膿汁和糞便標本中病原菌的檢測.ppt

斜面培養(yǎng)物4支，營養(yǎng)肉湯4支，生理鹽水2支， 鏡油瓶、拭鏡紙1套，吸水紙1本，載玻片4張。,器材準備,染色瓶6組，染色架8個。,醫(yī)學微生物學實驗 綜合性實驗一,膿汁和糞便標本中病原菌的檢測（四） 斜面培養(yǎng)物的觀察 革蘭染色法 肉湯接種法 顯微鏡油鏡的使用,斜面培養(yǎng)物的觀察,從普通平板上挑取的黃色或白色菌落接種的斜面，菌苔的顏色，還是原來菌落的顏色，黃色或白色。 從伊紅美藍平板上挑取的紫黑色或粉紅色菌落接種的斜面，菌苔已經(jīng)沒有原來菌落的顏色。菌苔灰白色、表面濕潤、光滑、不透明或半透明。 為了講解方便，以后的實驗，仍然沿用初次分離得到菌落的顏色紫黑或粉紅。 從斜面上取菌時，一般只取半個小菌落大小的菌量；接種環(huán)或接種針在培養(yǎng)基表面輕刮一下即可。,細菌染色法,單染色法：只用一種染料染色，能清楚觀察菌體大小、形態(tài)與排列，不能鑒別細菌。 復染色法（鑒別染色）：采用兩種以上的不同染料進行先后染色，可將細菌染成不同的顏色，以便鑒別細菌。 抗酸染色:用于檢查結(jié)核分枝桿菌、麻風分枝桿菌等抗酸性細菌，陽性者為紅色。 特殊染色：莢膜染色，芽胞染色，鞭毛染色，極體染色（用于白喉桿菌異染顆粒染色）。,結(jié)核分枝桿菌 抗酸染色,麻風分枝桿菌 抗酸染色,產(chǎn)氣莢膜梭菌莢膜 Hiss 染色,破傷風梭菌芽胞 芽胞染色,變形桿菌鞭毛 Leifson染色,白喉棒狀桿菌異染顆粒 Albert染色,革蘭染色法 Gram Staining 革蘭染色法是丹麥內(nèi)科醫(yī)生 Christain Gram于1884年創(chuàng)立的一種細菌染色方法，已有120多年的歷史，仍在廣泛使用，是細菌學中最為經(jīng)典的染色法。,革蘭染色法原理的三種學說,通透性學說：G+菌細胞壁結(jié)構(gòu)比較致密，肽聚糖層厚，脂質(zhì)含量少，酒精不易透入，反而可使細胞壁脫水而形成一道屏障，阻止染料向細胞外滲。G-菌細胞壁比較疏松，肽聚糖層很薄，而外膜、脂蛋白、脂多糖均含有大量脂質(zhì)，易被酒精溶解，致使細胞壁通透性增高，細胞內(nèi)的結(jié)晶紫碘復合物容易被酒精脫出。 等電學說：G+菌等電點(pH23)比G-菌(pH45)低，一般染色時染液的酸堿度在pH7.0左右，電離后陽性菌帶的負電荷比陰性菌多，因此與帶正電荷的結(jié)晶紫染料結(jié)合牢固，不易脫色。 化學學說：G+菌細胞內(nèi)含有某種特殊化學成分，一般認為是核糖核酸鎂鹽與多糖的復合物，它與染料媒染劑復合物結(jié)合，使已著色的細菌不易脫色。,革蘭染色的意義 鑒別細菌：把細菌分成G+和G-兩大類。 選擇抗菌藥物：G+球菌對青霉素敏感,G-桿菌耐藥。 了解細菌的致病機理：G+菌大多產(chǎn)生外毒素,G-菌產(chǎn)生內(nèi)毒素。 革蘭染色的步驟 涂片 干燥 固定 染色,接種環(huán)取生理鹽 水34ul，2滴。,菌苔少許（1mm小菌落的半量）與鹽水混勻，涂成1cm2。,涂畢環(huán)移至涂膜中 央側(cè)立，待環(huán)內(nèi)菌膜破裂接種環(huán)燒灼滅菌。,涂片的制備,甲黃色，紫黑。乙白色，粉紅。 丙黃色，紫黑。丁白色，粉紅。, 細菌合適, 細菌較多,涂片,干燥,固定 Fixation,手持載玻片一端，涂膜朝上，兩個涂膜快速通過火焰外層3次，時間23秒鐘。,促使蛋白質(zhì)凝固，固定在載玻片上，以免染色水洗的時候，細菌被水洗掉。,革蘭染色方法步驟,涂片 干燥 固定 結(jié)晶紫 初染1分鐘水洗 盧戈碘液媒染1分鐘水洗 95乙醇脫色約20秒鐘水洗 稀釋復紅復染1分鐘水洗 吸干,鏡檢。 取菌適量,涂片均勻,水洗輕緩,脫色適當。 影響革蘭染色的關鍵步驟是涂片和脫色。