生化酶學教材.doc

高低。根據(jù)酶促反應進程曲線，采用合理的方法進行的酶活性濃度測定，原理科學、方法簡便、靈敏度高、成本低、應用廣泛。 (一)酶活性濃度的表示方法酶活性用活性單位表示，常用的酶活性單位有慣用單位、國際單位和Katal單位。 1慣用單位 20世紀50年代以前常用首先報告某種酶測定方法的臨床酶學家的名字來命名該酶的活性單位，如測定AMY的Somogyi單位，轉(zhuǎn)氨酶的Karmen單位等。酶不同，慣用單位就不同，即使同一種酶也因測定方法不同而有數(shù)種活性單位，應用不便，現(xiàn)已少用。 2國際單位 1963年國際酶學委員會推薦采用國際單位來統(tǒng)一表示酶活性的大小，即在25及其他最適條件下，每分鐘催化1微摩爾底物轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物所需要的酶量為一個國際單位。1965年將溫度改為30，1972年又取消了對溫度的規(guī)定。到1976年對酶活性單位的定義為：在特定的條件下，1分鐘內(nèi)轉(zhuǎn)變1微摩爾底物的酶量為一個國際單位，以IU表示，即1IU=1molmin。由于未指定反應溫度，目前省略國際二字，即常將IU簡寫為U。 3Katal單位 1979年國際生化協(xié)會為了使酶活性單位與國際單位制(SI)的反應速率相一致，推薦用Katal單位(也稱催量，簡寫為Kat)。即在規(guī)定條件下，每秒鐘催化1摩爾底物轉(zhuǎn)化所需的酶量，1 katal=1 mols。我國法定計量單位制中的酶催化活性單位為katal，其對血清中酶量而言顯然過大，故常用單位為katal或nkatal。1 katal=60106U，1 U=1molmin=16.67nmols=16.67nkatal。 4酶活性濃度單位 臨床上測定的不是酶的絕對量而是濃度。酶活性濃度以單位體積所含的酶活性單位數(shù)表示。常用UL來表示體液中酶催化濃度，也可用katal/L報告酶活性濃度。 (二)酶促反應進程 酶促反應體系中，底物濃度S和產(chǎn)物濃度P隨著反應的進行不斷發(fā)生變化。如將酶反應過程中測得的P或S變化量對時間作圖，可得酶促反應時間進程曲線(圖4-1)。該曲線反映了酶促反應進程中主要成分的變化規(guī)律，也可以從中得到酶促反應的速度。圖中P或S變化曲線的斜率就代表酶促反應的速率。典型的酶促反應過程一般包括三個時期，即延滯期、線性期和非線性期。 1延滯期 延滯期(lag phase)是指反應開始的一段時間，此時S開始下降，隨之有相應P逐漸增加。但由于多種因素的影響，該期酶促反應速度比較慢。不同反應的延滯期長短不等，可以從幾秒到幾分鐘。單一酶促反應的延滯期是從反應開始至達到最大反應速度所需要的時間。期間發(fā)生的變化包括酶活性中心的形成與催化位點的暴露、酶與輔酶因子的結(jié)合、底物的解離、底物與酶的結(jié)合等。酶偶聯(lián)反應的延滯期較長，除了以上過程之外，還包括中間產(chǎn)物的積聚、指示反應速度增加、指示反應速度與待測酶的酶促反應速度達到平衡所需的時間。因此，輔助酶越多延滯期就越長，通常為13分鐘。2線性期 線性期(linear phase)是指延滯期后酶促反應速度達到最大反應速度并保持相對恒定的一段時期，此時有過量底物存在，時間進程曲線呈直線或接近直線狀態(tài)。 因線性期底物量足夠，酶促反應速率不受底物濃度的影響，產(chǎn)物P和底物S變化與t成直線關系，因此測定此時的酶促反應速率就能較好地反映酶活性的大小。不過線性期是一個相對的概念，試劑中底物用量不可能大到完全不限制酶活性發(fā)揮的程度，而且底物量隨著反應進行而不斷消耗。一般認為，當?shù)孜锵牧啃∮?，不足以明顯改變反應速度時，仍認為酶促反應以初速度即最大速度進行。在選定條件下，標本中酶濃度越高，其線性期就越短。在實際工作中往往需要根據(jù)酶促反應動力學曲線，來設定線性期和非線性期的界限。 3非線性期 非線性期(non-inear phase)又稱底物耗盡期，是指線性期后反應速率明顯下降、酶促反應進程曲線偏離直線的一段時期。隨著反應的進行，底物濃度不斷下降，產(chǎn)物濃度不斷上升，使反應體系中逆反應增加；反應產(chǎn)物的抑制作用、酶的熱失活、酶的聚合或解離等也會增加，這些原因會使酶促反應變慢。在這段時期酶促反應速度受底物濃度的影響較大，產(chǎn)物P和底物S變化與時間t之間不成直線關系?？梢?，只有依據(jù)酶促反應進程曲線中線性期的反應速率才能準確計算出反應體系中的酶活性濃度。因此，不論采用哪種酶活性濃度測定方法，都應該盡量保證在線性期進行檢測，如果在延滯期或非線性反應期檢測勢必造成較大的誤差。二、酶活性測定方法按照檢測時段的不同，酶活性測定方法可分為定時法和連續(xù)監(jiān)測法兩大類。 (一)定時法定時法(flxed time assay)指測定酶促反應過程中某一段時間內(nèi)底物的消耗量或產(chǎn)物的生成量，計算出該時段內(nèi)的平均反應速度，再換算成molmin，以此代表待測酶的活性濃度。該法一般是在反應一開始即計時，到達設定時間時加入終止劑(強酸、強堿、蛋白沉淀劑等)終止酶促反應，測定這段時間內(nèi)底物或產(chǎn)物濃度的變化，因此，不僅底物或產(chǎn)物濃度的測定要準確，還必須計時準確。1定時法的特點 主要優(yōu)點是設備簡單，操作方便，檢測過程中不需要恒溫設備，用分光光度計即可測定；也不用考慮顯色劑對酶活性的影響，是早期測定酶活性濃度的常用方法。 定時法的主要不足在于不能確保選定的測定時段全部處于線性期，因此測定誤差難以估計。如圖4-2所示，用定時法測定3個標本的某酶活性時，他們的反應進程不同，所含的酶活性濃度不等。但如果取t1到t2這一相同時間段來測定，由于產(chǎn)物的變化量相同，計算出的反應速度也就相等。造成這種錯誤的原因在于，此檢測時段曲線1的酶促反應已經(jīng)減慢進入非線性期，檢測時間包含有線性期和部分非線性期，曲線2的酶促反應還沒有達到最大反應速度，檢測時間包含了部分延滯期，兩者測定結(jié)果都不能代表體系中的酶活性，只有曲線3完全處于線性期，產(chǎn)物變化量與酶濃度成正比，測定的結(jié)果才準確。因此，用定時法時必須先了解反應體系的時間進程曲線特征，找出反應速度恒定的時期為測定時段。在實際工作中，延滯期很難確定，而且一般很短，對酶活性測定產(chǎn)生的影響不大。但非線性期的影響不容忽視，隨著保溫時間的延續(xù)，酶變性失活加速，逆反應加強，對活性測定產(chǎn)生的影響非常明顯。 2定時法酶活性的計算 根據(jù)測定方法的不同，可以利用標準比較法、標準曲線法或吸光系數(shù)法計算出酶活性濃度單位。過去常用的是前兩種方法，即同時測定標準品和樣本，根據(jù)吸光度變化來計算樣本酶活性，但有很大不足。主要是因為沒有真正的酶標準品，大多是用酶反應產(chǎn)物(或底物)的標準品來代替。這樣做不包含真正的酶促反應，即使將該標準品在基本上相同于樣本的條件下進行化學反應，測定誤差不可避免，因此現(xiàn)已少用。 目前常用的是吸光系數(shù)法，根據(jù)待測底物或產(chǎn)物的摩爾吸光系數(shù)和測定方法計算出酶活性濃度單位。例如某樣本中的酶活性為x UL，取樣量Vs(ml)與底物緩沖液Vr(ml)孵育，經(jīng)過t分鐘反應，加入終止液Ve(ml)，檢測到產(chǎn)物吸光度增加為A，該產(chǎn)物的摩爾消光系數(shù)為，比色皿光徑為b cm。 根據(jù)朗伯-比爾定律A=bc可得，c=Ab。 其中c為產(chǎn)物的濃度，即產(chǎn)物的總變化量dP，根據(jù)以上公式可求出反應速度即酶活性為：乘以測定時的稀釋倍數(shù)，再換算成國際單位，即可得樣本中的酶活性X(UL)： 式中反應總體積Vt=Vs+Vr+Ve。 (二)連續(xù)監(jiān)測法 連續(xù)監(jiān)測法(continuous monitoring assay)是連續(xù)監(jiān)測酶促反應進程中某一反應產(chǎn)物或底物濃度隨時間變化的多點數(shù)據(jù)，找出反應的線性期，求出最大酶促反應速度，從而計算酶活性濃度。具體方法是將待測酶與合適底物在特定條件下孵育，在酶促反應的線性期每隔一定時間連續(xù)多次檢測酶促反應過程中某一底物或產(chǎn)物的特征信號的變化，從而計算出每分鐘的信號變化速率，再求出酶活性濃度。因此，連續(xù)監(jiān)測法有時也稱為速率法。 1連續(xù)監(jiān)測法的特點 與定時法不同，連續(xù)監(jiān)測法不需要終止酶促反應，不需添加其他顯色試劑，直接檢測待測酶反應或偶聯(lián)的指示酶反應的產(chǎn)物或底物變化，很容易觀察反立的整個過程。連續(xù)監(jiān)測法的優(yōu)點是連續(xù)觀測反應進程，可以明確找到反應的線性期，。 連續(xù)監(jiān)測法在特定條件下進行，要求足夠的底物濃度，還要精確控制溫度、pH值等反應條件，對儀器要求較高，需要具有恒溫裝置和連續(xù)記錄吸光度裝置。半自動或全自動生化分析儀都能達到這些要求。隨著自動生化分析儀的普及，連續(xù)監(jiān)測法已逐步取代定時法，成為目前最常用的方法自動生化分析儀能自動間隔一定時間(1060秒)測定一次底物或產(chǎn)物的變化量，連續(xù)測定多點，以測定結(jié)果對時間作圖，繪制反應進程速度曲線，自動判斷是否偏離線性，因而可以選擇線性期來測初速度從而計算酶活性，所以連續(xù)監(jiān)測法更適合于自動化儀器，其結(jié)果遠比定時法所測平均速度準確，在高濃度標本時尤為明顯。由于一般的光度計所測得的摩爾吸光系數(shù)與理論值差別較大，在實際工作中最好帶標準品一起測定。