大腸桿菌的培養(yǎng)和分離

微生物 微生物 microorganism 結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單 形體微小的單細(xì)胞 多細(xì)胞或沒有細(xì)胞結(jié)構(gòu)的低等生物 例 酵母 霉菌 細(xì)菌 放線菌 病毒和小型原生動(dòng)物等等微生物的利用 抗生素 酒 腐乳 污水治理 大腸桿菌的培養(yǎng)與分離 一 大腸桿菌 E coli 兼性厭氧的腸道內(nèi)的共生菌群合成維生素B和維生素K 供機(jī)體利用 產(chǎn)生大腸桿菌素 抑制腸道致病菌和腐生菌滋生 革蘭氏陰性菌 作為一種工程菌 在基因工程技術(shù)中被廣泛采用 例 大規(guī)模生產(chǎn)治療糖尿病的藥物 胰島素 細(xì)菌的革蘭氏染色 革蘭氏染色法是一種用于細(xì)菌的染色法 此法將細(xì)菌分為兩類 即革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌 所謂革蘭氏陽(yáng)性菌就是用革蘭氏染液染色后 再用脫色液處理 細(xì)菌仍保留染色液的顏色 革蘭氏陰性菌則相反 這兩種菌的差別在于細(xì)胞壁的成分不同 大腸桿菌屬于革蘭氏陰性菌 培養(yǎng)基 culturemedia 按照微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的不同需求 配制出的供其生長(zhǎng)繁殖的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì) 提供微生物生長(zhǎng)的條件 合適的溫度 25 37 合適的pH 細(xì)菌6 5 7 5中性偏堿真菌5 0 6 0中性偏酸營(yíng)養(yǎng)成分 含有碳源 氮源 生長(zhǎng)因子 水和無機(jī)鹽 細(xì)菌喜葷 霉菌喜素 培養(yǎng)基內(nèi)所需的其他條件 1 pH值如 培養(yǎng)霉菌需酸性 培養(yǎng)細(xì)菌需中性或微堿性 2 特殊營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)如 培養(yǎng)乳酸桿菌需要在培養(yǎng)基中添加維生素 3 氧氣的含量如 培養(yǎng)厭氧微生物時(shí)需要提供無氧的條件 LB培養(yǎng)基的配方 固體培養(yǎng)基的配制 每50ml液體培養(yǎng)基添加1g瓊脂 瓊脂 紅藻中提取的多糖 在98 以上熔化 44 以下凝固 常溫下凝結(jié)成有彈性的凝膠 凝固劑 固體培養(yǎng)基 菌落 單個(gè)或少數(shù)細(xì)菌在固體培養(yǎng)基上大量繁殖時(shí) 就會(huì)形成一個(gè)肉眼可見的 具有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的子細(xì)胞群體 叫做菌落 菌落是鑒定菌種的重要依據(jù) 菌落 液體培養(yǎng)基 表面生長(zhǎng) 均勻混濁生長(zhǎng) 沉淀生長(zhǎng) 三 無菌技術(shù) 1 獲得純凈培養(yǎng)物的關(guān)鍵 2 無菌技術(shù)的四個(gè)方面 參看教材20頁(yè) 3 消毒與滅菌 防止外來雜菌的入侵 無菌技術(shù)的四個(gè)方面 1 對(duì)實(shí)驗(yàn)操作空間 操作者的衣著和手進(jìn)行清潔和消毒 2 將培養(yǎng)器皿 接種用具和培養(yǎng)基等器具進(jìn)行滅菌 3 為避免周圍微生物污染 實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在酒精燈火焰附近旁進(jìn)行 4 避免已滅菌處理的材料用具與周圍物品相接觸 