離子通道失活與胰島素分泌的關系文獻綜述

離子通道失活與胰島素分泌的關系文獻綜述糖尿病是一組以高血糖為特征的代謝性疾病。高血糖則是由于胰島素分泌缺陷或其生物作用受損，或兩者兼有引起。糖尿病時長期存在的高血糖，導致各種組織，特別是眼、腎、心臟、血管、神經(jīng)的慢性損害、功能障礙。糖尿病目前己經(jīng)成為繼心腦血管疾病、腫瘤之后的第三大嚴重危害人類健康的慢性非傳染性疾病。口服降糖藥是目前治療2型糖尿病的主要方法，但是無論何種藥物都無法避免細胞凋亡。糖尿病分為兩種類型：1型糖尿病和2型糖尿病。1型糖尿病發(fā)病年齡輕，大多30歲，起病突然，多飲多尿多食消瘦癥狀明顯，血糖水平高，不少患者以酮癥酸中毒為首發(fā)癥狀，血清胰島素和C肽水平低下，ICA、IAA或GAD抗體可呈陽性。單用口服藥無效，需用胰島素治療。2型糖尿病常見于中老年人，肥胖者發(fā)病率高，?？砂橛懈哐獕?，血脂異常、動脈硬化等疾病。起病隱襲，早期無任何癥狀，或僅有輕度乏力、口渴，血糖增高不明顯者需做糖耐量試驗才能確診。血清胰島素水平早期正?；蛟龈?，晚期低下。本實驗主要針對2型糖尿病進行研究。1、糖尿病研究的國內(nèi)外進展1.1糖尿病國內(nèi)外研究現(xiàn)狀糖尿病的流行引發(fā)了全世界的關注，各國都投入大量人力、物力對其進行研究。從全球來看，自從 2008 年以來，相繼發(fā)表了多項大型循證醫(yī)學研究報告，如強化血糖控制與糖尿病血管轉(zhuǎn)歸(ADVANCE)、危重患者的血糖管理(NICE-SUGAR)等，這表明糖尿病研究不再單純的只在降糖或控制血糖方面，人們開始關注糖尿病的并發(fā)癥及預防。有關糖尿病的治療方法也不單純的致力于藥物研究，逐漸開始將生活方式和藥物治G） 者向糖尿病轉(zhuǎn)變的幾率大幅度降低。在國內(nèi)，從發(fā)文量來看，糖尿病藥物治療文獻逐年上升，研究關注度不斷增強，其中研究較多的中藥有葛根素、黃芪、銀杏葉提取物、小檗堿等，主要側(cè)重分析其作用機制，西藥主要有胰島素、磺脲類藥物、雙胍類藥物等，更側(cè)重研究其效果以及副作用；研究團體以陸付耳、徐麗君團隊為主，研究機構多集中在高校，以黑龍江中醫(yī)藥大學為首，制藥企業(yè)及科研院所較少。而且，近年來長征醫(yī)院對2型糖尿病周圍神經(jīng)病變機制的研究及治療方案的優(yōu)化在國內(nèi)處于領先水平，廣州軍區(qū)在糖尿病血管并發(fā)癥實驗、分子遺傳學與臨床方面有多項新的進展，并且中藥治療糖尿病的臨床和基礎研究也取得了可喜的成果。如2012年，雷定超、張?zhí)m蘭等人總結概括了近年來中藥治療糖尿病的研究進展，表明中藥治療糖尿病具有非常明顯的優(yōu)點，如副作用小、更好地防治并發(fā)癥。2015年，郭朝陽、郭金珠通過分析對患者采用硫辛酸和甲鈷胺聯(lián)合治療的效果，表明相對于單一用藥，聯(lián)合用藥的治療效果更佳。2015年，胡文峰介紹了糖尿病的降糖方案和高血壓的治療原則，并為其進一步研究提供了對應的方案。近年來國內(nèi)研究表明，糖尿病不止作為一種單一疾病來治療，它更多的傾向于和其他并發(fā)癥一起研究；在藥物治療方面也不再單一，而是更多的傾向于聯(lián)合用藥；中藥以其副作用小的優(yōu)勢逐漸成為治療糖尿病的另一種選擇。過去的幾十年國內(nèi)外研究多圍繞高血糖引起的生化指標的改變，如非酶類糖化過程增強；氧化還原應激反應；醛糖還原酶激活；二酰基甘油(DAG)一蛋白激酶C(PKC)通路活性增加并取得迅速進展。大量研究表明，糖尿病并發(fā)癥的產(chǎn)生機制十分復雜，分子病理生理機制至今尚未完全闡明，但血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)是控制血管張力的最終執(zhí)行者，也是T2DM血管并發(fā)癥生化機制、氧化應激、炎癥機制的最終作用靶點，其本身的功能變化直接影響血管張力。