產(chǎn)品無菌檢驗操作規(guī)程.doc

文件編號： 產(chǎn)品無菌檢驗操作規(guī)程編制 日期審核 日期批準(zhǔn) 日期版號 生效日期 公司公司文件編號版本號產(chǎn)品無菌檢驗修改次數(shù)0作業(yè)指導(dǎo)書頁次/1 目的通過無菌檢驗，確保滅菌后產(chǎn)品能夠達(dá)到無菌的要求。2 適用范圍適用于滅菌后醫(yī)療器械產(chǎn)品（列舉）的無菌檢驗。3 檢驗依據(jù)本廠產(chǎn)品注冊標(biāo)準(zhǔn)（編號）EN1174-1996 醫(yī)療器械滅菌產(chǎn)品中微生物數(shù)量的評估中國藥典（2005年版）GB14233.2-2005 醫(yī)用輸液、輸血、注射器具檢驗方法第二部分：生物試驗方法GB15980-1995 一次性使用醫(yī)療用品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)4 儀器、設(shè)備百級層流超凈工作臺、電熱干燥箱、電熱恒溫培養(yǎng)箱、霉菌培養(yǎng)箱、壓力蒸汽滅菌器、集菌儀（器）、電子天平、PH計、冰箱、恒溫水浴鍋、酒精燈、三角燒瓶，接種環(huán)、無菌棉簽、鑷子，試管架，大試管若干等。5 無菌檢驗室的環(huán)境要求5.1 無菌檢驗應(yīng)在環(huán)境潔凈度10000級下的局部百級的單向流空氣區(qū)域內(nèi)進(jìn)行。5.2 緩沖區(qū)與外界環(huán)境、無菌檢驗室與緩沖區(qū)之間空氣應(yīng)保持正壓，陽性對照室與緩沖區(qū)之間空氣應(yīng)保持負(fù)壓。無菌檢驗室與室外大氣之間靜壓差應(yīng)大于10Pa。無菌檢驗室的室溫應(yīng)保持1826，相對濕度：4565%。5.3 無菌檢驗室的單向流空氣區(qū)、工作臺面及環(huán)境應(yīng)定期按醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測試方法的現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的監(jiān)測。每年至少檢測一次。5.4 無菌檢驗過程中應(yīng)同時檢查超凈工作臺單向流空氣中的菌落數(shù)：每次操作時在層流空氣所及臺面的左中右置3個營養(yǎng)瓊脂平板，暴露30min，于3035培養(yǎng)48小時，菌落數(shù)平均應(yīng)不超過1CFU/平板。6 無菌檢驗前的準(zhǔn)備6.1 器具滅菌、消毒6.1.1 滅菌：試驗過程中與供試品接觸的所有器具必須采用可靠方法滅菌。可經(jīng)電熱干燥箱160以上干烤2小時，或置壓力蒸汽滅菌器內(nèi)121蒸汽滅菌30分鐘后使用（根據(jù)滅菌效果驗證決定滅菌參數(shù)）。所有的滅菌物品不應(yīng)超過2周即用畢，否則應(yīng)重新滅菌。6.1.2 消毒：凡檢驗中使用的器材無法滅菌處理的，使用前必須經(jīng)消毒處理。如無菌檢驗室的試管架、電子天平、工作臺面、工作人員的手、橡膠吸頭等?？刹捎孟緞┙莼虿潦谩Ｏ緞?yīng)每月更換，以防止產(chǎn)生耐藥菌株。6.1.3 標(biāo)識：器具的滅菌、消毒后必須做好標(biāo)識，標(biāo)明滅菌、消毒時間和使用有效期。6.2 人員、物料進(jìn)入無菌檢驗室6.2.1 開啟紫外線燈或臭氧發(fā)生器進(jìn)行空間滅菌處理，消毒時間不得少于30min。6.2.2 物料進(jìn)入無菌檢驗室流程6.2.2.1 脫包：進(jìn)入無菌檢驗室的物品若有雙重包裝的，需將外包裝在傳遞窗/緩沖間拆除后，傳入試驗室。6.2.2.2 消毒：進(jìn)入無菌操作室的所有培養(yǎng)基、供試品等的外表都應(yīng)采用適用的方法進(jìn)行消毒處理，以避免將外包裝污染的微生物帶入無菌檢驗室。6.2.2.3 傳遞：查看所有進(jìn)入無菌檢驗室的器具上的滅菌、消毒標(biāo)識，是否在有效期內(nèi)。符合要求的經(jīng)傳遞窗傳入無菌檢驗室。