ELISA基礎(chǔ)知識(shí)及常見(jiàn)問(wèn)題的處理.ppt

ELISA基礎(chǔ)知識(shí)及常見(jiàn)問(wèn)題處理,北京萬(wàn)泰生物藥業(yè)股份有限公司技術(shù)工程師崔偉,ELISA（酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)）,ELISA（酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)）是一種酶免疫測(cè)定。在臨床檢驗(yàn)中主要通過(guò)抗原抗體于固相或液相載體中反應(yīng)檢測(cè)體液中的抗體或抗原性物質(zhì)。通過(guò)辣根過(guò)氧化物酶（HRP)與底物液TBM的反應(yīng)指示出所檢測(cè)物質(zhì)的有無(wú)。1抗原：抗原是能在機(jī)體中引起特異性免疫應(yīng)答的物質(zhì)。2抗體：抗體是能與抗原特異性結(jié)合的免疫球蛋白。Ig分五類(lèi)，即IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。與免疫測(cè)定有關(guān)的Ig主要為IgG和IgM。機(jī)體被微生物感染后，先產(chǎn)生IgM抗體，然后產(chǎn)生IgG抗體。經(jīng)過(guò)一段時(shí)間，IgM抗體量逐漸減少而消失，而IgG抗體可長(zhǎng)期存在，在疾病痊愈后可持續(xù)數(shù)年之久。,ELISA檢測(cè)方法,夾心法:雙抗原（抗體）夾心法是檢測(cè)抗原最常用的方法，其檢測(cè)方法：雙抗原夾心：固相(包被)抗原Ag+樣品(抗體Ab)+酶標(biāo)抗原Ag*Ag-Ab-Ag*+底物(TMB)顯色雙抗體夾心：固相(包被)抗體Ab+樣品(抗原Ag)+酶標(biāo)抗體Ab*Ab-Ag-Ab*+底物(TMB)顯色,間接法間接法是檢測(cè)抗體常用的方法。其原理為利用酶標(biāo)記的抗抗體（抗人免疫球蛋白抗體）以檢測(cè)與固相抗原結(jié)合的受檢抗體，故稱(chēng)為間接法。其檢測(cè)方法：固相(包被)抗原Ag+樣品(抗體Ab)+酶標(biāo)二抗Ab*Ag-Ab-抗Ab*+底物(TMB)顯色,競(jìng)爭(zhēng)法其原理為標(biāo)本中的抗體和一定量的酶標(biāo)抗體競(jìng)爭(zhēng)與固相抗原結(jié)合。標(biāo)本中抗體量越多，結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗體愈少，因此陽(yáng)性反應(yīng)呈色淺于陰性反應(yīng)：固相(包被)抗原Ag+樣品(抗體Ab)+酶標(biāo)抗體Ab*Ag-Ab+底物(TMB)不顯色(+)固相(包被)抗原Ag+樣品(無(wú)抗體Ab)+酶標(biāo)抗體Ab*Ag-Ab*+底物(TMB)顯色(-),診斷試劑所用的質(zhì)量指標(biāo)及相互關(guān)系：,靈敏度：能檢測(cè)到的分析物的最小量，表示檢測(cè)下限的能力。相對(duì)靈敏度=真陽(yáng)性/（真陽(yáng)性+假陰性）100%測(cè)定方法及表示方法：靈敏度標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控血清、陽(yáng)性標(biāo)本稀釋終點(diǎn)、血清盤(pán)（pannel）及臨床標(biāo)本陽(yáng)性率。靈敏度標(biāo)準(zhǔn)品可以從衛(wèi)生部臨檢中心購(gòu)買(mǎi)，質(zhì)控血清可以從衛(wèi)生部臨檢中心購(gòu)買(mǎi)，也可以自己配制。因?yàn)橘|(zhì)控血清不一定是原倍血清，或由于片段、亞型、位點(diǎn)等原因，評(píng)定試劑盒的靈敏度都帶有一定的片面性。陽(yáng)性標(biāo)本稀釋終點(diǎn)的方法常用于不同試劑盒的比較，但也有上述的片面性。陽(yáng)性pannel有些可以從衛(wèi)生部臨檢中心購(gòu)買(mǎi)，如HBsAg陽(yáng)性pannel，也可以自己配制。臨床標(biāo)本陽(yáng)性率，是一種粗略的估計(jì)，但對(duì)臨床很實(shí)用。