地貧篩查中的血紅蛋白電泳.ppt

地貧篩查中的血紅蛋白電泳 操作技術(shù) 解放軍第三0三醫(yī)院血液實(shí)驗(yàn)室 王榮新,血紅蛋白的組成,血紅蛋白由血紅素與珠蛋白組成 血紅素：鐵原子與原卟啉復(fù)合物。 珠蛋白：包括、和 珠蛋白6種。 血紅蛋是由兩種不同的鰲合了血紅素的 珠蛋白肽鏈所形成的四聚體結(jié)構(gòu)，在人體的 不同發(fā)育時(shí)期，其主要的血紅蛋白（Hb）組 成不同。,人體發(fā)育過(guò)程中H的組成,Hb的種類,A.正常的Hb分三類 a.HbA(22) b.HbF(22) c.HA2(22) B.異常Hb有兩類 a.快速異常Hb:穩(wěn)定Hb b.慢速異常Hb:不穩(wěn)定Hb,基層常用的電泳分析方法,醋酸纖維膜電泳 瓊脂凝膠電泳,醋酸纖維膜電泳主要過(guò)程瓊脂凝膠電泳 RBC洗滌 制備溶血 點(diǎn)樣 電泳 染色與脫色 掃描法 比色法:分區(qū)剪下色帶，洗脫 分區(qū)切割色帶,融化瓊脂，干燥,透明比色,血紅蛋白電泳設(shè)備,醋酸纖維膜電泳,HbA2的常用測(cè)定方法,原理:根據(jù)不同Hb自帶電荷的不同、分子量大小的不 同、結(jié)構(gòu)和等電點(diǎn)的不同,在一定pH值的緩沖液中朝 特定方向泳動(dòng)，在一定的電壓下經(jīng)一定時(shí)間，可分 離出各自的區(qū)帶。 主要類別: 醋酸纖維素膜電泳法 瓊脂凝膠電泳法 HbA2含量測(cè)定: 洗脫法 掃描法,血紅蛋白A2測(cè)定,不連續(xù)電泳將HbA2分離后，分別剪 出膜條中的HbA和HbA2區(qū)帶，分別放入試 管中，HbA加蒸餾水20ml， HbA2加4ml ，浸泡30分鐘，不定時(shí)搖動(dòng)，使Hb完全 冼脫下來(lái)后混勻，用721分光光度計(jì)以波 長(zhǎng)413nm蒸餾水校正零點(diǎn)，讀取光密度OD 值并計(jì)算出結(jié)果。,抗堿血紅蛋白(HbF)測(cè)定,設(shè)備：721分光光度計(jì)，刻度吸管，秒表，玻璃漏斗 ，濾紙。 試劑：1/12mol/LKOH或NaOH溶液，酸性半飽和硫酸 銨溶液。 方法：取兩支試管，測(cè)定管加入溶血液0.1ml，對(duì)照 管加入0.02ml，于測(cè)定管中加入KOH1.6ml，搖勻， 1分鐘時(shí)立即加入酸性半飽和硫酸銨溶液3.4ml，倒 轉(zhuǎn)6次，放10分鐘，濾取溶液檢測(cè)，用波長(zhǎng) 540nm 蒸餾水校正零點(diǎn)，分別讀取測(cè)定管和對(duì)照管光密度 OD值，計(jì)算出結(jié)果。,HbCS的區(qū)帶多在HbA2位置的前 后，含量低，2左右，很不穩(wěn)定， 有時(shí)還可分開(kāi)成三或四小區(qū)帶，用聯(lián)苯胺染色可確定。HbE為慢速異常區(qū)帶，其位置相當(dāng)于HbA2。HbH和HbBarts為快速異常區(qū)帶。,全自動(dòng)Hb電泳儀,目前國(guó)內(nèi)使用的主要有 美國(guó)的Helena電泳儀、掃描儀和分析系統(tǒng)。 法國(guó)的Sebia電泳儀、掃描儀和分析系統(tǒng)。 國(guó)產(chǎn)的金桑特電泳儀、掃描儀和分析系統(tǒng)。 1.通過(guò)掃描定量給出HbA、 HbA2和HbF值。 