蝦類黑變機(jī)理.ppt

蝦類黑變機(jī)理 多酚氧化酶 一 引言1多酚氧化酶的性質(zhì)2酶促褐變的生理作用二 酚氧化酶的生物化學(xué)和分子生物學(xué)性質(zhì)三 褐變控制1物理處理2抑制劑 食品的外觀 風(fēng)味 質(zhì)地和營養(yǎng)價(jià)值是消費(fèi)者選擇食品時(shí)的四個(gè)因素 重要的是顏色 也是消費(fèi)者評(píng)價(jià)食品質(zhì)量的首要因素之一 通過酶促反應(yīng)或非酶促反應(yīng)形成的顏色 影響著許多水果 蔬菜和海洋食品 尤其是甲殼類食品的最重要的顏色反應(yīng)之一酶促褐變反應(yīng) 是多酚氧化酶引起的 這種酶曾經(jīng)被稱為酚氧化酶 酚酶 一元酚和二元酚氧化酶和酪氨酸酶 1問題1 1黑變病酚氧化酶能導(dǎo)致甲殼類 如龍蝦和蟹變黑 被稱為黑變病 1 2多酚氧化酶的性質(zhì)多酚氧化酶能催化兩種基本的反應(yīng) 用苯酚和氧氣作底物 該反應(yīng)能在與羥基相連的位置催化羥基化反應(yīng) 第二步反應(yīng)是二元酚被氧化為鄰位苯醌 苯醌常通過非酶反應(yīng)機(jī)理進(jìn)一步氧化成黑色素 褐色產(chǎn)物 1 2O2 O2 2H2O 一元酚氧化酶一元酚氧化酶催化一元酚羥基化成為二元酚 種酶被稱為酪氨酸酶 因?yàn)長 酪氨酸是主要的一元酚底物 二元酚氧化酶第二步反應(yīng)即二元酚被氧化成醌 被稱為二元酚氧化酶活力或兒茶酚氧化酶活力 進(jìn)一步反應(yīng)是兒茶酚被氧化成為鄰位 苯醌 蟲漆酶蟲漆酶 對(duì) 二元酚氧化酶 E C 1 10 3 2 DPO 是另外一種類型的含銅的多元酚氧化酶 對(duì)于其酚底物具有明顯的非特異性 底物被蟲漆酶氧化是由于單一電子反應(yīng)生成自由基 氧氣被還原成水的同時(shí)酚類底物也被氧化 1 2酶促褐變的生理作用 抗病能力被認(rèn)為是多酚氧化酶在動(dòng)物體內(nèi)的功能之一 主要存在于昆蟲和甲殼類動(dòng)物中 該酶在動(dòng)物體內(nèi)常以酶原或多酚氧化酶前體形式存在 它對(duì)甲殼類動(dòng)物中的骨化過程起到重要的作用 黑色素和部分聚合酚醛塑料具有抗微生物的性質(zhì) 據(jù)說特殊的微生物能誘導(dǎo)產(chǎn)生能激活多酚氧化酶的蛋白酶 微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物例如 葡聚糖 糖蛋白 脂多糖 海帶多糖和其它一些產(chǎn)物也能誘導(dǎo)產(chǎn)生能激活多酚氧化酶的蛋白酶 2 酚氧化酶的生物化學(xué)和分子生物學(xué)性質(zhì) PPOs是含銅的蛋白質(zhì) 在所有PPO順序中最顯著的特征是兩個(gè)銅結(jié)合位點(diǎn) 被稱為CuA和CuB PPO的活性位點(diǎn)由兩個(gè)銅離子構(gòu)成 每個(gè)銅離子與三個(gè)保守的組氨酸殘基結(jié)合 這一對(duì)銅離子是PPO與氧氣和酚類底物相互作用的位點(diǎn) 在甲殼類中 PPO體系以無活性的酚氧化酶原 proPO 形式存在于血淋巴中 因此 PPO來源于血藍(lán)蛋白 血藍(lán)蛋白是在甲殼類血淋巴的血漿中發(fā)現(xiàn)的氧氣運(yùn)輸?shù)鞍?血藍(lán)蛋白和PPOs存在由兩個(gè)銅離子直接與蛋白質(zhì)結(jié)合而形成的氧結(jié)合位點(diǎn) 但是 血藍(lán)蛋白不起催化作用 純的proPO的分子量為76kDa 它是一種等電點(diǎn)在5 4左右的糖蛋白PPO活性的最適pH值在pH6 0和pH8 0之間 溫度對(duì)甲殼類PPO的穩(wěn)定性影響表明這些酶在20 50 范圍內(nèi)具有相似的穩(wěn)定性 PPOs的穩(wěn)定性是非常不同的 它依賴于許多因素 如溫度 pH 底物濃度 離子強(qiáng)度 緩沖體系等 3 褐變控制 多酚氧化酶 PPO 催化酚氧化生成鄰位 