,特異性：真陰性標(biāo)本的檢出能力。相對(duì)特異性=真陰性/（真陰性+假陽(yáng)性）100%測(cè)定及表示方法：質(zhì)控血清、血清盤(pán)、臨床標(biāo)本陰性率。質(zhì)控血清、血清盤(pán)可以從衛(wèi)生部臨檢中心購(gòu)買(mǎi)，也可以自己配制。自己配制時(shí)注意陰性標(biāo)本的在血清盤(pán)中的比例以及代表性。臨床標(biāo)本陰性百分率是臨床使用中對(duì)試劑盒特異性的粗略的判斷。如果數(shù)批產(chǎn)品都通過(guò)了特異性參比測(cè)定，是否產(chǎn)品的特異性就一樣了呢？不一定。因?yàn)樘禺愋詤⒈绕返臄?shù)量不可能很大（樣本與整體的差異），引起非特異性的因素很多，目前尚不完全清楚。質(zhì)控血清盤(pán)也存在同樣的問(wèn)題。,有關(guān)名詞簡(jiǎn)介,質(zhì)控血清：質(zhì)控血清是為了對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行控制而配制的血清。質(zhì)控血清可以是定值也可以是不定值，可以購(gòu)置也可以自配。自己配制時(shí)要注意選用無(wú)脂血的血清或血漿，不能用試劑盒內(nèi)的陽(yáng)性對(duì)照。若用稀釋的血清作為質(zhì)控血清，應(yīng)考慮稀釋基質(zhì)成分對(duì)結(jié)果的影響。因質(zhì)控血清與臨床標(biāo)本不一致，應(yīng)該注意對(duì)結(jié)果的分析，應(yīng)該注意質(zhì)控血清只能用于質(zhì)控活動(dòng)，不可用于標(biāo)定儀器或評(píng)價(jià)方法。用于室內(nèi)質(zhì)控的質(zhì)控血清一般選取CUTOFF值2-3倍的質(zhì)控品。,室內(nèi)質(zhì)控：實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部使用控制實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠性的一種質(zhì)量控制。室間質(zhì)評(píng)：用于考核各個(gè)實(shí)驗(yàn)室結(jié)果可靠性的一種考核，可分為國(guó)家級(jí)和地方級(jí)的室間質(zhì)評(píng)。可以理解為“各個(gè)實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量評(píng)比”。,臨界值（CUTOFF值）：臨界值是判斷陰陽(yáng)性或有臨床意義水平的數(shù)值，臨界值的確定是測(cè)定大量數(shù)據(jù)后應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法確定的。許多試劑都會(huì)給出臨界值或臨界值的計(jì)算方法。本底：就是底色。如ELISAHBsAg，陽(yáng)性顯色，陰性不顯色，本底就是整個(gè)陰性顯色的情況。ELISA抗HBcAb，陽(yáng)性不顯色，陰性顯色，本底就是整個(gè)陽(yáng)性顯色的情況。,陰性對(duì)照及陽(yáng)性對(duì)照：陰、陽(yáng)性對(duì)照若有正確的結(jié)果，對(duì)試劑盒操作的結(jié)果可以有粗略的判斷?？瞻讓?duì)照：對(duì)ELISA試劑來(lái)說(shuō)，空白對(duì)照實(shí)際上是不加標(biāo)本不加酶做對(duì)照?？瞻讓?duì)照主要測(cè)系統(tǒng)的吸光率。空白對(duì)照在單波長(zhǎng)測(cè)量時(shí)顯得尤其重要。,ELISA試劑常見(jiàn)問(wèn)題及解答,ELISA試劑的原理基礎(chǔ)為抗原抗體免疫反應(yīng)，在生產(chǎn)、儲(chǔ)存、運(yùn)輸、使用等各環(huán)節(jié)中，對(duì)其質(zhì)量特性產(chǎn)生影響的因素眾多。此外，其顯色系統(tǒng)中的過(guò)氧化物酶在生物樣品中普遍存在，故在客戶(hù)使用過(guò)程中經(jīng)常會(huì)產(chǎn)生某種非期望的結(jié)