連續(xù)監(jiān)測法還可以根據(jù)理論的摩爾吸光系數(shù)計算出理論K值。在發(fā)表的各種酶活性測定方法中，幾乎每個酶都有定時法和連續(xù)監(jiān)測法可供選擇，從測定準確度出發(fā)，應優(yōu)先選擇連續(xù)監(jiān)測法。 2連續(xù)監(jiān)測法酶活性的計算 用連續(xù)監(jiān)測法進行酶活性測定時，根據(jù)摩爾吸光系數(shù)可以進行酶活性濃度的計算。檢測到線性期內(nèi)的每分鐘吸光度變化即Amin，其酶活性計算公式即為 上式中 建立了某種酶的測定方法后，其中、Vt和Vs均為定值，不同分析儀中b不同，但自動生化分析儀一般都自動將其換算為1cm，因此K值為一個定值，可通過計算得出，稱為理論K值或計算因子，設定到自動生化分析儀中。 3連續(xù)監(jiān)測法的方法類型 根據(jù)檢測物質(zhì)是不是待測酶的底物或產(chǎn)物，可將連續(xù)監(jiān)測法分為直接法和間接法。 (1)直接連續(xù)監(jiān)測法：是直接測定反應體系中待測酶的某一底物或產(chǎn)物的理化特性(吸光度、熒光、旋光性、pH、電導率等)的變化，計算出酶活性濃度。該法雖然簡單，但適用范圍小，只有當?shù)孜锱c產(chǎn)物某一理想化性質(zhì)有顯著差異且便于檢測時，才能使用。故至今只有很少一部分酶能用直接法進行測定。 (2)間接連續(xù)監(jiān)測法：是連續(xù)監(jiān)測法中常用的類型，又分為一步間接法和酶偶聯(lián)法。一步間接法指在原來反應體系中加入一些試劑，這些試劑不與酶作用也不影響酶的活性，但能與產(chǎn)物迅速作用，產(chǎn)生可以被檢測的物質(zhì)。酶偶聯(lián)法指在原來的反應體系中再加入一些酶試劑，使加入的酶促反應和被測酶的酶促反應偶聯(lián)起來，最后的反應產(chǎn)物可直接監(jiān)測，進而推測出第一個酶的活性濃度。在酶偶聯(lián)體系中，被測定的酶(Ex)催化的反應稱為始發(fā)反應，產(chǎn)生被檢測物質(zhì)的反應稱為指示反應，參與偶聯(lián)反應和輔助反應的酶統(tǒng)稱工具酶，其中催化指示反應的偶聯(lián)酶也稱指示酶(Ei)。根據(jù)連續(xù)監(jiān)測法偶聯(lián)體系和檢測信號的不同，可以設計多種檢測方法。常用的間接連續(xù)監(jiān)測法主要有四大類：以人工合成色素原底物反應為基礎的色素原底物連續(xù)監(jiān)測法、以NAD(P)H和NAD(P)+吸光度變化為基礎的脫氫酶反應連續(xù)監(jiān)測法、以Trinder反應做指示反應的氧化酶連續(xù)監(jiān)測法和特殊反應類型的連續(xù)監(jiān)測法，詳見本章第三節(jié)代謝物的酶法分析。 三、酶活性測定的條件優(yōu)化 酶的催化活性與酶促反應的最大速度成正比，只有當反應速度為最大反應速度時V才與酶量E成正比。也只有在此基礎上建立起來的測定方法才可靠和準確。因此，測定酶活性濃度的推薦或參考方法都提出酶活性濃度測定的條件應是酶促反應的最適條件。 所謂最適條件(optimum condition)是指能滿足酶促反應速度達到最大反應速度所需的條件，包括：合適的底物和足夠的底物濃度；理想的緩沖液種類和最適離子強度；反應液的最適pH；最適反應溫度；合適的輔因子、激活劑濃度；酶偶聯(lián)反應中最適的指示酶和輔助酶用量；合理的測定時間，包括延滯期盡量短暫，有足夠的線性期；合適的樣本與試劑比例；足夠的檢測范圍；盡量去除各種抑制劑等。 (一)底物種類和濃度 1底物種類的選擇 底物是酶促反應體系中最重要的因素之一，底物選擇的原則是：盡量選擇Km最小的底物，最好是酶的天然底物；要有足夠的溶解度；酶對底物特異性高；底物穩(wěn)定性好；有較高的臨床價值。 (1)要考慮待測酶的特異性：不同酶對底物的專一性有很大的差別，例如，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶對底物有立體異構選擇性，只能催化L-丙氨酸發(fā)生氨基轉(zhuǎn)移反應。若選擇DL-丙氨酸，要達到同樣的反應速度，則需2倍于L-丙氨酸的用量。對于這些特異性很高的酶而言，選擇底物的種類比較簡單。但對于一些特異性較差的酶來說，底物種類的選擇必須要有理論依據(jù)。 (2)要考慮底物的穩(wěn)定性和臨床價值：例如用于淀粉酶測定的人工合成底物很多，但都存在一個共同的缺點，即底物本身可以自發(fā)水解。該酶測定的參考方法要求用亞乙基封閉的對硝基酚麥芽庚糖苷做底物(EPS法)，就是因為該底物的穩(wěn)定性好。又如臨床上測定酸性磷酸酶主要目的是診斷前列腺癌，所選的底物應對前列腺酸性磷酸酶有較高的特異性，以麝香草酚磷酸鹽做底物最合適。 2底物濃度的確定 酶的米氏常數(shù)(Km值)是酶促反應速度達到最大反應速度Vmax一半時的底物濃度，用molL表示，大多數(shù)酶Km在1 O-31 O-5molL之間。