1 消毒 利用化學(xué)或物理方法 殺死大部份致病微生物的過程 消毒與滅菌 2 滅菌 滅菌與消毒技術(shù)是微生物有關(guān)工作中最普通也是最重要的技術(shù) 以化學(xué)劑或物理方法消滅所有微生物 包括所有細(xì)菌的繁殖體 芽孢 霉菌及病毒 而達(dá)到完全無菌的過程 1 消毒 概念 使用較為溫和的物理或化學(xué)方法僅殺死物體表面或內(nèi)部一部分對(duì)人體有害的微生物 包括芽孢和孢子嗎 方法 煮沸消毒法巴氏消毒法 如牛奶的消毒化學(xué)藥劑消毒 酒精 氯氣 石碳酸 煤酚皂溶液等紫外線消毒 不包括芽孢和孢子 2 滅菌 概念 使用強(qiáng)烈的理化因素殺死物體內(nèi)外所有的微生物 包括芽孢和孢子 方法 a灼燒滅菌b干熱滅菌c高壓蒸汽滅菌 灼燒滅菌 微生物的接種工具 接種環(huán) 接種針 或其他金屬用具直接在火焰的充分燃燒層灼燒 注意適用范圍 干熱滅菌160 170 1 2h 能耐高溫的需要保持干燥的物品 玻璃器皿 高壓蒸汽滅菌100kPa121 15 30min 通常用于培養(yǎng)基的滅菌 高壓蒸汽滅菌法 高壓蒸汽滅菌法為濕熱滅菌法 其優(yōu)點(diǎn)有三 1 濕熱滅菌時(shí)菌體蛋白容易變性 2 濕熱穿透力強(qiáng) 3 水蒸汽變成水時(shí)可放出大量熱增強(qiáng)殺菌效果 因此 它是效果最好的滅菌方法 2 請(qǐng)你判斷以下材料或用具是否需要消毒或滅菌 如果需要 請(qǐng)選擇合適的方法 1 培養(yǎng)細(xì)菌用的培養(yǎng)基與培養(yǎng)皿 2 玻棒 試管 燒瓶和吸管 3 實(shí)驗(yàn)操作者的雙手 答 1 2 需要滅菌 3 需要消毒 思考 1 二 大腸桿菌的培養(yǎng)和分離實(shí)驗(yàn)操作 一 培養(yǎng)基的配置與滅菌 取2個(gè)250ml的三角瓶中分別裝入50mlLB液體培養(yǎng)基和50mlLB固體培養(yǎng)基 剛配好 尚未凝固 加上封口膜 牛皮紙包裝后高壓鍋滅菌15min LB液體培養(yǎng)基 細(xì)菌的擴(kuò)大培養(yǎng)LB固體培養(yǎng)基 細(xì)菌的劃線分離 封口膜 既通氣又不使菌進(jìn)入 二 倒平板 滅菌后的培養(yǎng)基在無菌操作臺(tái)上倒入4個(gè)培養(yǎng)皿中 倒后立即置于水平位置上 輕輕晃動(dòng) 使培養(yǎng)基鋪滿平皿底部 待凝 使之形成平面 培養(yǎng)皿壁上不能沾有培養(yǎng)液 否則容易污染 注意事項(xiàng) 1 培養(yǎng)基滅菌后 需要冷卻到60 左右時(shí) 才能用來倒平板2 滅菌及消毒 無菌操作臺(tái)用超凈紫外燈和過濾風(fēng)滅菌 桌面及人手用酒精棉球消毒3 操作時(shí)右手無名指和小指夾住封口膜 另外三指持三角瓶 左手拿培養(yǎng)皿并打開上蓋的一邊 在酒精燈火焰旁操作 4 需要使錐形瓶的瓶口通過火焰 灼燒滅菌5 平板冷凝后 要將平板倒置 既可以使培養(yǎng)基表面的水分更好地?fù)]發(fā) 又可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基 造成污染 三 大腸桿菌的擴(kuò)大培養(yǎng) 將斜面上培養(yǎng)的大腸桿菌菌種接種到滅菌后的液體培養(yǎng)基中 使其在37 搖床培養(yǎng)12小時(shí) 注意事項(xiàng) 1 火焰旁從斜面上用接種環(huán)取菌 2 取菌前接種環(huán)要用酒精燈灼燒滅菌 冷卻后方能取菌 3 取菌后封口膜和棉塞復(fù)原 四 大腸桿菌的劃線分離 分離方法 劃線分離法和涂布分離法 平板劃線分離法 平板劃線的操作 不能使用脫脂棉 否則容易吸水 造成污染 進(jìn)行恒溫培養(yǎng)時(shí) 