鈣離子通道和鉀離子通道是血管平滑肌細胞上最重要的離子通道，二者共同維持著血管張力的平衡，又是各種生化因子的作用靶點，因而探明其病理生理變化有重大意義，可為T2DM血管并發(fā)癥的治療提供新的治療靶點。1鈣離子通道自1883年Ringer發(fā)現(xiàn)蛙心在不含Ca“的液體中停止搏動至今，Ca“在細胞活動中的作用引了人們廣泛的注意。Ca“是細胞內(nèi)重要的信使，廣泛參與各種生命活動，如骨骼肌、平滑肌細胞的收縮，腺體的分泌，血小板的釋放等。研究表明：靜息狀態(tài)下，細胞內(nèi)游離Ca“濃度約為細胞外的120 000。胞內(nèi)游離ca“濃度升高有兩大來源：細胞內(nèi)鈣池釋放Ca“和胞外ca“內(nèi)流。前者使胞內(nèi)游離Ca“濃度迅速增大到峰值，其調(diào)節(jié)機制比較清楚：質(zhì)膜鈣泵(PMCA)和肌漿網(wǎng)鈣泵(SERCA)對細胞內(nèi)ca“的調(diào)節(jié)起著重要作用。有研究結果表明。1。由鏈脲佐菌素(STZ)誘導的糖尿病大鼠的主動脈平滑肌細胞PMCA活性在早期時較正常組輕度增加，可能是對早期細胞內(nèi)游離Ca“升高引起的代償性反應，但隨著病程的延長其活性又逐漸減低，提示PMCA受多種損害因素的影響；SERCA活性隨著糖尿病病程的延長而逐漸降低，提示SERCA活性在糖尿病早期就受到損傷且呈逐漸加重趨勢。PMCA與SERCA的活性在糖尿病病程中后期同時下降導致主動脈平滑肌胞質(zhì)內(nèi)Ca2+緩沖能力降低，引起細胞內(nèi)ca“超載，提示糖尿病時血管平滑肌細胞收縮和增殖的異常改變與Ca2+異常運動有關。另外Ostergaard等。2報道在眾多能夠引起鈣泵活性降低的因素中，主要因素為高血糖。目前認為血管平滑肌細胞內(nèi)的高Ca“引起或加劇糖尿病大血管病變的機制主要通過。：胞內(nèi)鈣超載可導致血管平滑肌細胞的壞死和分裂，且胞內(nèi)鈣沉積能引起早期的血管壁鈣化；血管平滑肌細胞在胞內(nèi)高ca2+情況下其DNA合成明顯加速；血管平滑肌細胞內(nèi)高ca“導致其對縮血管物質(zhì)敏感性增高，血管持續(xù)收縮，引起外周阻力增高；血管平滑肌細胞長期處于收縮狀態(tài)亦加速了其增生。總之，在糖尿病發(fā)病過程中。特別是疾病發(fā)展的中后期，鈣泵(SERCA和PMCA)活性的改變破壞了血管平滑肌細胞內(nèi)Ca“平衡的調(diào)控機制，引起Ca“代謝紊亂，最終導致血管結構和功能的改變。2鉀離子通道鉀離子通道作為血管平滑肌細胞膜上主要的電位調(diào)控者，對血管張力的變化有著非常重要的影響。血管平滑肌細胞膜上的鉀離子通道開放時，K+外流增加引起細胞膜電位的超極化，使得電壓依賴性鈣離子通道失活關閉，減少了Ca“的內(nèi)流，從而導致血管舒張。相反鉀離子通道關閉，膜電位去極化，電壓依賴性鈣離子通道開放，細胞內(nèi)Ca“濃度升高，導致血管收縮。血管平滑肌上至少有4種鉀離子通道：鈣依賴性鉀離子通道(K如通道)、ATP敏感性鉀離子通道(K通道)、電壓依賴性鉀離子通道(K、通道)、內(nèi)向整流鉀離子通道(K。通道)。21鈣依賴性鉀離子通道K。通道按照其電導大小又分為5：小電導鈣激活的鉀離子SK。通道，中電導鈣激活的鉀離子IKh通道，大電導鈣激活的鉀離子BK。通道。其中BK。通道是血管平滑肌上數(shù)目最多的一種鈣依賴性鉀離子通道，受電壓及Ca2+濃度雙重調(diào)節(jié)，是目前研究最廣泛的一類鉀離子通道。BK。通道在調(diào)節(jié)細胞內(nèi)新陳代謝和ca“的平衡中發(fā)揮了重要作用?，F(xiàn)認為BK。通道對人類完整血管靜息狀態(tài)下血管張力的維持起重要作用”。糖尿病引起的血管BK。通道受損的內(nèi)在變化機制尚未有詳細研究，多數(shù)研究認為糖尿病致氧自由基產(chǎn)生增加，抑制了BK。通道活性，從而引起血管收縮。Lu等7通過單通道膜片鉗技術對ZDF大鼠冠狀動脈平滑肌細胞上的BK。通道研究后發(fā)現(xiàn)，BK。