Km值是選擇底物濃度的關鍵參數(shù)之一，代表了酶對底物的親和力，Km越小表示酶與底物的親和力越大，反之亦然。 (1)單底物酶促反應：根據(jù)Michaclis-Menten方程很容易得出以下結(jié)論：若S=10Km，則反應速度達到最大反應速度的909；若S=20Km，則反應速度達到最大反應速度的952；只有當S無窮大時，反應速度才達到最大反應速度，這在實際工作中是不可能的。因此，底物濃度的確定原則是選擇S=1O20Km，此時反應速度基本達到最大反應速度，測定的誤差可以接受。 (2)雙底物酶促反應：雙底物酶促反應動力學與單底物相比更復雜，底物濃度的確定要以動力學方程為基礎，用乒乓機制、序列有序機制和隨機機制等進行分析。雙底物酶促反應速度達到最大反應速度的程度一般要求為9095，根據(jù)不同機制的動力學方程，可以求出兩底物的用量。 (二)緩沖液 緩沖液對酶活性的影響包括緩沖液的種類、離子強度和最適pH等方面。 1緩沖液種類 酶促反應體系中，緩沖液的選擇十分重要。在酶與底物的結(jié)合中，酶和底物都需要合適的解離狀態(tài)；酶催化基團作用的發(fā)揮也需要酶、輔助因子的有效解離；酶的穩(wěn)定性也需要合適的環(huán)境。這一切都離不開緩沖液的作用。依據(jù)對酶活性的影響可將緩沖液分為活性緩沖液、惰性緩沖液和抑制緩沖液。 2最適pH 在最終反應體系中，酶促反應速度達到最大時的pH稱為最適pH。一般來說，血清中大多數(shù)酶的最適pH接近中性。有些酶在最適pH附近活性變化非常顯著，但多數(shù)酶在一定pH范圍內(nèi)相對穩(wěn)定。測定酶活性時一定要選擇在最適pH處。最適pH并非酶的特征性常數(shù)，易受多種因素如緩沖液種類、底物濃度、反應溫度、樣本與反應試劑的比例、防腐劑和添加劑等影響而改變。 3離子強度 緩沖液的離子強度也會影響酶的活性，一般選擇與體液比較接近的離子強度。離子強度越高，電解質(zhì)會干擾酶和底物結(jié)合，酶活性將逐步下降，但離子強度過低也會抑制酶活性。 理想的緩沖液應有足夠的緩沖容量，較強的緩沖能力和較高的純度。選擇緩沖液時盡量選擇活性緩沖液或惰性緩沖液，不可選擇抑制型緩沖液，對酶活性表達有促進作用和穩(wěn)定作用則更好。目前常用的緩沖液有N-2-羥乙基哌嗪-N-2-乙磺酸(HEPES)、N，N-雙(2-乙磺酸)哌嗪(PIPES)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、三乙醇胺(TRA)、二乙醇胺(DEA)、2-甲基-2-氨基-1-丙醇(AMP)等。 (三)反應溫度 溫度越高，反應活化能越大，酶與底物結(jié)合的機會越多，反應速度越快。但是，溫度增高，酶的變性失活就會增加。由于結(jié)構和性質(zhì)的差異，不同酶的最適溫度可以不同。從實際工作方便來考慮，常規(guī)實驗室越來越多的使用37。因為溫度越高，反應速度越快，靈敏度越高，延滯時間和測定時間都可能縮短，有利于提高工作效率。全自動生化分析儀，有高效率的恒溫系統(tǒng)，使反應系統(tǒng)很快升溫并維持在37，可避免溫度差異引起的誤差。在比較不同實驗室測定結(jié)果時，要注意溫度不同帶來的差異。 (四)輔酶、輔基和激活劑 結(jié)合酶是由酶蛋白和輔助因子組成的。根據(jù)酶催化反應最適條件的要求，原則上在酶測定體系中應加入一定量的輔酶、輔基和金屬離子激活劑等輔助因子。脫輔基酶蛋白與輔基孵育一段時間后，酶活性才會恢復，因此，往往需要樣本與試劑中的輔基先預孵育。輔酶盡管不同于酶的底物，但在作用方式上和底物類似，在酶促反應過程中與酶結(jié)合、分離及反復循環(huán)。輔酶用量的確定按底物處理。激活劑的化學本質(zhì)是金屬離子，可以是酶的活性中心，也可以通過其他機制激活酶的活性。金屬離子之間往往存在相互拮抗或相互抑制，選用時要特別注意。 (五)抑制劑 酶活性測定過程中的抑制劑種類很多，有產(chǎn)物、底物、分析器材或試劑中的重金屬及體液中的藥物等。抑制類型可以是可逆性抑制，也可以是不可逆性抑制。按最適條件的要求，不管哪種抑制劑，都要盡量去除。采取的措施包括：選用高純度的實驗原料和實驗用水，在反應液中加入金屬螯合劑，必要時可以引入一個副反應來去除產(chǎn)物的抑制作用等。 (六)酶偶聯(lián)法中的輔助酶和指示酶 1指示酶和輔助酶的種類指示酶和輔助酶選擇的依據(jù)是：特異性要高，尤其是指示酶，應盡量減少副反應的發(fā)生，提高檢測準確度，如果存在副反應，則使測定酶的結(jié)果偏高；輔助酶的數(shù)量盡量少，減少輔助酶就可以縮短延滯期；酶偶聯(lián)反應要合理，如能直接與指示酶偶聯(lián)，就沒有必要加入輔助酶；盡量選用Km小的指示酶或輔助酶，以縮短延滯期；最適條件盡量與測定酶接近；其他因素，包括穩(wěn)定性、純度、價格和來源等。