cyalnidnderxpomretthodsnt 1132002前言本標(biāo)準(zhǔn)中的測(cè)定方法是采用日本厚生省1990年所編制的畜、水產(chǎn)食品中的殘留物質(zhì)檢驗(yàn)方法中維吉尼霉素檢驗(yàn)方法，其技術(shù)內(nèi)容與原方法相 同，具體操作方法稍加改動(dòng)，經(jīng)試驗(yàn)和驗(yàn)證后，按規(guī)定要求作了編輯性修改。本標(biāo)準(zhǔn)中同時(shí)制定了抽樣和制樣方法。測(cè)定低限是根據(jù)國(guó)際上對(duì)肉品中維吉尼霉素殘留量和測(cè)定方法靈敏度而制定的。 本標(biāo)準(zhǔn)的附錄a是規(guī)范性附錄，附錄b是資料性附錄。 本標(biāo)準(zhǔn)由國(guó)家認(rèn)證認(rèn)可監(jiān)督管理委員會(huì)提出并歸口。 本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：中華人民共和國(guó)天津出入境檢驗(yàn)檢疫局。 本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：王素琴、何霖、孫俐、陳子紅。 本標(biāo)準(zhǔn)系首次發(fā)布的出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。1 范圍 本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了進(jìn)出口肉及肉制品中維吉尼霉素殘留量檢驗(yàn)的抽樣、制樣和杯碟測(cè)定方法。 本標(biāo)準(zhǔn)適用于進(jìn)出口凍雞肉中維吉尼霉素殘留量的檢驗(yàn)。2 抽樣和制 樣2.1 檢驗(yàn)批以不超過(guò)2 50為一檢驗(yàn)批。同一檢驗(yàn)批的商品應(yīng)具相同的特征，如包裝、標(biāo)記、產(chǎn)地、規(guī)格和等級(jí)等。2.2 抽樣數(shù)量批量件最低抽樣數(shù)件12512 100510 2501025 5001550 1 000171 0012 500202.3 抽樣方法 按2.2規(guī)定的抽樣件數(shù)隨機(jī)抽取，逐漸開啟。每件至少一袋為原始樣品。如每件中無(wú)小包裝或有小包裝，但每袋重量超過(guò)2 k則可用滅菌刀從每件中割取不少于100樣g 品，混合后置于清潔容器內(nèi)作為混合樣品。原始樣的總量不少2 k，加封后標(biāo)明標(biāo)記，及時(shí)送交實(shí)驗(yàn)室。2.4 試樣制備進(jìn)出口肉及肉制品中 維吉尼 霉素殘留量 檢驗(yàn) 方法杯 碟法從原始樣品中取出部分有代表性的樣品，將可食部分用絞碎機(jī)絞碎，充分混勻，用四分法縮分至不少于500封后，標(biāo)明標(biāo)記。2.5 試樣保存，g 作為試樣，裝入清潔容器內(nèi)，密注：在抽樣和制樣的操作過(guò)程中，必須防止樣品受到污染后發(fā)生殘留物含量的變化。3 測(cè)定方法3.1 方法提要 用乙醇提取試樣中殘留的維吉尼霉素，經(jīng)均質(zhì)、離心后取上清液作為樣液，取上清液與結(jié)膜干燥棒桿菌作用，根據(jù)產(chǎn)生抑菌圈直徑大小，并查閱標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出樣品中維吉尼霉素的殘留量。3.2 試劑和材料 除另有規(guī)定外，所用試劑均為分析純，水為蒸餾水。本方法標(biāo)準(zhǔn)品及其標(biāo)準(zhǔn)溶液均以效價(jià)計(jì)。3.2.1 無(wú)水乙醇。3.2.2 無(wú)水甲醇。3.2.3 甲醇+水(1+2)。3.2.4 生理鹽水：稱取8.5氯g 化鈉，溶于1 000水ml中，121滅菌15 mi。3.2.5 磷酸二氫鉀。3.2.6 磷酸氫二鈉。3.2.7 磷酸鹽緩沖液(ph6.o)：稱取3.5磷g 酸二氫鉀(精確至0.1 g溶于400 m水中，另外稱取3.0磷g 酸氫二鈉(精確至0.1 g，溶于400 m水中，將兩種溶液混合在一起定容至1 000。ml3.2.8 維吉尼霉素標(biāo)準(zhǔn)品。3.2.9 維吉尼霉素標(biāo)準(zhǔn)貯備液：準(zhǔn)確稱取適量的維吉尼霉素標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶液(3.2.3)溶解后定容至50 m，配成1 000gml的維吉尼霉素標(biāo)準(zhǔn)貯 備液，于4保存，一周內(nèi)使用。