通道有降低對Ca“敏感性的作用，通過降低最大開放概率來改變Ca“依賴性門控，并縮短平均開放時間。由于這些BK。通道門控的異常，對通道的激活產(chǎn)生了一個能量障礙，這也可能是引起T2DM的血管功能障礙的原因。另有研究表明糖尿病能夠降低BK。通道的活性，從而引起糖尿病早期視網(wǎng)膜血管灌注不足，并對糖尿病高血壓發(fā)病產(chǎn)生較廣泛的影響“。有關糖尿病動物血管平滑肌模型中鉀離子通道的變化，許多報道是相互矛盾的。一些研究人員發(fā)現(xiàn)KATP、K?；騅、通道的功能是直接或者間接地減少的，而又有些卻認為正好相反?！?。Ye等”。對這種矛盾解釋為可能是在糖尿病的不同階段時的兩種表現(xiàn)。在STZ誘導的糖尿病早期，大鼠胸主動脈平滑肌細胞上BK。通道開放增強，導致BK鉑通道平均關閉時間減少，這種現(xiàn)象僅僅出現(xiàn)在糖尿病的早期，此階段憑借體內(nèi)代償機制可以對抗高血糖的損傷，但是到了糖尿病后期，代償機制的失調(diào)導致鉀離子通道功能的損害，成為腦血管病變的基礎，BK如通道功能的增強能夠減輕高血糖造成的損害。隨著對BK如通道的幾十年的不斷研究，各個方面的關于BK。通道與糖尿病血管并發(fā)癥的報道不斷出現(xiàn)，Lu等“。報道高血管糖是導致糖尿病血管病變的一個重要的因素，高血管糖能夠通過半胱氨酸9ll(C911)的H：O：氧化物來抑制BK“通道的功能，提示糖尿病能夠改變抗氧化劑酶的結構外形，增強活性氧(ROS)的產(chǎn)生和損害BK“通道的功能；過氧化氫酶基因轉(zhuǎn)移能改善這些損傷，在治療糖尿病血管并發(fā)癥上有很大的潛力。同時又有觀點認為在人類冠狀動脈血管上，超氧化物(superoxide)對BK。通道的抑制作用更為明顯12。目前研究發(fā)現(xiàn)，在糖尿病血管上還有一個降低鉀離子通道拮抗藥IBTX敏感性的成分存在，一種可能性的解釋是：糖尿病過程中過氧亞硝基陰離子(peroxynitrite)的形成?！薄?，過氧亞硝基陰離子能直接抑制冠狀動脈和大腦小血管上BK0。通道的活性。現(xiàn)在Liu Y等”。已經(jīng)證實高血糖狀態(tài)下超氧化物明顯增加，同時也有有限量的過氧亞硝基陰離子的產(chǎn)生，它們共同降低BK通道的活性。近年來隨著對BK如通道研究的不斷深入，相關的藥物研究也取得一定的進展。楊艷艷等”。研究發(fā)現(xiàn)073807mmolL“范圍內(nèi)川I芎嗪對豬冠狀動脈平滑肌BK。通道有明顯的激活作用，為闡明其擴張冠狀動脈血管的機制提供了實驗依據(jù)。韓冬云等7。利用膜片鉗技術在分子水平上證實N甲基小檗胺(N-methyl berbamine，NMB)可以增加大鼠腸系膜阻力血管平滑肌細胞鈣激活鉀電流，這可能是其降壓機制之一。22ATP敏感性鉀離子通道ATP敏感性鉀離子通道(Km通道)是電壓非依賴性的、配體門控通道，是13本學者Noma在1983年利用膜片鉗技術在豚鼠心室肌細胞上發(fā)現(xiàn)的一類鉀離子通道，它們主要受細胞內(nèi)ATP濃度的調(diào)節(jié)，因此命名為ATP敏感性鉀離子通道。此后發(fā)現(xiàn)它是一類分布較廣泛的內(nèi)向整流鉀離子通道，許多細胞類型上都存在該通道，例如胰腺、骨骼肌、平滑肌、神經(jīng)、內(nèi)皮細胞等多種組織中均存在。在生理狀態(tài)及某些病理條件下K卅通道參與血管張力的調(diào)節(jié)。生理條件下的血管平滑肌細胞K卅鉀離子通道活動很少，不足10，其原因主要是平滑肌細胞Km通道密度低，加上胞內(nèi)高濃度ATP的抑制作用，在完整血管平滑肌細胞上通道開放極少，一旦細胞內(nèi)ATP濃度明顯降低，導致該通道的開放，使細胞趨于復極化或超極化，動作電位時程縮短，抑制鈉、鈣離子通道的激活，起到保護作用。研究表明，Km通道參與冠狀動脈血流，特別是缺氧和缺血時冠狀動脈血流的調(diào)節(jié)。缺氧激活Km通道機制可能是由于血管周圍缺氧組織釋放腺苷或者血管平滑肌自身缺氧所致。