醌 鄰位 醌是活性很強(qiáng)的化合物 它們自發(fā)聚合形成高分子量化合物或黑色素 或與氨基酸和蛋白質(zhì)反應(yīng)而加深顏色 阻止酶促褐變可以通過多種途徑來實(shí)現(xiàn) 方法論上是除去一種或多種反應(yīng)必需的成分 氧氣 酶 銅或底物 3 1物理處理加熱冷藏冷凍干燥輻射高壓和超臨界CO2 3 2抑制劑 褐變抑制劑在食品加工中的應(yīng)用受毒性 對(duì)味道 風(fēng)味 質(zhì)地和價(jià)值的影響因素的制約 用于防止酶促褐變的抑制劑有5類 1 還原劑 2 螯合劑 3 酸化劑 4 酶抑制劑 5 絡(luò)合劑 3 2 1還原劑 抗氧化劑 亞硫酸鹽試劑硫酸鹽是PPO的一種競爭性抑制劑 能使PPO活性位點(diǎn)的巰基結(jié)合 L 抗壞血酸抗壞血酸抑制的機(jī)理基本上被歸結(jié)為還原 酶促形成鄰位 醌成原來的二元酚 從而阻止色素的形成 異抗壞血酸異抗壞血酸和它的鹽異抗壞血酸鈉都是很強(qiáng)的還原劑 它們是氧惰性劑 因此能抵抗還原分子中的氧 酚類抗氧化劑抗氧化劑通過抑制生成自由基的氧化反應(yīng)過程 螯合金屬和惰性單線態(tài)氧來延緩酸敗或變色 從而保藏食品 半胱氨酸半胱氨酸能抑制黑變病被推測是形成了無色的硫醇 鄰位 醌 它甚至直接與PPO上的銅生成穩(wěn)定的復(fù)合物而抑制酶活 3 2 2酸化劑 酸化劑的作用是將pH控制在PPO最佳催化活性所要求的pH之下 酸化劑如 檸檬酸 蘋果酸 磷酸能將pH降到3以下 在這個(gè)pH下PPO是無活性的 酸化劑經(jīng)常與其他抗褐變劑結(jié)合使用 檸檬酸和抗壞血酸一種是食品工業(yè)中使用的最廣泛的酸之一 3 2 3 螯合劑 在它們的活性位點(diǎn)有金屬離子 因此通過螯合劑除去它們的金屬離子將使酶失去活性 螯合劑通過它們能起到絡(luò)合或螯合的作用的分子結(jié)構(gòu)中的不共用電子對(duì)與強(qiáng)氧化劑如銅鐵離子絡(luò)合 由于PPO是含銅的金屬蛋白像輔基一樣 它將被金屬螯合劑抑制 在食品中應(yīng)用的最好的GRAS螯合劑是檸檬酸和乙二胺環(huán)己酸 EDTA EDTAEDTA與鐵 銅 鈣通過螯合反應(yīng)生成非常穩(wěn)定的絡(luò)合物 在羧基完全解離的高pH下 EDTA的螯合效果最好 在阻止酶促褐變中 EDTA通常與其他化合試劑合用 磷酸鹽多磷酸鹽 焦磷酸鈉 金屬磷酸鹽都是螯合劑 由于它們?cè)诶渌惺俏⑷艿?因而用在食品中作為抗褐變?cè)噭r(shí)的濃度為0 5 2 麥芽酚麥芽酚 3 羥基 2 甲基 4氫 吡喃 4 one 一種 吡喃酮的衍生物 麥芽酚不能直接抑制PPO 但它能通過與鄰位 醌的結(jié)合使其重新生成鄰位 二羥基醌或使PPO不可逆滅活來抑制褐變 曲酸曲酸 5 羥基 2 羥甲基 4H 吡喃 4 one 是一種 吡喃酮衍生物 是許多曲霉菌和青霉菌的代謝產(chǎn)物 酪氨酸酶被曲酸的抑制可能是由于它能和酶活性位點(diǎn)的銅結(jié)合 因?yàn)榍崾欠浅：玫倪^渡金屬如鐵 和銅 的螯合劑 3 2 4 絡(luò)合劑 甲殼胺甲殼胺來源于有殼的水生動(dòng)物 甲殼質(zhì)為 1 4 D 胺基葡萄糖的多聚體 甲殼胺無毒 生物可降解 有抗微生物作用 作用機(jī)理還不清楚 可能是帶正電荷的多聚體能吸收懸浮的PPO的底物或產(chǎn)物的原故 環(huán)狀糊精環(huán)狀糊精是一類由液化淀粉在葡聚糖轉(zhuǎn)移酶作用下經(jīng)環(huán)狀麥芽糊精而生成的環(huán)狀寡糖 CD抑制褐變的機(jī)理主要是它們能與PPO的底物結(jié)合 CD的中央空穴有較弱的非極性與PPOs酚類形成包含絡(luò)合物 因而能阻止醌的氧化和隨后的聚合 從而阻止黑色素的生成 3 2 5 酶抑制劑 4 已基間苯二酚被取代的間苯二酚 它們的結(jié)構(gòu)與酚類底物相關(guān) 被認(rèn)為是PPO的抑制劑 間苯二酚衍生物與酚類底物的結(jié)構(gòu)相類似 