探討Notch信號(hào)通路對(duì)糖尿病大鼠血管平滑肌細(xì)胞mRNA影響.doc

探討Notch信號(hào)通路對(duì)糖尿病大鼠血管平滑肌細(xì)胞mRNA影響 孟凡兵1范東旭2劉麗3金松2 1吉林省長(zhǎng)春市解放軍461醫(yī)院吉林省長(zhǎng)春市130000 2黑龍江省佳木斯市佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院血管外科黑龍江省佳木斯市154007 3黑龍江省人民醫(yī)院血管外科黑龍江省哈爾濱市154000 【摘要】目的：探討Notch信號(hào)通路對(duì)體外培養(yǎng)糖尿病大鼠血管平滑肌細(xì)胞的mRNA水平的影響。方法：本課題從不同梯度濃度-分泌酶抑制劑(DAPT)干預(yù)Notch信號(hào)通路后對(duì)DM大鼠VSMCs基因影響進(jìn)行論述。結(jié)果：通過實(shí)時(shí)定量PCR方法分析得出，加-分泌酶抑制劑（DAPT)的培養(yǎng)基的DM大鼠血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)溶解溫度峰值Tm進(jìn)行檢測(cè)得出：溶解曲線呈單峰，溶解溫度在86.0-84.0之間，溶解溫度變化小，表明為特異性擴(kuò)增。結(jié)論：實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示DAPT干預(yù)Notch信號(hào)通路后，對(duì)體外培養(yǎng)的DM大鼠VSMCs的mRNA有抑制趨勢(shì)，復(fù)制率下降，使其溶解溫度峰值前移，溶解曲線呈單峰，將會(huì)導(dǎo)致進(jìn)一步細(xì)胞凋亡。 關(guān)鍵詞pcr；糖尿病大鼠；dapt；血管平滑肌細(xì)胞；mrna 1材料與方法 本課題前期的糖尿病大鼠模型建立、糖尿病大鼠主動(dòng)脈血管病變檢測(cè)、糖尿病大鼠VSMCs體外培養(yǎng)及鑒定以及不同梯度濃度-分泌酶抑制劑(DAPT)干預(yù)Notch信號(hào)通路后對(duì)DM大鼠VSMCs活性及毒性、凋亡、細(xì)胞周期的影響均已完成，且DM大鼠VSMCs已完成凍存。僅從不同梯度濃度-分泌酶抑制劑(DAPT)干預(yù)Notch信號(hào)通路后對(duì)DM大鼠VSMCs基因影響進(jìn)行論述。 1.1實(shí)驗(yàn)對(duì)象 取已完成的糖尿病大鼠血管平滑肌細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞復(fù)蘇與傳代。 1.1.1VSMCsmRNA的抽提 取凍存已裂解的細(xì)胞，在常溫下放置到完全溶解。溶解RNA時(shí)，先加入無RNA酶的水40l用槍反復(fù)吹打幾次，使其完全溶解，獲得的RNA溶液保存于-80，作為實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增實(shí)的模版。 1.1.2RNA質(zhì)量檢測(cè)，紫外吸收法測(cè)定取少量RNA溶液用TE稀釋（1:100）后，讀取260nm和280nm兩處的吸收值，測(cè)定RNA溶液的濃度和純度。進(jìn)行濃度測(cè)定，在進(jìn)行純度檢測(cè)，mRNA純度為mRNA溶液的A260/A280的比值，比值范圍1.9到2.1. 2反應(yīng)條件 如表1。 3引物設(shè)計(jì)軟件 PrimerPremier5.0，并遵循以下原則：引物與模板的序列緊密互補(bǔ)。 根據(jù)文獻(xiàn)設(shè)計(jì)出相應(yīng)的引物。 目標(biāo)基因： 上游引物為5:TTATTAGAGGGTGGGGCGGATCGCTAT3下游引物為5：GACGACCCCGAACCGCGACCGTAACAG3擴(kuò)增條目的條帶大小為155bp。對(duì)照基因： 上游引物5:TTATTAGAGGGTGGGGTGGATTGTTAT3下游引物5：CAAGACCCCGAACCGCGACCGATACCA3擴(kuò)增條目的條帶大小為156bp。 