同時生理條件下通道的開放率很低，為在缺血、缺氧、酸中毒等病理條件下介入治療開放Km通道提供了理論基礎，對調(diào)節(jié)血管張力、局部血流量具有非常重要的作用。有研究證實Km通道開放增加，對高代謝狀態(tài)下增加組織血供有一定作用，對T2DM合并冠心病的發(fā)病有著重要的意義。1984年Nair等報道糖尿病控制不良者基礎代謝率明顯增高，耗氧量增加20一25，經(jīng)胰島素治療后可以糾正，提示胰島素缺乏或不足對組織耗氧增加有著重要影響。23電壓依賴性鉀離子通道電壓依賴性鉀離子通道是鉀離子通道超家族中重要的成員，近來有大量的K、通道亞單位被相繼發(fā)現(xiàn)，由于其亞單位太龐大，而且廣泛分布在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，所以目前對K、通道家族的研究多集中于此。不過K、通道還分布在血管平滑肌細胞上，調(diào)節(jié)血管的收縮和舒張。血管平滑肌中可檢測到4種K、通道蛋白(K、12、K、13、K、15和K。21)，其中K、15通道的表達最豐富，是形成大鼠血管平滑肌細胞自身K、通道的主要亞型基因，K、15通道受各種效應物質(zhì)(如尼古丁和內(nèi)皮素-1)的調(diào)節(jié)”。周萍等。”。通過試驗得出，長期內(nèi)源性睪酮缺失引起K、通道功能衰減，生理劑量的睪酮替代治療對受損的K。通道有修復作用。另有研究表明糖尿病血管平滑肌收縮和舒張功能減弱，與血管平滑肌細胞膜K、通道功能失調(diào)有關。糖尿病時血管平滑肌K、通道活性降低，其機制可能是高血糖引起冠狀小動脈平滑肌上的K。12和K。15的蛋白及mRNA含量均下調(diào)，抑制了K。通道的活性；也有相關研究如Li等12。通過試驗證實了上述結論。由于人原代胰島細胞獲取困難，且不能連續(xù)傳代，所以多選用體外培養(yǎng)胰島B細胞的細胞株作為替代，常用的有大鼠胰島13細胞瘤細胞株(RINmSF)及倉鼠胰島B細胞(HITT15)。其在胰島素基因的研究中廣泛應用，缺點是胰島素分泌遠低于正常胰島細胞，且葡萄糖刺激的胰島素分泌(GSIS)也與13細胞有所不同，故不能完全替代正常13細胞。小鼠胰島素瘤細胞(MIN6細胞系)是從小鼠胰島6細胞瘤或胰島細胞瘤中分離得到的永久細胞系，它保留了胰島細胞的GSIS，對腦型葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白(GLUT)不敏感，而特異地對肝型GLUT敏感，可以反映胰島B細胞的功能變化，是研究胰島細胞功能的理想模型。MIN細胞系的制備和功能MIN6細胞系是從胰島素啟動子控制下的表達人猿病毒40大T抗原的轉(zhuǎn)基因非肥胖糖尿病小鼠胰島瘤中建立的。將這些小鼠喂養(yǎng)至13周處死，切除腫瘤后獲得腫瘤細胞，經(jīng)過單獨洗滌，加入DMEM培養(yǎng)基后在培養(yǎng)箱內(nèi)傳代培養(yǎng)。2周后，得到緊密排列、密集生長的細胞克隆，用胰蛋白酶常規(guī)消化后進行細胞傳代。最終得到兩個細胞系：從IT6模型小鼠的腫瘤細胞中得到單一細胞克隆即是MIN6細胞系，而從117模型中獲得的是MIN7細胞系。MIN6細胞系經(jīng)孵育12 h后，取上清液，離心去除細胞碎片，儲存于一200C。MIN6細胞系的GSIS與胰島細胞基本相似，是一種被廣泛使用的13細胞系。Nakashima等舊1發(fā)現(xiàn)，MIN6細胞還可分泌胰高血糖素、生長抑素和ghrelin，提示其是體外代替胰島組織培養(yǎng)的較好的細胞系。2M衛(wèi)N6細胞系的細胞學特性MIN6和MIN7細胞系都是由類人猿病毒40大T抗原啟動子所激發(fā)而得到的，兩者都呈均勻形態(tài)、集落生長，有一定的神經(jīng)內(nèi)分泌功能，包含較高水平的胰島素mRNA和類人猿病毒40T抗原mRNA。免疫組化分析也提示它們是由同一種胰島B細胞分化演變而來。