2指示酶與輔助酶的濃度確定 輔助酶或指示酶用量不足的后果是延滯期增長，待測酶的可測范圍變窄，嚴重時不出現(xiàn)線性期。輔助酶或指示酶用量過大，成本增加，雜酶的干擾程度增加。所以在酶偶聯(lián)測定法中，選用適當量的工具酶是一個重要的問題?？捎貌煌康墓ぞ呙阜磸驮囼?，直到偶聯(lián)酶反應中指示酶反應速度不隨工具酶的增加而升高，延滯期合適，有足夠的線性期，待測酶上限符合臨床要求，酶濃度曲線的線性關系好等。 四、影響酶活性測定的方法因素除了酶促反應體系和反應條件以外，方法因素與檢測系統(tǒng)對酶活性濃度的測定也有重要影響。 (一)基本方法因素 1方法類型的選擇 盡量選用連續(xù)監(jiān)測法。因為該方法選擇線性期的反應速度來計算酶活性，測定結(jié)果更可靠，一般不需做樣本空白，干擾相對較小，是首選的方法。但連續(xù)監(jiān)測法對儀器要求相對較高，在不具備自動生化分析儀的基層單位，某些酶采用定時法測定也可以得到比較準確的結(jié)果。如ALP的測定，按照IFCC推薦的方法，以4-硝基磷酸酚鈉鹽(PNPP-Na2)為底物，以2一甲基一2一氨基一1一丙醇(AMP)做緩沖液，該反應的延滯期短，小于1分鐘；線性期長，400U的樣本，線性期可達1 5分鐘；產(chǎn)物對硝基酚有標準品供應；終止液NaOH對產(chǎn)物的摩爾消光系數(shù)沒有影響，因此，采用定時法能得到與連續(xù)監(jiān)測法相近的準確性。 2正向反應與逆向反應 酶促反應大多是可逆反應，一般根據(jù)測定底物或產(chǎn)物的難易程度來選擇正向反應還是逆向反應。原則上選擇對底物親和力大，酶轉(zhuǎn)換率高的方向；還應考慮內(nèi)源性干擾、底物價格和穩(wěn)定性等諸多因素。肌酸激酶(CK)催化的逆向反應速度是正向反應速度的6倍，而且不受ATP酶、ALP、內(nèi)源性丙酮酸等干擾，所以，目前普遍采用逆向反應。但是，乳酸脫氫酶(LDH)的測定是選擇正向或逆向反應，目前尚有爭議。國內(nèi)多采用正向反應(乳酸丙酮酸，LP方向)，與IFCC在2001年發(fā)表的操作手冊一致。理由是LDH常被組合在心肌酶譜中，正向反應有利于LDH1的活性測定，有更高的診斷敏感性，試劑穩(wěn)定性好。而以前國外常用方法卻是逆向反應(丙酮酸乳酸，PL方向)，理由是反應速度是正向的3倍，而且試劑成本低。 3檢測底物或檢測產(chǎn)物 選擇測定底物或產(chǎn)物的方法主要取決于哪個更方便。原則上應選擇測定產(chǎn)物的生成量而不是底物的消耗量。為了讓全部的酶能夠與底物結(jié)合，底物量往往很高，而且酶促反應測定的是初速度，時間較短。若測定底物的消耗量(起始底物濃度剩余底物濃度)，一方面要求起始底物濃度不能太高，另外在很短的時間內(nèi)，底物的消耗并不明顯，測定誤差大。而測定產(chǎn)物是因為產(chǎn)物從無到多，檢測敏感度必然增加。這也是淀粉酶的碘淀粉比色法逐漸被色素原底物所取代的原因之一。目前在眾多酶活性測定中，除了把測定NADH減少可以看成是測底物的消耗量外，采用測定底物消耗量的項目己很少。 若有兩個以上產(chǎn)物，選擇測定哪個產(chǎn)物，也要從測定的方便性、內(nèi)源性干擾等方面綜合考慮。例如ALT催化的反應既可以測定谷氨酸的生成速度，也可以測定丙酮酸的生成速度，IFCC推薦法是測定后者。 4底物啟動模式與樣本啟動模式底物啟動模式是指樣本先與部分試劑(缺乏某個底物)預孵育一定時間，然后加入這個底物，樣本中的待測酶的酶促反應才開始啟動。這樣做的好處是在待測酶酶促反應開始之前，可以除去某些干擾物，包括內(nèi)源性干擾物和外源性干擾物。IFCC推薦法多采用底物啟動模式，但需要雙試劑劑型。而樣本啟動模式是將反應所需的試劑先混合在一起，然后加入樣本，依靠樣本中的待測酶來啟動酶促反應。該模式只是在延滯期去除部分干擾物，但可采用單一試劑劑型。需要注意的是某些雙試劑劑型是基于試劑穩(wěn)定性考慮，并沒有將底物單獨作為第二試劑，因此起不到消除內(nèi)源性干擾的作用。 5副反應問題 NAD(P)H的光吸收特性是目前使用最多的指示反應。但是，體內(nèi)存在數(shù)以百計的氧化還原酶，它們的輔酶很多是一致的。若存在內(nèi)源性代謝物，必然會相互干擾。解決副反應的干擾，一直是人們努力的方向。通過加入副反應抑制劑、樣本進行預處理等都是切實可行的手段。 6延滯期與線性期的確定 延滯期可因酶在樣本中所存在的介質(zhì)不同而有差別，原因可能是存在內(nèi)源性干擾物，也可能存在一些抑制劑。延滯期的確定原則是多觀察幾例濃度不等、病理情況不同的標本，選擇延滯期最長者作為確定值。線性期的確定離不開酶濃度的可測上限，因為酶濃度越高，在同樣時間內(nèi)消耗底物越多，產(chǎn)生產(chǎn)物越多，底物的不足和產(chǎn)物的抑制將導致非線性期的提前到來。 