為什么要將平板倒置 答 恒溫培養(yǎng)時(shí) 培養(yǎng)基的水分會(huì)以水蒸氣的形式蒸發(fā) 倒放培養(yǎng)皿會(huì)是水蒸氣凝結(jié)成水滴留在蓋上 如果正放培養(yǎng)皿 則水分形成的水滴回落到培養(yǎng)基的表面并且散開 如果培養(yǎng)皿已形成菌落 則菌落中的菌會(huì)隨水?dāng)U散 菌落相互影響 很難再分成單菌落 達(dá)不到分離的目的 因此 恒溫培養(yǎng)時(shí) 培養(yǎng)皿必須倒置 劃線分離法注意事項(xiàng) 1 接種環(huán)只蘸一次菌液 但要在培養(yǎng)基不同位置連續(xù)劃線多次 2 劃線首尾不能相接3 劃線后 培養(yǎng)皿倒置培養(yǎng)12 24h 1 培養(yǎng)基滅菌后 需要冷卻到50 左右時(shí) 才能用來倒平板 你用什么辦法來估計(jì)培養(yǎng)基的溫度 問題討論 答 可以用手觸摸盛有培養(yǎng)基的錐形瓶 感覺錐形瓶的溫度下降到剛剛不燙手時(shí) 就可以進(jìn)行倒平板了 2 為什么需要使錐形瓶的瓶口通過火焰 答 通過灼燒滅菌 防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基 2 在灼燒接種環(huán)之后 為什么要等其冷卻后再進(jìn)行劃線 答 以免接種環(huán)溫度太高 殺死菌種 3 在作第二次以及其后的劃線操作時(shí) 為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線 答 劃線后 線條末端細(xì)菌的數(shù)目比線條起始處要少 每次從上一次劃線的末端開始 能使細(xì)菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少 最終能得到由單個(gè)細(xì)菌繁殖而來的菌落 2 涂布分離法 是指將培養(yǎng)的菌液稀釋一定的倍數(shù) 然后取一定量稀釋液加在固體培養(yǎng)基上 用玻璃刮刀涂布在培養(yǎng)基平面上 劃線分離法和涂布分離法哪個(gè)更好呢 劃線分離 方法簡(jiǎn)單 但單菌落較難分開 涂布分離 單菌落更易分開 但操作復(fù)雜 五 菌種的保存 1 臨時(shí)保藏 接種到固體斜面培養(yǎng)基 菌落長(zhǎng)成后置于4 冰箱保存 2 長(zhǎng)期保存 甘油冷凍管藏法 課后思考題 1 如何操作才可以盡量避免被雜菌污染 1 膽大心細(xì) 操作快捷 2 注意滅菌操作原則 滅菌徹底 降低環(huán)境污染概率 3 注意微生物生長(zhǎng)條件 如PH 滲透壓 溫度等 細(xì)菌喜堿 喜蛋白質(zhì) 喜37度 霉菌喜酸 喜糖 喜25 30度 2 在培養(yǎng)后如何判斷是否有雜菌污染 1 菌落的形態(tài)看 是否濕潤(rùn) 透明 粘稠 顏色等 是區(qū)別細(xì)菌 酵母 放線菌和霉菌關(guān)鍵指標(biāo) 2 顯微鏡觀察其形態(tài) 大小 看是否有菌絲 孢子 芽孢 是區(qū)別細(xì)菌 酵母 放線菌和霉菌關(guān)鍵指標(biāo) 3 上述方法較難區(qū)別同類的不同物種 需借助化學(xué)和進(jìn)一步的形態(tài)觀察 如用革蘭氏染色法等 3 進(jìn)行恒溫培養(yǎng)時(shí)為什么要將培養(yǎng)皿倒置 恒溫培養(yǎng)時(shí) 培養(yǎng)基中的水分會(huì)以水蒸氣的形式蒸發(fā) 倒放培養(yǎng)皿則會(huì)使水蒸氣凝結(jié)成水滴留在蓋上 如果正放 則水分形成的水滴會(huì)落入培養(yǎng)基表面并擴(kuò)散開 如果培養(yǎng)皿中已形成菌落 則會(huì)導(dǎo)致菌隨水?dāng)U散 很難再分成單菌落 達(dá)不到