但兩者的GSIS不同，MIN6細胞系分泌胰島素的量隨血糖升高而顯著升高，這與體外培養(yǎng)的正常胰島細胞基本相似。它們都能產(chǎn)生較高水平的肝型GLUT mRNA，MIN6細胞系只能產(chǎn)生少量的腦型GLUT mRNA。故MIN6細胞系在功能上更接近于胰島B細胞。MIN6細胞系保留了B細胞特性，可以在血糖和其他促分泌因素刺激下分泌胰島素。但是MIN6細胞在多次傳代后會發(fā)生基因改變，從而失去分泌胰島素的能力，這些基因的改變包括下調(diào)某些基因如磷脂酶D和膽囊收縮素。多次傳代的細胞對某些蛋白也會出現(xiàn)低表達，包括參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激和活性氧簇生成的抗氧化酶。GLUT是葡萄糖通過細胞膜的重要受體，其中GLUT9和GLUT2也參與了GSISl3 J。既往研究發(fā)現(xiàn)，傳代次數(shù)不多的MIN6細胞系GLUT2的表達幾乎沒有差異，與多次傳代的MIN6細胞系相比較，在基因和蛋白水平的表達均有改變，但是不影響代謝結果【4 J。近年來Yamato等51發(fā)現(xiàn)，MIN6亞群C4更好的保留了GSIS能力，更適用于體外胰島B細胞系研究。MIN6細胞系不僅可以分泌胰高血糖素樣肽一1，其信號可以通過一種自分泌方式被放大，從而維持其胰島素分泌的功能舊J。這是MIN6細胞系生存和分泌胰島素的基礎。3MIN6細胞系的臨床應用31測定胰腺分泌的激素胰腺組織有5種內(nèi)分泌細胞：分泌胰高血糖素的儀細胞，分泌胰島素的B細胞，分泌生長抑素的8細胞，分泌胰多肽的y細胞，分泌ghrelin的細胞。它們共同維持血糖的穩(wěn)定。MIN6細胞系可分泌以上5種激素心J。Nakashima等舊1發(fā)現(xiàn)MIN6細胞系可以表達Pdxl，NeuroD，Nkx61，Nkx22，Pax6，Ngn3，Pax4，Bran4和CckBr等基因，而這些基因同樣也在胰島中表達。32在氨基酸研究中的應用某些氨基酸，如L谷氨酸和L一精氨酸，是胰島B細胞的適宜刺激信號。研究發(fā)現(xiàn)在接受L一谷氨酸和L一精氨酸刺激后，MIN6細胞內(nèi)三磷酸肌醇和Ca“濃度均顯著上升，這有助于了解TaslR家族的表達情況L7 J。所以，可以利用MIN6細胞系表達氨基酸受體作相關研究。AMP活化蛋白激酶(AMPK)是反映細胞狀態(tài)的傳感器，其活化影響了胰島B細胞的GSIS。哺乳動物的AMPK是絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶，其功能是滅活葡萄糖。MIN6細胞系中，蛋白激酶A使AMPK0【1Serl73、Ser485和Ser497位點磷酸化，通過上游激酶活化而阻TThrl72磷酸化舊J。蛋白激酶B則使AMPKotS485位點活化，并抑制肝激酶B1(LKBl)的Thrl72磷酸化，從而減少AMPK的活化。但使用INS1 B細胞系在研究過程中得到不同結果，蛋白激酶B引起AMPKctSer485位點發(fā)生磷酸化，阻止了LKBlThrl72的磷酸化，由于AMPK-LKBl間的級聯(lián)反應而降低了AMPK的活性。出現(xiàn)這種矛盾的結果可能與使用不同的細胞系有關一J。王威等oJ發(fā)現(xiàn)，MIN6細胞系對血糖的調(diào)節(jié)能力優(yōu)于INS-1細胞系。33在糖尿病發(fā)病機制研究中的應用331 1型糖尿病1型糖尿病是一種具有嚴重炎性反應的慢性自身免疫性疾病，由于胰島B細胞大量破壞引起胰島素分泌不足，導致機體糖代謝紊亂J。通過對MIN6細胞系的進一步研究發(fā)現(xiàn)，miR一146、miR-21、miR34a在白細胞介素一1B、腫瘤壞死因子0【等誘導的B細胞功能衰竭中有重要作用，而miR一34、rniR一146a能保護MIN6細胞免受細胞因子誘發(fā)的死亡，提示微小RNA異?？赡芤鹱陨砻庖叻磻?，從而導致1型糖尿病2。