剛果紅染色法1.doc

剛果紅染色法： 常用的剛果紅染色法有兩種，一種是先培養(yǎng)微生物，再加入剛果紅進行顏色反應，另一種是在倒平板時就加入剛果紅。 方法一 在長出茵落的培養(yǎng)基上，覆蓋質量濃度為1 mgmI。的CR溶液，1015 min后，倒去CR溶液，加入物質的量濃度為l molI。的NaCI溶液，15 min后倒掉NaCl溶液，此時，產(chǎn)生纖維素酶的茵落周圍將會出現(xiàn)透明圈。 方法二 配制質量濃度為10 mgmI。的CR溶液，滅菌后，按照每200 mI。培養(yǎng)基加入1 mI。的比例加入CR溶液，混勻后倒平板。等培養(yǎng)基上長出茵落后，產(chǎn)生纖維素酶的菌落周圍將會出現(xiàn)明顯的透明圈。兩種剛果紅染色法的比較 剛果紅在篩選纖維素分解菌上的應用已經(jīng)有超過20年的歷史，課本中給出了兩種方法。方法一是傳統(tǒng)的方法，缺點是操作繁瑣，加入剛果紅溶液會使菌落之間發(fā)生混雜；其優(yōu)點是這樣顯示出的顏色反應基本上是纖維素分解菌的作用。方法二的優(yōu)點是操作簡便，不存在菌落混雜問題，缺點是由于在纖維素粉和瓊脂、土豆汁中都含有淀粉類物質，可以使能夠產(chǎn)生淀粉酶的微生物出現(xiàn)假陽性反應。但這種只產(chǎn)生淀粉酶的微生物產(chǎn)生的透明圈較為模糊，因為培養(yǎng)基中纖維素占主要地位，因此可以與纖維素酶產(chǎn)生的透明圈相區(qū)分。方法二的另一缺點是：有些微生物具有降解色素的能力，它們在長時間培養(yǎng)過程中會降解剛果紅而形成明顯的透明圈，與纖維素分解菌不易區(qū)分。維素酶（CMC）活性檢驗方法1 原理 纖維素酶在一定的溫度和pH條件下，水解羧甲基纖維素鈉釋放出還原性糖（以葡萄糖計）。在堿性、煮沸條件下，能與3，5二硝基水楊酸起顯色反應，其顏色的深淺與還原糖的含量成正比。在550nm下測定其吸光度，可以計算出還原糖的量，從而得出纖維素酶的活力。2 活性單位 1g固體酶粉（1 ml液體酶）在500.5 PH5.0條件下，每分鐘水解底物產(chǎn)生1g葡萄糖所需酶液的量定義為一個CMC酶活性單位。3 儀器與設備3.1 分光光度計（應符合GB9721的有關規(guī)定）3.2 恒溫水浴鍋3.3 電熱鼓風干燥箱3.4 分析天平（感量0.1mg）3.5 電冰箱3.6 酸度計（精度0.01pH）3.7 定時鐘或秒表4 試劑和溶液（若未特別說明均為分析純：所用水為蒸餾水或去離子水）4.1 醋酸醋酸鈉緩沖液（PH=5.0） 甲液：量去冰醋酸6ml，用水定容至1000ml，配成0.1M醋酸溶液。 乙液：稱去8.2g醋酸鈉，用水定容至1000ml，配成0.1M醋酸鈉溶液。 應用液：取甲液三份，乙液七份混合，用PH計矯正至PH為5.00.05低溫冷藏備用。4.2 3，5二硝基水楊酸試劑（DNS） 甲液：取酒石酸鈉182g，溶于500 ml水中，再稱取重蒸苯酚5 g、無水亞硫酸鈉5 g溶于其中。 乙液：取氫氧化鈉20.8 g溶于260 ml水中，再加入3，5二硝基水楊酸6 g。 將甲液和乙液倒入棕色試劑瓶混合，再加入240 ml水暗處放一周后使用。4.3 1%（W/V）羧甲基纖維素鈉溶液 準確稱取1.0000g羧甲基纖維素鈉溶于100 ml PH=5.0醋酸醋酸鈉緩沖液中配制成1%羧甲基纖維素鈉溶液。4.4 1%（W/V）葡萄糖標準儲備液 葡萄糖在802烘箱中烘至恒重，準確稱取1.0000g溶解并定溶于100ml容量瓶中，置于4冰箱內備用，備用期為三天，必要時加疊氮化鈉防腐。4.4.1 葡萄糖標準應用液 分別吸取葡萄糖標準儲備液，0.00、2.00、4.00、6.00、8.00、10.00ml于50ml容量瓶中，用水定溶于刻度。5 分析步驟5.1 標準曲線的制作 按表 1規(guī)定的量，分別吸取葡萄糖標準應用液、緩沖液和DNS試劑于各管中搖勻，將各管同時置于沸水浴中反應10分鐘，取出后用冷水冷卻至室溫后，定溶于內直徑為15mm的15ml刻度試管中搖勻，再用1cm比色杯，在分光光度計550nm波長處測吸光度，以葡萄糖的量為橫坐標，以吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，三次重復實驗的均值獲得線性回歸方程，線性回歸系數(shù)（r）應在0.9996以上方可使用（否則重新操作）。每次新配DNS試劑、更換分光光度計或更換分光光度計部件，都應重做標準曲線。1 葡萄糖標準曲線管號葡萄糖標準應用液醋酸醋酸鈉緩沖液（ml）DNS試劑（ml）濃度（mg/ml）吸取量（ml）000.501.52.010.40.501.52.020.80.501.52.031.20.501.52.041.60.501.52.052.00.501.52.05.2 樣品的測定5.2.1 待測酶液的置備 稱取2g固體酶粉，精確至0.1mg（或用2ml移液管，準確移取2ml液體酶樣）用水溶解，準確稀釋定溶，（使試樣液與空白液的吸光度之差在0.30.6范圍內）待測。5.2.2 操作步驟 取4支內直徑15mm的15ml的刻度試管，分別加入稀釋酶液0.5ml，取其中3支作為測定管，分別加入1.5ml p H 5.0的1%CMC溶液，另一支作為空白管加入2mlDNS溶液，共同在500.5水浴30分鐘，三支測定管分別加入2mlDNS溶液，空白管加入1.5ml p H 5.0的1%CMC溶液，在沸水浴中反應10分鐘，冷卻后定溶至15ml，以空白管調零，在分光光度計550nm處測吸光度。5.2.3 酶活的計算： 酶活= An10000.530式中： A 根據(jù)吸光度在標準曲線上，查得的還原糖的量（mg） n 酶液的稀釋倍數(shù)