4結(jié)果 通過實(shí)時(shí)定量PCR方法分析得出，加-分泌酶抑制劑（DAPT)的培養(yǎng)基的DM大鼠血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)溶解溫度峰值Tm進(jìn)行檢測(cè)看見：溶解溫度在86.084.0之間，溶解溫度單一，溶解曲線呈單峰，標(biāo)明為特異性擴(kuò)增。而對(duì)照組（正常培養(yǎng)基）未見特異性峰值。從PCR溶解曲線我們看見DAPT干預(yù)Notch信號(hào)通路后對(duì)體外培養(yǎng)的DM大鼠VSMCs的mRNA有抑制趨勢(shì)，使其溶解溫度峰值前移，溶解曲線呈單峰，復(fù)制率下降，將會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。 5結(jié)論 本課題通過實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)分析探討Notch信號(hào)通路在糖尿病大鼠血管再生及成熟中的作用機(jī)制，分析探討Notch信號(hào)通路對(duì)體外培養(yǎng)糖尿病大鼠血管平滑肌細(xì)胞的mRNA水平有何影響，為進(jìn)一步研究糖尿病患者血管再生提供依據(jù)，有可能成為獲得更多有功能的血管以促進(jìn)血管新生，為臨床治療糖尿病足潰瘍、缺血性疾病、改善預(yù)后提供新思路和新途徑，并為以后系統(tǒng)科學(xué)地研究血管再生提供方向，為缺血性疾病的治療提供靶向藥物，希望在不久之后會(huì)應(yīng)用到臨床治療中，造福廣大糖尿病足潰瘍、缺血性疾病患者，實(shí)現(xiàn)從實(shí)驗(yàn)室到臨床的完整對(duì)接，進(jìn)一步提升糖尿病足潰瘍、缺血性疾病治療的基礎(chǔ)研究水平。 （通訊作者：金松） 參考文獻(xiàn) 1金松,劉延?xùn)|.糖尿病大鼠血管平滑肌細(xì)胞體外培養(yǎng)及Notch信號(hào)通路對(duì)其營(yíng)養(yǎng)的研究J.佳木斯大學(xué)學(xué)報(bào),xx3-5. 2吳護(hù)群,陳戈,盧文.糖尿病足的基礎(chǔ)知識(shí)教育及防治J.實(shí)用心腦費(fèi)血管病雜志,xx,18:57. 3SteeperR.AcriticalreviewoftheaetiologyofdiabetieuropathiculcerJ.JWoundCAre.xx,14(3):101-103. 4林楚佳,林少達(dá)，黃少薇。糖尿病足下肢血管病變分析J.中國(guó)臨床研究，xx,24(4):274-276. 5楊婷,金松,劉延?xùn)|.糖尿病大鼠血管平滑肌細(xì)胞原代培養(yǎng)方法的改良J.中國(guó)普外基礎(chǔ)與臨床雜志，xx,20(2):173-176. 6黃留玉PCR最新技術(shù)原理,方法及應(yīng)用M北京：化學(xué)工業(yè)出版社,xx;131-157. 7羅勇軍，劉欣，實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)品的制備及應(yīng)用J.重慶醫(yī)學(xué),xx,34（30:414-415. 8管任珍.實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)胃癌DNA甲基化J.天津醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),xx-03-023-5. 9梁潔，韓驊.Notch信號(hào)通路與血管發(fā)育J.細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志,xx-12-18，26-27. 10MorrowD,GuhaS,SweeneyC,Notchandvascularsmoothmusclecellphenotype.CircRes,xx.103(12)1370-82. 11StockhausenM，SjolundJaxelso