2.異常區(qū)帶通過(guò)查表確定。,HbE區(qū)帶的鑒別,A.聯(lián)苯胺染色,鑒定是否為Hb B.區(qū)帶位于HbA2 區(qū)帶位置上,在陰性(-)泳動(dòng)速度最慢的一種異常Hb,難與A2區(qū)分開(kāi) C.HbA2定量在10%以上,應(yīng)考慮為HbE D.HbE純合子只有HbF和HbE,HbE高達(dá)95%以上,HbH區(qū)帶的鑒定,A.聯(lián)苯胺染色,確定是否為Hb B.在陽(yáng)極(+)泳動(dòng)速度最大的Hb區(qū)帶 C.HbH包含體陽(yáng)性(+) D.pH6.5緩沖液(酸性)唯一向陽(yáng)性(+)移動(dòng)的Hb區(qū)帶 E.HbMCVMCH F.HbBarts 區(qū)帶在HbH區(qū)帶后,泳動(dòng)速度比HbH稍慢 些,有Barts 區(qū)帶,一般都有H區(qū)帶,H含量高達(dá)30% 多,但不會(huì)超出40%,低少到1%左右。,HbA2 在血紅蛋白病中的意義,HbA2組成: 2 2 HbA2參考值:1.2%-3.5% HbA2含量的改變: HbA2水平升高,是地 貧基因攜帶者的特征性標(biāo)志, 故HbA2定 量的準(zhǔn)確與否,對(duì)于臨床一線地貧基因 攜帶者的篩查至關(guān)重要。,血紅蛋白（Hb）病,1.血紅蛋白?。夯蛲蛔儗?dǎo)致合成的珠蛋白 肽鏈結(jié)構(gòu)異常（如：鐮狀細(xì)胞血紅蛋白病 /HbS） 2.地中海貧血：基因突變導(dǎo)致一種或多種珠 蛋白肽鏈合成減少或缺如（/地貧） 3.獲得性血紅蛋白?。航佑|或誤服化學(xué)藥物,Hb病為世界上發(fā)病率最高危害最大的單基因遺 傳病，被WHO列為嚴(yán)重危害人類健康六大疾病之一。 全球約有4.83%的人口攜帶Hb病基因,每年各類 重型地貧(包括地貧復(fù)合異常Hb病類型)患兒的出生 率不低于2.4。據(jù)此推算,全球每年至少約35萬(wàn)Hb 病患兒出生; 至今為止，全球在分子水平上已鑒定出近1000 種不同的珠蛋白突變基因，其中包括700多種異常Hb 變異體和200余種地貧基因以及70多種地貧突變 ,其中中國(guó)人群中異常Hb、地貧基因和地貧突變 各占70多種、34種和11種。,臨床常見(jiàn)的異常血紅蛋白,以速度快慢排序 1.血紅蛋白E/A2 2.血紅蛋白D/S 3.血紅蛋白G 4.血紅蛋白K 5.血紅蛋白J 6.血紅蛋白H,Hb電泳操作中的經(jīng)驗(yàn)與教訓(xùn),1.RBC洗滌：離心的速度和時(shí)間要夠，生理鹽水與血 比例要5：1，血漿與冼滌生理鹽水要盡量吸干凈。 2.制備溶血：加入的溜水、溶血?jiǎng)┡c紅細(xì)胞體積要 符合要求。離心的速度和時(shí)間要夠。 3.點(diǎn)樣:血紅蛋白液適量，不能太寬。 4.電泳:醋纖膜浸泡時(shí)間要夠長(zhǎng)，平衡時(shí)間要夠。 5.染色與脫色:時(shí)間要夠。,1.正常新生兒 9.輕型地中海貧血 2.胎兒水腫綜合征 10.異常HbD雜合子 3.地中海貧血1(臍血) 11.異常HbG雜合子 4.HbCS-HbH病型 12.輕型地中海貧血復(fù)合HbE 5.重型地中海貧血復(fù)合HbE 13.正常成人 6.輕型地中海貧血 14.正常成人