3.2.10 維吉尼霉素標(biāo)準(zhǔn)工作液：吸取一定量的標(biāo)準(zhǔn)貯備液，用磷酸鹽緩沖液分別稀釋成濃度為o.025gml、0.05gml、0.1gml、0.2gml、0.4gml和0.8gml標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，以上稀釋均須當(dāng)日配制。3.2.11 實(shí)驗(yàn)菌種：結(jié)膜干燥棒桿菌(corynebacterium xerosis。)3.2.12 培養(yǎng)基i(見附錄a1)。3.2.13 培養(yǎng)基(見附錄a2)。3.2.14 培養(yǎng)基(見附錄a3)。3.3 儀器和設(shè)備3.3.1 游標(biāo)卡尺：測(cè)量范圍0 m200 m，精度0.02 m，或抑菌圈測(cè)量?jī)x。3.3.2 牛津杯：高10 m0.1 m內(nèi)徑6.o m0.1 m，外徑8.o m0.1 m。將試樣于一18以下冷凍保存。3.3.3 離心機(jī)：不低于3 000 rmin。3.3.4 恒溫培養(yǎng)箱：301，361，501，隔板保持水平。3.3.5 高壓滅菌器。3.3.6 絞碎機(jī)：不低于3 000 rmin。3.3.7 均質(zhì)器：不低于10 000 rmin，帶均質(zhì)杯250 m。3.3.8 培養(yǎng)皿：內(nèi)徑90 m，底部平整光滑的玻璃皿或塑料皿，并應(yīng)配有陶瓦蓋。3.3.9 其他：玻璃板、吸管、毛細(xì)管等。3.4 測(cè)定步驟準(zhǔn)確稱取10液。試g 樣(精確至0.1 g于均質(zhì)杯中，加入10 m乙醇，均質(zhì)2 mi后移人離心管中，以3 000 rmin離心20 mi，取其上清液，作為試3.4.2 菌液的制備將實(shí)驗(yàn)菌種(3.2.11)安瓿瓶的上部消毒后敲碎，加入少量培養(yǎng)基于試驗(yàn)菌種中，使其充分溶解并移至盛有培養(yǎng)基的試管中混均，置371培養(yǎng)24，h 將培養(yǎng)物劃線接種到培養(yǎng)基i斜面上。用適量滅菌生理鹽水沖洗菌苔并轉(zhuǎn)入滅菌試管中，4保存，可使用一周。3.4.3 測(cè)定3.4.3.1 平板制備將培養(yǎng)基熔化并冷卻至501，加入適量的菌液，使之充分混合后，取8 m注入滅菌平皿中，保持水平，待其凝固后備用。 測(cè)定前，須先用0.05gml及0.2 gml的維吉尼霉素標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行預(yù)測(cè)試，經(jīng)培養(yǎng)后，o.05gml標(biāo)準(zhǔn)工作液所呈現(xiàn)的抑菌圈直徑在10 mm15 tri，而0.2 vml標(biāo)準(zhǔn)工作液所呈現(xiàn)的抑菌圈直徑在15 m20 m該菌液濃度為最佳。3.4.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制用0.025 gml、0.05 gml、0.1 gml、0.2gml、0.4gml和0.8 gml共六個(gè)濃度的維吉尼霉素標(biāo)準(zhǔn)工作液，其中用于最低濃度 (0.025gml)的三個(gè)檢定平板作為產(chǎn)生陰性結(jié)果的對(duì)照，并以o.2gml作為參考濃度。標(biāo)準(zhǔn)曲線上的每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)濃度取三個(gè)檢定用平板為一組。在每 個(gè)檢定用平板上放置六個(gè)牛津杯，其中三個(gè)加滿參考濃度溶液，另三個(gè)加滿標(biāo)準(zhǔn)濃度溶液，參考濃度與標(biāo)準(zhǔn)濃度溶液要間隔放置，五個(gè)標(biāo)準(zhǔn)濃度共用15個(gè)檢定用平板，含量最低的標(biāo)準(zhǔn)濃度的三個(gè)檢定用平板作為陰性結(jié)果的平板對(duì)照，其他12個(gè)檢定用平板繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將陶瓦蓋蓋好，4放置1h 2后h 于30土1培養(yǎng)17h 1，h 最后在361培養(yǎng)6，h 然后翻轉(zhuǎn)平板，除去牛津杯，精確測(cè)量產(chǎn)生的抑菌圈直徑(精確到0.1mm)，用所有45個(gè)參考濃度抑菌圈直徑的平均值與各平板參考濃度抑菌圈直徑平均值的差值作為每個(gè)平板的校正值，來(lái)校正其他各標(biāo)準(zhǔn)濃度的抑菌圈直徑的平均值。