6.2.3 人員進(jìn)入無菌檢驗室流程6.2.3.1 更鞋脫衣：在一更區(qū)脫去一般區(qū)工作鞋，穿上無菌檢驗室工作鞋；脫去一般區(qū)工作服。6.2.3.2 洗手：首先用肥皂或洗手液在手上揉擦出泡沫，再用流水連續(xù)沖洗20秒，洗凈泡沫。6.2.3.3 更衣：在二更區(qū)按照從上到下的順序穿戴無菌工作服（包括衣、帽、口罩等），要求褲子掖在上衣里，口罩掩住口鼻，帽子包裹所有頭發(fā)。6.2.3.4 手消毒：用消毒液浸泡雙手5秒以上或用浸過消毒液的棉球擦拭雙手。消毒液可用洗必泰、新潔爾滅、碘伏、75%酒精等。6.2.3.5 人員進(jìn)入：經(jīng)緩沖間進(jìn)入無菌檢驗室。6.2.4 人員進(jìn)入無菌檢驗室后，進(jìn)一步用消毒液擦拭工作臺面，戴無菌手套。7 無菌檢驗操作要求7.1 全過程必須嚴(yán)格執(zhí)行無菌操作，防止微生物污染。7.2 使用玻璃器皿應(yīng)輕取輕放，避免破損，以防培養(yǎng)物擴(kuò)散。7.3 所有操作均應(yīng)在近火焰區(qū)進(jìn)行，且不得有大幅度或快速動作，以免攪動空氣中的塵埃微粒。7.4 使用金屬接種器具時，用前、用后均需灼燒滅菌。7.5 在接種培養(yǎng)物時，動作應(yīng)輕、準(zhǔn)，防止培養(yǎng)物濺出，產(chǎn)生汽溶膠，造成污染。7.6 操作過程中所有的帶菌物品，用后均應(yīng)作消毒、滅菌處理。可在檢驗過程中隨用隨時放入消毒液缸內(nèi)浸泡或消毒桶內(nèi)，或在檢驗完成后經(jīng)傳遞窗傳至一般區(qū)，立即用壓力蒸汽滅菌鍋121滅菌30分鐘。8 培養(yǎng)基制備8.1需氣菌、厭氣菌培養(yǎng)基（硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基）的制備8.1.1 所用試劑酪胨（胰酶水解）15.0g葡萄糖5.0gL-胱氨酸0.5g硫乙醇酸鈉0.5g（或硫乙醇酸）（0.3ml）酵母浸出粉5.0g氯化鈉2.5g新配制的0.1%刃天青溶液1.0ml瓊脂0.75g水1000ml8.1.2 制備除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分混合，微溫溶解，調(diào)節(jié)pH為弱堿性，煮沸，濾清，加入葡萄糖和刃天青溶液，搖勻，調(diào)節(jié)pH為7.10.2。8.1.3 硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)劑氧化層的顏色要求在供試品接種前，培養(yǎng)基氧化層的高度不得超過培養(yǎng)基深度的1/5，否剛需經(jīng)100水浴加熱到粉紅色消失（不超過20分鐘）迅速冷卻，只限加熱一次，并應(yīng)防止被污染。8.2 霉菌培養(yǎng)基（改良馬丁培養(yǎng)基）的制備8.2.1 所用試劑胨5.0g酵母浸出粉2.0g葡萄糖20.0g磷酸二氫鉀1.0g硫酸鎂0.5g水1000 ml8.2.2 制備除葡萄糖外，取上述成分混和，微溫溶解，調(diào)節(jié)pH值約為6.8，煮沸，加葡萄糖溶解后，搖勻，濾清，調(diào)節(jié)pH為6.40.2。8.3 還可使用按處方生產(chǎn)的符合規(guī)定的脫水培養(yǎng)基，按照使用說明書配制。8.4 培養(yǎng)基配制后應(yīng)盡快滅菌，避免微生物繁殖。一般采用高壓蒸汽121滅菌30分鐘。8.5 制備好的培養(yǎng)基應(yīng)在225保存，在3周內(nèi)使用。8.6 培養(yǎng)基的無菌性檢查每批配制的培養(yǎng)基均應(yīng)進(jìn)行無菌性檢查（可與產(chǎn)品無菌檢驗同步進(jìn)行）。檢查時，每批培養(yǎng)基隨機(jī)取不少于5支（瓶）培養(yǎng)14天，應(yīng)無菌生長。9 稀釋液、沖洗液的制備9.1 0.1%蛋白胨水溶液取蛋白胨1.0g，加水1000ml，微溫溶解，濾清，分裝后置入壓力蒸汽滅菌器內(nèi)，121滅菌30分鐘后，于4保存?zhèn)溆谩?.2 pH7.0 氯化鈉-蛋白胨緩沖液取磷酸二氫鉀3.56g、磷酸氫二鉀7.23g、氯化鈉4.30g、蛋白胨1.0g，加水1000ml。