從以上分析中不難看出，基本方法因素也可影響酶活性測定的準確性，有些因素是通過影響酶促反應最適條件來起作用；各因素之間也有相互影響相互制約；而且沒有絕對的最適條件，但只要按照最適條件的目標，在建立方法時，努力接近最適條件，最大限度地縮小方法之間、試劑之間的差別。 (二)檢測系統(tǒng)對測定結(jié)果的影響 檢測系統(tǒng)對測定結(jié)果的影響主要有以下幾點： 1.儀器 不同的儀器，波長的設置有區(qū)別，帶寬有區(qū)別，比色杯的透光性在使用過程中也會發(fā)生改變，這些都直接影響儀器對待測物的光吸光，也就影響K值的準確性。因此，要定期檢查儀器的摩爾吸光系數(shù)，校正K值。 2校準品 可作為酶活性測定用的校準品分兩類。一類是產(chǎn)物的基準物質(zhì)，如對硝基酚、對硝基苯胺等，可用于校準儀器的摩爾吸光系數(shù)。產(chǎn)物NAD(P)H在所用儀器中的摩爾吸光系數(shù)可通過己糖激酶法測定葡萄糖來獲得。另一類稱酶校準品，多是用人血清或動物血清作介質(zhì)，與測定標本比較接近，應盡量采用。 3實驗參數(shù) 實驗參數(shù)的正確理解和編制對測定結(jié)果也有很大影響。樣本量、試劑量、延滯期、測定時間、K值等都是很關鍵的參數(shù)。對于采用色素原底物的方法，由于底物的自身水解作用，應采用減試劑空白變化速率的方法；對于輔助酶或指示酶中雜酶引起的干擾，也應采用減試劑空白變化速率的方法；對于內(nèi)源性干擾的反應，不同的儀器應分別對待，不能盲目采用減空白的速率法，要選擇是采用試劑空白還是樣本空白。 4樣本與試劑比例 樣本量與反應液總量的比例與檢測靈敏度和檢測上限有關，與測定誤差也有關。根據(jù)酶活性計算公式不難看出，改變樣本與反應液總量的比例就可以改變K值。按儀器噪聲相當于吸光度OOO1計算，K值不宜過大，否則會造成檢測誤差加大。值得注意的是酶活性的發(fā)揮與介質(zhì)有關，經(jīng)常發(fā)現(xiàn)改變樣本與反應液總量的比例，測定結(jié)果并不會成正比例地改變，可能與激活劑、抑制劑、酶的解聚和聚合、酶的穩(wěn)定性等因素有關。因此，樣本與反應液總量的比例一旦選定，就不能隨意更改。五、酶的質(zhì)量測定 酶濃度嚴格來說是指酶分子的質(zhì)量濃度，常用酶蛋白濃度來表示。人體體液中大多數(shù)酶的含量在gL水平，甚至更低，因此測定的難度較大。近年來，隨著免疫學技術的發(fā)展，利用酶的抗原性，建立了一些直接測定酶蛋白質(zhì)量的免疫化學方法。 (一)酶質(zhì)量免疫化學測定法的原理 利用酶蛋白的抗原性，制備特異性抗體，然后用免疫學方法測定酶蛋白質(zhì)量濃度，單位多以ngm1、gL來表示。用于酶蛋白濃度測定的免疫化學法有免疫抑制法、免疫沉淀法、放射免疫法(RIA)、化學發(fā)光免疫分析法(CLIA)、酶免疫法(EIA)、熒光酶免疫法(FEIA)等。其中，前兩種方法也可用于酶活性濃度測定，例如用免疫抑制法測定CK-MB的活性，用免疫沉淀(單向擴散)法測定超氧化物歧化酶(SOD)活性等。 RIA是將放射性核素標記的酶分子與相應抗體作用產(chǎn)生沉淀，然后將沉淀分離并進行定量測定，如胰蛋白酶和彈性蛋白酶的質(zhì)量測定就是用放射免疫法。此外，還可以用CLIA測定CK-MB的質(zhì)量濃度，用酶聯(lián)免疫分析(ELISA)測定神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)的活性。 (二)酶質(zhì)量免疫化學測定法的評價 與傳統(tǒng)的酶活性測定法相比，免疫化學測定法的優(yōu)點主要有：靈敏度高，能測定樣本中用原有其他方法不易測出的少量或痕量酶；特異性高，幾乎不受體液中其他物質(zhì)，如酶抑制劑、激活劑等的影響；能用于一些不表現(xiàn)酶活性的酶蛋白，如各種酶原或去輔基酶蛋白，或因遺傳變異而導致合成無活性的酶蛋白的酶測定；特別適用于同工酶的測定。 酶的免疫化學測定也有其局限性，主要表現(xiàn)在：要制備足夠量的提純酶作為抗原和具有免疫化學性質(zhì)的抗血清常常是很困難的，且工作量較大；測定步驟多，操作煩瑣；測定成本高。第三節(jié)代謝物的酶法分析 酶法分析(enzymatic method)是利用酶的作用特性，以酶作為分析工具或分析試劑的主要成分進行反應體系中底物、輔酶、抑制劑和激活劑等成分含量測定的方法。隨著蛋白質(zhì)純化技術的發(fā)展和自動生化分析儀的普遍應用，許多臨床生化檢驗項目都利用工具酶建立了酶學分析方法。 酶法分析具有以下的優(yōu)點：酶作用的特異性高，成分復雜的血清或其他體液樣本往往不需要預處理就能測定，使實驗程序得以簡化；試劑酶的本質(zhì)大多是蛋白質(zhì)，無毒性，避免了化學品對環(huán)境的污染；酶促反應的條件溫和，商品化的試劑盒可用于自動化分析。因此，這一技術在臨床生物化學檢驗中得到了廣泛應用。