將校正后的值，用式(1)、式(2)算出l和h，在半對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上以抑茵圈直徑(mm)為橫坐標(biāo)(算術(shù)級(jí))，以濃度gml為縱坐標(biāo)(對(duì)數(shù)級(jí))繪制標(biāo)準(zhǔn)曲 線。 (1) (2)式中： l標(biāo)準(zhǔn)曲線上的最低濃度(0.05gml)抑菌圈直徑，單位為毫米(ram)； h標(biāo)準(zhǔn)曲線上的最高濃度(0.8 gml)抑菌圈直徑，單位為毫米(ram)； c標(biāo)準(zhǔn)曲線中全部參考濃度抑菌圈直徑的平均值，單位為毫米(mm)；a、b、d、e分別表示標(biāo)準(zhǔn)曲線中其他濃度標(biāo)準(zhǔn)工作液(0.05gml、0.1 gml、0.4gml、o.8gml)的抑菌圈直徑經(jīng)校正的平均值，單位為毫米(ram)。3.4.3.3樣液的測(cè)定每個(gè)樣液用三個(gè)檢定平板，每個(gè)平板平均置六只消毒的牛津杯，間隔注滿樣液和0.2gml維吉尼霉素標(biāo)準(zhǔn)工作液，4放置1h 2后h ，于301培養(yǎng)17h 1，h 最后在361下培養(yǎng)6 。h3.4.1 試液制備3.5結(jié)果的計(jì)算和表述培養(yǎng)后，測(cè)量抑菌圈直徑，如樣液抑菌圈直徑小于12 m，即報(bào)告為“陰性”；如大于等于12 m，分別求出三個(gè)平板中0.2 gml標(biāo)準(zhǔn)液及樣液 產(chǎn)生的抑菌圈直徑平均值，經(jīng)校正并查標(biāo)準(zhǔn)曲線，再用式(3)計(jì)算試樣中維吉尼霉素的含量。(3)x試樣中維吉尼霉素的含量，單位為毫克每千克(mgkg)；c從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出樣液所對(duì)應(yīng)的抗生素濃度，單位為微克每毫升(vgml)；m最終試液所代表的樣品濃度，單位為克每毫升(gml)。注：如測(cè)定結(jié)果呈陽(yáng)性，即抑菌圈直徑平均值大于等于12 m，需進(jìn)行確證試驗(yàn)(參見附錄b)，以證明抑菌物確系維吉尼霉素。4 測(cè)定低限、回收率4.1 測(cè)定低限本方法的測(cè)定低限為0.05 mkg。4.2 回收率雞肉中維吉尼霉素添加濃度及其回收率的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)：0.05 mkg時(shí)，回收率為80.0 ；%0.1 mkg時(shí)，回收率為81.0；0.2 mkg時(shí)，回收率為81.3。附錄a(規(guī)范性附 錄)培養(yǎng)基成分及制 備方法a1 培養(yǎng)基i蛋白胨100 g 牛肉膏50 g 氯化鈉25 g 瓊脂120 g水1 000 ml將上述各成分于水中加熱溶解，用1 mo壓滅菌15 mi，制成斜面?zhèn)溆?。a2培養(yǎng)基蛋白胨10.0 g 牛肉膏5.0 g 氯化鈉2.5 g 水1 000 mll氫氧化鈉溶液或10鹽酸調(diào)節(jié)ph，使其滅菌后ph值為6.50.1，分裝于試管或克氏瓶?jī)?nèi)，于121高式中：將上述各成分溶于水中加熱溶解，用1 mo min。a3培養(yǎng)基蛋白胨10.0 g 牛肉膏3.0 g 氯化鈉5.0 gl氫氧化鈉溶液或10鹽酸調(diào)節(jié)ph，使其滅菌后ph值為7.00.1，分裝于試管內(nèi)，121高壓滅菌15水1 000 ml瓊脂12.0 g將上述各成分子水中加熱溶解，用1 moll，氫氧化鈉溶液或10鹽酸調(diào)節(jié)ph，使其滅菌后ph值為6.70.1，分裝于三角瓶?jī)?nèi)，121高壓滅菌15 min。附錄b(資料性附 錄)確 證 試 驗(yàn) 確證試驗(yàn)采用生物自顯影法，用標(biāo)準(zhǔn)品作對(duì)照，求rf值。 微量注射器：50l。薄層板：硅膠，qyt25785sg，5 cm20 cm，使用前110活化2 h。 展開劑：三氯甲烷+甲醇+乙酸(86+12+2)。展開槽：240 cm57 cm32 cm。 點(diǎn)樣量：20l。長(zhǎng)方形培養(yǎng)皿：20 cm10 cm5 cm。 展開：在飽和槽內(nèi)進(jìn)行。檢測(cè)：取經(jīng)活化的薄層板，在其下端2 cm處劃一條基線，然后在該線上分別取20l試液和0.20 gml濃度的維吉尼霉素標(biāo)準(zhǔn)溶