通過對(duì)PPO的競爭性抑制來阻止褐變反應(yīng) 4 已基間苯二酚 4 HR 能抑制酪氨酸的一元酚氧化酶和二元酚氧化酶活性 鹵化鹽無機(jī)鹵化鹽是很有名的PPO抑制劑 NaF是最強(qiáng)的PPO抑制劑 其他依次是NaCl NaBr 和NaI 蜂蜜蜂蜜可以抑制酶促褐變 蜂蜜對(duì)PPO起抑制作用的化合物是分子量為600的小肽 因?yàn)榈鞍踪|(zhì) 肽和氨基酸通過螯合PPO活性中心的Cu2 形成穩(wěn)定絡(luò)合物來抑制PPO的活性 這可能就是蜂蜜肽的抑制機(jī)理 氨基酸 肽和蛋白質(zhì)氨基酸 肽和蛋白質(zhì)通過直接抑制酶或通過與PPO催化產(chǎn)物醌反應(yīng)來抑制PPO催化的褐變 它們也能通過與催化各酚底物螯合PPO的活性位點(diǎn)的銅來抑制PPO活性 蛋白質(zhì) 肽和 氨基酸能和銅離子形成穩(wěn)定的絡(luò)合物 組氨酸和半胱氨酸對(duì)銅離子有特別高的親和力 因?yàn)榻M氨酸有咪唑環(huán) 半胱氨酸有巰基 二者都能連接金屬離子 芳香族羧酸苯甲酸和肉桂系列的芳香族羧酸是PPO的抑制劑 同時(shí)它們的結(jié)構(gòu)與底物的結(jié)構(gòu)相類似 肉桂酸和它的類似物 對(duì)位 對(duì)羥基桂皮酸 阿魏酸和芥子酸被發(fā)現(xiàn)是植物PPO的強(qiáng)烈抑制劑 對(duì)蝦黑變的新機(jī)理 我國海捕蝦產(chǎn)量 海水養(yǎng)殖蝦產(chǎn)量 南美白對(duì)蝦 P vannamei 南美白對(duì)蝦原分布在中 南美洲太平洋沿岸水域 外形似中國對(duì)蝦 正常體色為淺灰色 殼薄體肥 肉質(zhì)鮮嫩 出肉率高達(dá)65 以上 營養(yǎng)豐富 深受國內(nèi)外市場歡迎 生長速度快 養(yǎng)殖60天即可上市 為當(dāng)前世界上養(yǎng)殖最普遍的品種 我國南方沿?？梢责B(yǎng)兩茬 該蝦生長快 適應(yīng)性強(qiáng) 食性雜 巳可耐受較長時(shí)間的干露 故易干活運(yùn)銷 該蝦是對(duì)蝦中個(gè)體最大的一種 發(fā)現(xiàn)的最大個(gè)體長達(dá)33厘米 體重500 600克 斑節(jié)對(duì)蝦P monodon 日本對(duì)蝦Penaeusjaponicus 日本對(duì)蝦是日本最重要的對(duì)蝦養(yǎng)殖品種 在日本養(yǎng)到25克左右出售價(jià)格最高 鷹爪蝦 對(duì)蝦科 Trachypenaeuscurvirostris 中國水產(chǎn)品的進(jìn)出口貿(mào)易情況 中國2002年出口量排列前五位的依次是凍魚及魚片 占46 1 頭足類 占18 1 各種加工魚類及罐頭 5 8 養(yǎng)殖蝦 5 2 和烤鰻 3 2 出口額排在前五位的是凍魚及魚片 30 0 頭足類 16 4 烤鰻 12 6 養(yǎng)殖蝦 12 2 加工魚類及罐頭 6 0 1 引起蝦類黑變真正原因是什么 2 血藍(lán)蛋白是怎樣被激活的 3 血藍(lán)蛋白在對(duì)蝦中的存在位置 4 血藍(lán)蛋白僅僅氧化酪氨酸嗎 5 是否還有其它因素能引起蝦類的黑變 1 引起蝦類黑變真正原因是什么 DOPA Melanin DOPAquinone 5 6 dihydroxyindole DHI DOPAchrome Phenoloxidase PO Tyrosine 蝦類黑色素的形成 目前普遍被接受的形成機(jī)理 多酚氧化酶酶原的激活機(jī)理 Prophenoloxidase ProPO Phenoloxidase PO ProPOSystem Beta 1 3glucan LPS Peptidoglycan prophenoloxidaseactivatingfactor p APMSF 1 3葡聚糖 脂多糖 肽聚糖 0 20 40 60 80 100 120 1 2 3 4 0 Storagetime week POactivityduringstorageat 