曹朝暉等副的研究認為，caspase3激活與MIN6細胞凋亡有關，炎性反應因子可能通過激活凋亡相關蛋白誘導細胞的凋亡，這其中可能涉及細胞凋亡的線粒體途徑和死亡受體途徑的信號轉(zhuǎn)導。以MIN6細胞系為例，對l型糖尿病的發(fā)生有一定的意義。3322型糖尿病代謝綜合征是2型糖尿病的高危因素之一，Ding等41通過對MIN6細胞系的研究發(fā)現(xiàn)，木犀草素可以通過核因子一KB一誘導型一氧化氮合酶-一氧化氮途徑調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子MafA的表達，而該途徑是高尿酸作用于胰島8細胞的關鍵，由此降低高尿酸相關性代謝綜合征的發(fā)生幾率，進而降低高尿酸相關性糖尿病的風險。硫化殼寡糖可以對抗過氧化氫對MIN6細胞系的損害，其機制可能是增強了抗氧化酶的活性，并抑制胞內(nèi)活性氧簇產(chǎn)生H 5I。生理條件下，自噬主要受外源性營養(yǎng)物質(zhì)的調(diào)節(jié)，當機體處于饑餓狀態(tài)時，自噬活性增加。同時，自噬也是機體消除錯誤折疊的大分子、衰老及失能的細胞器的一種途徑。自噬與2型糖尿病有潛在的關系，作為機體防御機制可清除失能細胞器導致的氧化應激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激6|。胰島素能抑制自噬，通過激活mTOR依賴性信號通路，與靶細胞表面胰島素受體結合誘導自身磷酸化，最終使ULKIAtgl3。FIP200復合體失去活性，從而抑制自噬017-18 3。而2型糖尿病患者由于胰島素抵抗，相關作用減弱，最終導致細胞自噬增強。杜世春等引發(fā)現(xiàn)，晚期糖基化終末產(chǎn)物可以抑制MIN6細胞活力，并使細胞內(nèi)活性氧簇的生成增加，誘導MIN6細胞氧化應激，從而影響胰島素分泌。RIPl40是代謝性核受體輔助因子家族中的一員，主要作為抑制因子調(diào)控肝臟、肌肉及脂肪中的糖、脂代謝。2型糖尿病患者外周血單核細胞中RIPl40的表達較正常明顯升高。敲除小鼠RIPl40基因能改善高脂飲食條件下的胰島素抵抗、增加胰島素刺激時的糖攝取，同時還可以抑制年齡和飲食誘導的糖耐量異常的發(fā)生。下調(diào)RIPl40表達能夠通過上調(diào)能量消耗相關基因來改善細胞內(nèi)氧化應激水平。薛君力等o通過利用H202建立了MIN6細胞的氧化應激損傷模型，并利用RNA干擾下調(diào)MIN6細胞中的RIPl40表達，觀察到以RIPl40為靶點可以調(diào)控B細胞損傷。3321B細胞胰島素分泌B細胞分泌胰島素是一個雙相的過程。第一時相發(fā)生較快，在血糖變化后10 rain之內(nèi)，分泌高峰在12 rain。第二時相出現(xiàn)較晚，但持續(xù)時問較長，峰值在2530 min。2型糖尿病患者最初第一時相受損，但保留了第二時相的功能。故是否存在第一時相的損害是預測1型和2型糖尿病風險的因素之一。通過對MIN6細胞的觀察，多次傳代的MIN6細胞形態(tài)不均勻，失去了第一時相功能，GSIS完全受損，胞內(nèi)ATP明顯減少，葡萄糖吸收、氧化和脂質(zhì)氧化也減少，糖酵解基因和脂質(zhì)處理基因包括Srebplc表達降低，導致Sirt3和Nampt基因表達降低，乳酸含量減少，一些脂類合成基因也出現(xiàn)了低表達，包括重要的轉(zhuǎn)錄因子Srebplc。這也使得GLUTl明顯下降，GLUT2也有下降的趨勢。已知ATPADP比值上調(diào)是B細胞釋放胰島素所必須的，其可能會通過提高吸收葡萄糖并氧化來提高ATP”o。3.1MIN6細胞系的細胞學特性MIN6和MIN7細胞系都是由類人猿病毒40大T抗原啟動子所激發(fā)而得到的，兩者都呈均勻形態(tài)、集落生長，有一定的神經(jīng)內(nèi)分泌功能，包含較高水平的胰島素mRNA和類人猿病毒40T抗原mRNA。免疫組化分析也提示它們是由同一種胰島細胞分化演變而來。