一、酶法分析的理論基礎 由于酶作用的特異性，成分復雜的血清或其他體液樣本往往不需要進行預處理，通過溫和適宜的酶促反應條件，簡單的實驗程序，即可對各種代謝物濃度進行定量分析。許多工具酶已應用于多種代謝物檢測試劑盒的制備及臨床標本的自動化分析之中。 (一)工具酶 工具酶(reagent enzymes)是酶學分析中作為試劑用于測定其他化合物濃度或酶活性濃度的酶。在利用工具酶的反應中，一般將工具酶及其輔助底物設定為過量，而將待測化合物或待測酶設定為限速因素。工具酶純度要求不高，從而降低了其作為試劑的成本，但對抑制劑、雜酶等的含量要有一定的限制，以保證工具酶有一定的比活性，避免或減少一些干擾測定的因素。 許多臨床生化檢驗項目，如葡萄糖、膽固醇、甘油、尿酸、丙酮酸等的測定均使用了工具酶。按照基本原理的不同，代謝物濃度的酶法測定通常分為平衡法和速率法兩大類。 (二)平衡法的理論基礎 平衡法，也叫終點法(end-point method)，指在代謝物酶促反應中，隨著時間的延長，待測物濃度逐漸減少而產(chǎn)物逐漸增多，一定時間后反應趨于平衡，指示反應信號逐漸達到穩(wěn)定，測定反應達到平衡后底物或產(chǎn)物變化的總量，計算出待測物濃度。由于該法的酶促反應并沒有終止，而是達到了一個平衡狀態(tài)，所以稱平衡法更為合理。 根據(jù)酶促反應動力學原理，達到平衡所需的時間與Vmax、Km和待測物濃度S0有關，Vmax越大、Km越小、S0越小則達到平衡所需的時間就越短。 如同時檢測標準管，則不管反應進行至何種程度，只要標準管與測定管的反應時間(t)一致，它們的底物消耗量或產(chǎn)物生成量都成比例變化，與產(chǎn)物的吸光度(As和Au)成正比。據(jù)此可以計算出待測物濃度。但只有當S0-St S0，即反應基本達到平衡時，Au和As基本穩(wěn)定不變，此時的測定誤差最小。若測定管與標準管的反應明顯存在基質(zhì)效應，兩者反應程度不一，就會存在誤差。 采用平衡法應該注意：工具酶的特異性要高；工具酶中的雜酶應低于允許限；酶的用量要足夠大，以保證反應能在較短時間內(nèi)(一般為13分鐘)達到平衡；在保證測定線性的前提下，Km要盡量?。凰玫牡孜飳γ笐獦嫵闪慵壏磻?；試劑中的添加劑不應抑制酶的活性。 (三)速率法的理論基礎 速率法(rate assay)又稱動力學法，是根據(jù)酶促反應動力學，準確測定反應的初速度(V)，采用標準濃度對照法求得待測物的濃度的方法。根據(jù)米氏方程 ，當SKm時，則S+KmKm；若體系中酶量不變，酶促反應的最大速度Vmax也不變，此時，酶促反應呈一級反應： 上式表明，當反應體系中酶量固定、底物濃度相對于酶的催化能力很小時，反應速度(單位時間內(nèi)的底物減少或產(chǎn)物增加量)與初始底物濃度呈正相關，如同時檢測測定管和標準管反應速度，即可計算出待測物濃度。 在酶促反應進程中，S越來越小，v也越來越小。說明要使酶促反應速度與待測物濃度成正比例，必須做到測定速度是初速度，越偏離初速度，測定誤差就越大。實際上，準確地測定酶促反應的初速度非常困難，在臨床酶法分析中只要在此期間待測物消耗Km，此時酶促反應動力學可按單底物法處理，整個反應只與待測物濃度有關，表現(xiàn)為一級反應動力學。但在以NADH或NADPH為底物的終點法測定中，因340nm吸光度的限制，輔酶的用量不可能過高.由于該類反應是通過輔酶在氧化型與還原型之間轉(zhuǎn)換進行，所以很容易用分光光度法測定340nm處吸光度的增減來進行定量，如丙酮酸和乳酸的測定就是這樣。 (二)酶偶聯(lián)法 與酶活性濃度測定相似，酶促反應的底物或產(chǎn)物如果沒有可直接檢測的特性，需將反應生成的某一產(chǎn)物偶聯(lián)到另一個酶促反應中，從而達到檢測目的，這種方法稱酶偶聯(lián)法(enzyme couNing method)。在酶偶聯(lián)法中，一般把偶聯(lián)的反應稱為輔助反應(auxi_1iary reaction)，所用試劑酶叫輔助酶(auxi_1iary enzymes)，把指示終點的反應稱為指示反應(indicator reaction)，指示反應所用的試劑酶叫指示酶(indicator enzyme)。 偶聯(lián)反應需設計為非限速反應，即偶聯(lián)反應中所用的酶、輔酶等底物用量應過量。在指示酶用量固定后，反應速度應與第一步反應速度有關，因此輔助反應應設定為一級反應。如果輔助反應為雙底物，在實驗設計時也應將試劑中加入的另一種底物濃度設計得足夠大，讓整個反應只受待測物濃度的影響。 在臨床生物化學檢驗中，最常用的酶偶聯(lián)指示系統(tǒng)有兩個，即脫氫酶指示系統(tǒng)和過氧化物酶指示系統(tǒng)。 1.脫氫酶指示系統(tǒng) 該指示系統(tǒng)通過測定氧化型輔酶(NAD+或NADP+)在340nm處吸光度的增加來計算待測物的濃度。