,革蘭陽性菌 革蘭陰性菌,G+鏈球菌,G-雙球菌,G+桿菌,G+短桿菌,G-弧菌,G-螺菌,液體培養(yǎng)基接種 Broth Transfer 懸浮法 Suspending Method,甲黃色, 乙白色, 丙紫黑, 丁粉紅。 標記：組號，顏色,37培養(yǎng)4小時,45108cfu/ml,接種環(huán)斜面取菌，在靠近液面的管壁上，上下研磨接種。,在管壁上，將接種環(huán)內(nèi)的菌膜拍破。退出接種環(huán)，燒灼滅菌。,生物安全警告,本次實驗操作，可產(chǎn)生幾十至幾百個微生物氣溶膠顆粒。 氣溶膠粒徑100um沉降很快,50um在0.4s內(nèi)擴散開,5um通過呼吸道直接到達肺泡。 Pike博士對實驗室感染統(tǒng)計分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不明原因的感染高達82%，大多數(shù)是氣溶膠在空氣中擴散引起的。 實驗時應坐著，在火焰周圍1020厘米內(nèi)操作，保持安靜、有序，盡量少說話、少走動，以免感染病原菌。,顯微鏡油鏡的使用P13,10物鏡看清楚標本滴加香柏油100油鏡浸泡油中（幾乎與標本接觸，工作距離0.13mm）模糊物象細調(diào)節(jié)調(diào)焦，觀察物像記錄結(jié)果關閉電源。 將聚光鏡調(diào)到最高處；孔徑光闌環(huán)上刻有的物鏡倍率（10，100）必須轉(zhuǎn)到正面，與使用的物鏡相對應。 油鏡處理：擦鏡紙拭去香柏油 擦鏡紙沾少許乙醇和乙醚（7:3）混合液擦拭擦鏡紙擦拭油鏡。 顯微鏡罩上防塵罩 橫放在實驗柜內(nèi)。 (順德校區(qū)）實驗臺兩側(cè)的電源插座，只能插入一個插頭，請選擇離你最近的電源插座。 （校本部）實驗臺中間，三個位的插座，中間那位插孔沒有電，不能使用，只能用兩側(cè)的插座。,100倍浸油物鏡使用方法,油鏡放入光路之前，一定要在標本的觀察部位上加一滴浸油。 旋轉(zhuǎn)物鏡轉(zhuǎn)盤，使油鏡進入光路，用微調(diào)旋鈕對好焦距。 如果浸油內(nèi)有氣泡，會影響觀察，可稍微旋轉(zhuǎn)物鏡轉(zhuǎn)盤，使油鏡來回通過12次浸油，排除油內(nèi)氣泡。,溫馨提示,因染色場地受限，15組先涂片染色，后接種肉湯。610組先接種肉湯，后涂片染色。 待染色和肉湯接種完畢，桌面收拾干凈，才可鏡檢，以免污染。 鏡檢過的載玻片不必擦拭，直接投入玻片缸內(nèi)消毒、滅菌。,革蘭染色法P15 甲黃色，紫黑 乙黃色，紫黑 丙白色，粉紅 丁白色，粉紅 肉湯接種法P10 甲黃色 乙白色 丙紫黑 丁粉紅 油鏡的使用P13 10物鏡看到標本滴加香柏油100油鏡浸泡油中模糊物象細調(diào)節(jié)調(diào)焦，觀察物像記錄結(jié)果關閉電源 擦鏡紙拭去香柏油 擦鏡紙沾少許乙醇和乙醚（7:3）混合液擦拭擦鏡紙擦拭油鏡。 聚光鏡孔徑光闌環(huán)上的物鏡倍率（10或100）必須轉(zhuǎn)到正面。,思考題,革蘭染色法的關鍵步驟是什么?為什么? 染色時為什么通常要用新鮮的細菌培養(yǎng)物? 如何使用油鏡?,實驗小結(jié) 用普通平板，從濃汁標本中分離得到黃色、白色兩種菌落，這兩株細菌，顯微鏡油鏡下均為G+球菌，排列不規(guī)則，呈葡萄串狀，是典型的葡萄球菌。結(jié)合菌落色素，這兩株葡萄球菌可能是金黃色葡萄球菌和白色葡萄球菌。,葡萄球菌（電鏡）,黃色、白色形態(tài)與染色（油鏡）,酸葡萄,黃色、白色菌落特征,黃色,白色,用伊紅美藍平板,從糞便標本分離、獲得紫黑色和粉紅色半透明兩種菌落。紫黑色菌落可能是能分解乳糖的非致病菌大腸埃希菌。粉紅色菌落是不能分解乳糖的致病菌。顯微鏡下，均為G-桿菌，散在排列，從形態(tài)上不能鑒別是什么細菌。,桿菌（電鏡）,紫黑、粉紅細菌的形態(tài)與染色（油鏡）,紫黑,紫黑、粉紅菌落特征,粉紅,常用器材擺放順序：電源插座試管架酒