但兩者的GSIS不同，MIN6細胞系分泌胰島素的量隨血糖升高而顯著升高，這與體外培養(yǎng)的正常胰島細胞基本相似。它們都能產(chǎn)生較高水平的肝型GLUT mRNA，MIN6細胞系只能產(chǎn)生少量的腦型GLUT mRNA。故MIN6細胞系在功能上更接近于胰島細胞。MIN6細胞系保留了細胞特性，可以在血糖和其他促分泌因素刺激下分泌胰島素。但是MIN6細胞在多次傳代后會發(fā)生基因改變，從而失去分泌胰島素的能力，這些基因的改變包括下調(diào)某些基因如磷脂酶D1和膽囊收縮素。多次傳代的細胞對某些蛋白也會出現(xiàn)低表達，包括參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激和活性氧簇生成的抗氧化酶。GLUT是葡萄糖通過細胞膜的重要受體，其中GLUT9和GLUT2也參與了GSIS。既往研究發(fā)現(xiàn)，傳代次數(shù)不多的MIN6細胞系GLUT2的表達幾乎沒有差異，與多次傳代的MIN6細胞系相比較，在基因和蛋白水平的表達均有改變，但是不影響代謝結果。近年來Yamato等發(fā)現(xiàn)，MIN6亞群C4更好的保留了GSIS能力，更適用于體外胰島B細胞系研究。MIN6細胞系不僅可以分泌胰高血糖素樣肽-1，其信號可以通過一種自分泌方式被放大，從而維持其胰島素分泌的功能。這是MIN6細胞系生存和分泌胰島素的基礎。3.2MIN6細胞系的臨床應用3.1MIN6細胞系的細胞學特性MIN6和MIN7細胞系都是由類人猿病毒40大T抗原啟動子所激發(fā)而得到的，兩者都呈均勻形態(tài)、集落生長，有一定的神經(jīng)內(nèi)分泌功能，包含較高水平的胰島素mRNA和類人猿病毒40T抗原mRNA。免疫組化分析也提示它們是由同一種胰島細胞分化演變而來。但兩者的GSIS不同，MIN6細胞系分泌胰島素的量隨血糖升高而顯著升高，這與體外培養(yǎng)的正常胰島細胞基本相似。它們都能產(chǎn)生較高水平的肝型GLUT mRNA，MIN6細胞系只能產(chǎn)生少量的腦型GLUT mRNA。故MIN6細胞系在功能上更接近于胰島細胞。MIN6細胞系保留了細胞特性，可以在血糖和其他促分泌因素刺激下分泌胰島素。但是MIN6細胞在多次傳代后會發(fā)生基因改變，從而失去分泌胰島素的能力，這些基因的改變包括下調(diào)某些基因如磷脂酶D1和膽囊收縮素。多次傳代的細胞對某些蛋白也會出現(xiàn)低表達，包括參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激和活性氧簇生成的抗氧化酶。GLUT是葡萄糖通過細胞膜的重要受體，其中GLUT9和GLUT2也參與了GSIS。既往研究發(fā)現(xiàn)，傳代次數(shù)不多的MIN6細胞系GLUT2的表達幾乎沒有差異，與多次傳代的MIN6細胞系相比較，在基因和蛋白水平的表達均有改變，但是不影響代謝結果。近年來Yamato等發(fā)現(xiàn)，MIN6亞群C4更好的保留了GSIS能力，更適用于體外胰島B細胞系研究。MIN6細胞系不僅可以分泌胰高血糖素樣肽-1，其信號可以通過一種自分泌方式被放大，從而維持其胰島素分泌的功能。這是MIN6細胞系生存和分泌胰島素的基礎。3.2MIN6細胞系的臨床應用3.2.1測定胰腺分泌的激素胰腺組織有5種內(nèi)分泌細胞：分泌胰高血糖素的細胞，分泌胰島素的細胞，分泌生長抑素的細胞，分泌胰多肽的細胞，分泌ghrelin的細胞。它們共同維持血糖的穩(wěn)定。MIN6細胞系可分泌以上5種激素。Nakashima等發(fā)現(xiàn)MIN6細胞系可以表達Pdxl，NeuroD，Nkx6.1，Nkx2.2，Pax6，Ngn3，Pax4，Bran4和CckBr等基因，而這些基因同樣也在胰島中表達。3.2.2在氨基酸研究中的應用某些氨基酸，如L-谷氨酸和L-精氨酸，是胰島細胞的適宜刺激信號。研究發(fā)現(xiàn)在接受L-谷氨酸和L-精氨酸刺激后，MIN6細胞內(nèi)三磷酸肌醇和Ca2+濃度均顯著上升，這有助于了解TaslR家族的表達情況。