微溫溶解，濾清，分裝后置入壓力蒸汽滅菌器內(nèi)，121滅菌30分鐘后，于4保存?zhèn)溆谩?.3 浸提介質(zhì)：9g/L無菌氯化鈉溶液，可直接從有證單位采購大輸液。10 對照菌液制備10.1 無菌檢驗所用的菌株傳代次數(shù)不得超過5代。10.2取金黃色葡萄球的普通瓊脂斜面培養(yǎng)物，接種一白金耳至營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)，在3035培養(yǎng)1824h后備用，同時制備0.9%氯化鈉溶液加入在6支小試管內(nèi)，每支試管內(nèi)加9.0ml的0.9%氯化鈉溶液，在壓力鍋內(nèi)經(jīng)121滅菌30min備用。將已配好的金黃色葡萄球菌培養(yǎng)菌液取1.0ml加入第一支小試管內(nèi)，稀釋成濃度1:10的菌液；取第一支試管內(nèi)1.0m l菌液加入第二支小試管內(nèi)，稀釋成濃度1:100的菌液，同法稀釋成濃度1:106（每ml含菌量100CFU）即可。10.3 采用平皿計數(shù)法測定活菌數(shù)。11 無菌檢驗培養(yǎng)溫度硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基，置3035培養(yǎng)。改良馬丁培養(yǎng)基，置2328培養(yǎng)。12 無菌檢驗12.1 如產(chǎn)品注冊標(biāo)準(zhǔn)中明確“產(chǎn)品應(yīng)經(jīng)過一個確認(rèn)過的滅菌過程”，則執(zhí)行12.1項下各項。12.1.1 放樣每個滅菌批次按已驗證的滅菌工藝，在滅菌柜內(nèi)相應(yīng)的位置放置適量菌片，滅菌后對菌片進(jìn)行無菌檢驗。12.1.2 菌片貯存滅菌前、后菌片應(yīng)按菌片說明書規(guī)定條件保存。（REVEN公司菌貯存溫度為1527）12.1.3 接種開啟超凈工作臺單向?qū)恿?，在此環(huán)境下，分別將滅菌后的菌片成對放入已滅菌的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中。同時以金黃色葡萄球菌作陽性對照，以未接種的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和未接種的改良馬丁培養(yǎng)基作為陰性對照。12.1.4 培養(yǎng)陽性對照管于3035細(xì)菌培養(yǎng)箱培養(yǎng)4872小時。其余硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基于3035培養(yǎng)7天。改良馬丁培養(yǎng)基于2328培養(yǎng)7天。12.1.5 結(jié)果判定培養(yǎng)后，陽性對照應(yīng)有菌生長，陰性對照和被檢樣品未見需氣菌、厭氣菌和霉菌生長的為合格。12.2 如產(chǎn)品注冊標(biāo)準(zhǔn)中明確產(chǎn)品應(yīng)進(jìn)行無菌檢驗，則執(zhí)行12.2.112.2.5。12.2.1 抽樣根據(jù)各自的產(chǎn)品注冊標(biāo)準(zhǔn)和相應(yīng)產(chǎn)品出廠檢驗規(guī)程的規(guī)定，對成品庫內(nèi)的產(chǎn)品進(jìn)行抽樣。一般同一個滅菌批產(chǎn)品檢驗311個單位供試品。12.2.2 供試液準(zhǔn)備優(yōu)先采用將供試品或其有代表性的各部分直接投放入培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)的方法，如供試品不適宜直接投放，可按下列方法制備供試液，應(yīng)使浸提介質(zhì)充分洗提供試品的浸提表面，供試液制備應(yīng)按無菌操作法進(jìn)行，在制備后2小時內(nèi)使用。根據(jù)供試品具體特性選擇下列方法：a) 管類器具：按管內(nèi)表面積每10cm2流過管內(nèi)腔1ml浸提介質(zhì)，流量約為10ml/min，收集到無菌的容器內(nèi)。