20 Residualactivity 多酚氧化酶原的cDNA序列及由cDNA序列推導(dǎo)出的氨基酸序列 Pacifastacusleniusculusprophenoloxidase Bombyxmoriprophenoloxidase Drosophilamelanogasterprophenoloxidase Homosapienstyrosinase Oryziaslatipestyrosinase Neurosporacrassatyrosinase Sinorhizobiummelilotityrosinase Proteins identity 57 35 38 15 13 11 14 PanulirusinterruptushemocyaninsubunitA Penaeusvannameihemocyanin Eurypelmacalifornicumhemocyaninsubunita 29 30 38 不同來源的多酚氧化酶原氨基酸序列的同源性比較 pjppo 0 1 lycopoA sopo mdpo papo 1000 889 1000 olty rnty ggty hsty mmty 1000 999 994 1000 bdhex mdhex aghex amhex 1000 886 1000 pihca pihcb 1000 pihcc pvhc1 pvhc2 1000 998 1000 agppo1 bmppo1 1000 bmppo2 msppo 1000 723 dmppo gam2 agppo3 agppo6 1000 987 agppo4 agppo5 1000 962 1000 1000 plppo 1000 825 echcb echcc 1000 echca echcf echce echcg 441 520 echcd 977 504 1000 1000 853 1000 417 973 973 Plantphenoloxidase Vertebratetyrosinase Crustaceanhemocyanin Insectphenoloxidase Cheliceratehemocyanin Crustaceanprophenoloxidase nsty smty Microbialtyrosinase Insecthexamerin DendrogramofPOs 2 血藍(lán)蛋白是怎樣被激活的 血藍(lán)蛋白 Hc 由肝胰腺分泌在血清中作為氧的運(yùn)輸載體可作為滲透壓調(diào)節(jié)劑 蛻皮激素載體 抗菌肽前體從基因序列看 與多酚氧化酶有較大的同源性被激活后 具有多酚氧化酶活性 血細(xì)胞組分在激活血藍(lán)蛋白的過程中起重要作用 血藍(lán)蛋白的激活 Hc HemocyaninHLS HemocyteLysateSupernatant AandC ActivatedHemocyaninBandD NativeHemocyanin NativeHc ActivatedHc 血藍(lán)蛋白的激活機(jī)理 S Sbond 3 血藍(lán)蛋白在對(duì)蝦中的存在部位 血藍(lán)蛋白存在于蝦類的表皮 在蝦的表皮會(huì)發(fā)生明顯的黑變 表皮中的血藍(lán)蛋白 100mm Stainedwith A Antibody B Toluidineblue C NegativeControl D Secondaryantibody Dorsal Ventral Epicuticle Endocuticle Exocuticle A B C D 4 血藍(lán)蛋白僅僅氧化酪氨酸嗎 DOPA Melanin DOPAquinone 5 6 dihydroxyindole DHI DOPAchrome Hemocyanin Tyrosine 血藍(lán)蛋白引起的蝦類黑色素的形成過程 DHIandDHICA 5 6 Dihydroxyindole 2 carboxylicacid DHICA 5 6 Dihydroxy