所以，可以利用MIN6細胞系表達氨基酸受體作相關研究。AMP活化蛋白激酶(AMPK)是反映細胞狀態(tài)的傳感器，其活化影響了胰島細胞的GSIS。哺乳動物的AMPK是絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶，其功能是滅活葡萄糖。MIN6細胞系中，蛋白激酶A使AMPK1Serl73、Ser485和Ser497位點磷酸化，通過上游激酶活化而阻礙了Thrl72磷酸化。蛋白激酶B則使AMPKotS485位點活化，并抑制肝激酶B1(LKBl)的Thrl72磷酸化，從而減少AMPK的活化。但使用INS-1細胞系在研究過程中得到不同結果，蛋白激酶B引起AMPKSer485位點發(fā)生磷酸化，阻止了LKBlThrl72的磷酸化，由于AMPK-LKBl間的級聯(lián)反應而降低了AMPK的活性。出現(xiàn)這種矛盾的結果可能與使用不同的細胞系有關。王威等發(fā)現(xiàn)，MIN6細胞系對血糖的調(diào)節(jié)能力優(yōu)于INS-1細胞系。3.2.3在糖尿病發(fā)病機制研究中的應用3.2.3.1 1型糖尿病1型糖尿病是一種具有嚴重炎性反應的慢性自身免疫性疾病，由于胰島細胞大量破壞引起胰島素分泌不足，導致機體糖代謝紊亂。通過對MIN6細胞系的進一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-146、miR-21、miR-34a在白細胞介素-1B、腫瘤壞死因子-1等誘導的細胞功能衰竭中有重要作用，而miR-34、rniR-146a能保護MIN6細胞免受細胞因子誘發(fā)的死亡，提示微小RNA異?？赡芤鹱陨砻庖叻磻瑥亩鴮е?型糖尿病。曹朝暉等的研究認為，caspase-3激活與MIN6細胞凋亡有關，炎性反應因子可能通過激活凋亡相關蛋白誘導細胞的凋亡，這其中可能涉及細胞凋亡的線粒體途徑和死亡受體途徑的信號轉(zhuǎn)導。以MIN6細胞系為例，對l型糖尿病的發(fā)生有一定的意義。3.2.3.2 2型糖尿病代謝綜合征是2型糖尿病的高危因素之一，Ding等通過對MIN6細胞系的研究發(fā)現(xiàn)，木犀草素可以通過核因子-KB-誘導型一氧化氮合酶-一氧化氮途徑調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子MafA的表達，而該途徑是高尿酸作用于胰島細胞的關鍵，由此降低高尿酸相關性代謝綜合征的發(fā)生幾率，進而降低高尿酸相關性糖尿病的風險。硫化殼寡糖可以對抗過氧化氫對MIN6細胞系的損害，其機制可能是增強了抗氧化酶的活性，并抑制胞內(nèi)活性氧簇產(chǎn)生。生理條件下，自噬主要受外源性營養(yǎng)物質(zhì)的調(diào)節(jié)，當機體處于饑餓狀態(tài)時，自噬活性增加。同時，自噬也是機體消除錯誤折疊的大分子、衰老及失能的細胞器的一種途徑。自噬與2型糖尿病有潛在的關系，作為機體防御機制可清除失能細胞器導致的氧化應激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激。胰島素能抑制自噬，通過激活mTOR依賴性信號通路，與靶細胞表面胰島素受體結合誘導自身磷酸化，最終使ULKI-Atgl3-FIP200復合體失去活性，從而抑制自噬。而2型糖尿病患者由于胰島素抵抗，相關作用減弱，最終導致細胞自噬增強。杜世春等發(fā)現(xiàn)，晚期糖基化終末產(chǎn)物可以抑制MIN6細胞活力，并使細胞內(nèi)活性氧簇的生成增加，誘導MIN6細胞氧化應激，從而影響胰島素分泌。RIPl40是代謝性核受體輔助因子家族中的一員，主要作為抑制因子調(diào)控肝臟、肌肉及脂肪中的糖、脂代謝。2型糖尿病患者外周血單核細胞中RIPl40的表達較正常明顯升高。敲除小鼠RIPl40基因能改善高脂飲食條件下的胰島素抵抗、增加胰島素刺激時的糖攝取，同時還可以抑制年