如己糖激酶法測定血清葡萄糖、尿素酶法測定血清尿素就是利用該指示系統(tǒng)。也可利用脫氫酶的逆反應，將還原型NAD(P)H變?yōu)檠趸蚇AD(P)+，測定340nm處吸光度的下降來計算待測物的濃度。選擇NAD+還是NADP+應根據(jù)試劑酶的特性來決定，有的酶要求NAD+，有的酶要求NADP+，有的酶則兩者均可。2.過氧化物酶指示系統(tǒng) 該指示反應最早是由Trinder等人提出，其原理是代謝物在酶催化反應中如能夠生成H202，則過氧化物酶(peroxidase，POD)就可催化H202與4-氨基安替比林(4-AAP)和酚一起形成紅色的醌類化合物，該化合物最大吸收峰為500nm，該反應被稱為Trinder反應(Trinder reactinn).除了酚之外，其他的生色基團也會發(fā)生類似的反應見表4-3。 POD指示系統(tǒng)已廣泛用于葡萄糖、膽固醇、尿酸、肌酐、甘油三酯等多個生物化學項目的測定。 (三)酶循環(huán)法 酶循環(huán)法(enzymatic cycling assay)是利用底物和輔酶的循環(huán)反應，使酶促反應產(chǎn)物不斷擴增以利于測定的方法。該法使反應產(chǎn)物增加，減少了共存物質(zhì)的干擾，提高了檢測靈敏度和特異性，是酶法分析的發(fā)展和延伸。 根據(jù)試劑酶的結(jié)合方式和輔酶的用法，將酶循環(huán)法分為底物循環(huán)法和輔酶循環(huán)法。根據(jù)試劑酶的催化性質(zhì)又將其分成氧化酶脫氫酶反應法和脫氫酶輔酶反應法等。 1產(chǎn)物循環(huán)一氧化酶一脫氫酶系統(tǒng) 該系統(tǒng)中氧化酶用于靶物質(zhì)的氧化，脫氫酶使其回到還原狀態(tài)，促使靶物質(zhì)(或其衍生物)或靶物質(zhì)的氧化產(chǎn)物作為底物循環(huán)。例如甘油濃度測定時，甘油在甘油激酶催化下活化生成3一磷酸甘油后，被甘油磷酸氧化酶氧化為磷酸二羥丙酮，磷酸二羥丙酮又被3-磷酸甘油脫氫酶還原為3-磷酸甘油，這樣就形成了一個循環(huán)，同時伴有NADH向NAD+的轉(zhuǎn)化。在反復循環(huán)中3磷酸甘油和磷酸二羥丙酮的量不變，而產(chǎn)物H202隨每次循環(huán)不斷遞增，NADH不斷遞減，使檢測信號不斷增強(圖43)。 2脫氫酶一輔酶循環(huán)系統(tǒng) 該系統(tǒng)中靶物質(zhì)(或衍生物)及其氧化產(chǎn)物作為底物進入循環(huán)，反應中用一種脫氫酶和兩種不同性質(zhì)的輔酶，即硫代氧化型輔酶I(Thio-NAD+)和還原型輔酶I(NADH)，在395415nm波長下測定反應中氧化型Thio-NAD+轉(zhuǎn)為還原型Thio-NADH的速度。例如，血清膽汁酸測定時，3a-羥類固醇脫氫酶(3a-HSD)催化膽汁酸和3-酮類固醇之間的反應，正反應對輔酶硫代氧化型輔酶I的親和力遠遠大于輔酶I，而逆反應對還原型輔酶I的親和力大于硫代還原型輔酶I，在反應系統(tǒng)中有足夠的硫代氧化型輔酶I和還原型輔酶I，只要有少量的膽汁酸就可生成少量的3一酮類固醇，并在兩者之間構成循環(huán)，不斷產(chǎn)生硫代還原型輔酶I(黃色)，按要求控制好條件，反應速度與待測物膽汁酸成正比(圖4-4)。膽汁酸在體內(nèi)的濃度只有微摩爾的水平，用此循環(huán)反應，靈敏度可增加數(shù)十倍。 該循環(huán)反應要求以下條件：酶對Thio-NAD+和NADH應有高度親和力；Thio-NAD+和NADH二者的濃度配比達最適條件；溶液pH和緩沖體系同時有利于雙向反應(底物氧化和還原)。脫氫酶一輔酶循環(huán)系統(tǒng)還可應用于肉毒堿、同型半胱氨酸、高密度脂蛋白膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇等的測定 (四)酶激活與抑制測定法 酶的催化活性可被某種物質(zhì)激活，也可被一些物質(zhì)抑制。利用這一特性可測定多種生化物質(zhì)。 1酶激活測定法 通過特定的機制使酶由無活性變?yōu)橛谢钚曰蚴姑富钚栽鰪姷奈镔|(zhì)稱為酶的激活劑(activator enzyme)。許多酶只有在激活劑的存在下才具有催化活性。如果將酶中關鍵的激活劑去除，就會失去催化活性。測定時無活性的酶與標本混合后，標本中的金屬離子、微量元素或輔酶使該酶重新激活，恢復催化活性的程度可以反映這些物質(zhì)的含量。 例如，用EDTA和乙二醇二乙醚二胺四乙酸(EGTA)兩種金屬離子螯合劑在適宜濃度下抑制Ca2+，標本中Mg2+通過恢復異檸檬酸脫氫酶(ICD)的活性，使NADP+還原增多，在340nm下吸光度增加，據(jù)此測定Mg2+濃度。Zn2+能激活堿性磷酸酶(ALP)水解4-硝基酚磷酸生成4-硝基酚，通過檢測405nm吸光度的上升速率，測定樣本中Zn2+的含量。此外，色氨酸酶法和