b) 容器類器具：按容器內(nèi)表面積每10cm2加入浸提介質(zhì)1ml的比例，振搖數(shù)次。 c) 實體類器具：實體類器具按表面及每10cm2加入浸提介質(zhì)1ml，振搖數(shù)次。收集上述沖洗液或浸提介質(zhì)于無菌容器中。12.2.3 接種12.2.3.1 薄膜過濾法：優(yōu)先采用封閉式薄膜過濾器（集菌器），也可使用開放式薄膜過濾器。濾膜孔經(jīng)不大于0.45。濾器和濾膜使用前應(yīng)采用適宜的方法滅菌，或直接采用無菌集菌器。a、如采用封閉式薄膜過濾器，取一副三聯(lián)式集菌器，將供試液通過集菌儀過濾，使通過每只培養(yǎng)管的量基本均勻。然后通過集菌儀一只加120ml改良馬丁培養(yǎng)基，另兩只分別加入120ml硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基（其中一只做陽性對照，內(nèi)加金黃色葡萄球菌液1ml）。另取一副二聯(lián)集菌器，用同批的沖洗液或浸提介質(zhì)120ml通過集菌儀過濾（每只約50ml），同法一只加硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基120ml，另一只加改良馬丁培養(yǎng)基120ml分別作陰性對照。b、如用一般薄膜過濾器，將供試液過濾后取出濾膜，將其剪成3等份，分別置于含50ml硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基及改良馬丁培養(yǎng)基的容器中，其中兩份作檢驗，一份作陽性對照。12.2.3.2 直接接種法：適用于一次性使用注射針、一次性使用靜脈輸液針（包括輸液器、輸血器、注射器配套使用注射針）。a、敷料供試品：取規(guī)定數(shù)量，每個包裝以無菌操作拆開，于不同部位剪取約120mg或1cm3cm的供試品，接種于各管足以浸沒供試品的適量培養(yǎng)基中。b、無菌針頭：直接投入含15ml以上硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基及改良馬丁培養(yǎng)基的容器中。c、一次性使用的材料：拆散或切成小碎斷，接種于各管足以浸沒供試品的適量培養(yǎng)基中。供試品按規(guī)定量分別接種至各含硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基及改良馬丁培養(yǎng)基的容器中，其中一份作陽性對照。每個容器中培養(yǎng)基的用量應(yīng)符合：接種的供試品體積不得大于培養(yǎng)基體積的10%，或培養(yǎng)基的裝量足以浸沒供試品。每管培養(yǎng)基的最低用量硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基每管裝量不少于15ml，改良馬丁培養(yǎng)基每管裝量不少于10 ml.12.2.4 培養(yǎng)、觀察上述含培養(yǎng)基的容器分別置規(guī)定溫度的恒溫培養(yǎng)箱中，除陽性對照管培養(yǎng)4872小時外，其余管培養(yǎng)14天。培養(yǎng)期間應(yīng)逐日觀察并記錄是否有菌生長。如在加入供試品后、或在培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基出現(xiàn)渾濁，培養(yǎng)14天后，不能從外觀上判斷有無微生物生產(chǎn)，可取該培養(yǎng)液適量轉(zhuǎn)種至同種新鮮培養(yǎng)基中或劃線接種于斜面培養(yǎng)基上，細(xì)菌培養(yǎng)2天，真菌培養(yǎng)3天，觀察是否再出現(xiàn)渾濁或斜面有無菌生長；或取培養(yǎng)液涂片，染色，鏡檢，判斷是否有菌。12.2.5 結(jié)果判斷培養(yǎng)結(jié)束后，陽性對照管應(yīng)有菌生長，陰性對管應(yīng)澄清。否則，就判結(jié)果無效。所有供試品管均澄清，或雖顯渾濁但經(jīng)確證無菌生長，判供試品符合規(guī)定。若供試品管中任何1管顯渾濁并確證有菌生