中圖版選修一 酶的制備及活力測定 教案 (3).doc

酶的制備及活力測定一、實驗目的1. 掌握包埋法固定化酶的操作技術。2. 掌握測定堿性蛋白酶活力的原理和酶活力的計算方法。3. 學習測定酶促反應速度的方法和基本操作。二、實驗原理酶活力是指酶催化某些化學反應的能力。酶活力的大小可以用在一定條件下它所催化的某一化學反應的速度來表示。測定酶活力實際就是測定被酶所催化的化學反應的速度。酶促反應的速度可以用單位時間內反應底物的減少量或產(chǎn)物的增加量來表示，為了靈敏起見，通常是測定單位時間內產(chǎn)物的生成量。由于酶促反應速度可隨時間的推移而逐漸降低其增加值，所以，為了正確測得酶活力，就必須測定酶促反應的初速度。堿性蛋白酶在堿性條件下，可以催化酪蛋白水解生成酪氨酸。酪氨酸為含有酚羥基的氨基酸，可與福林試劑（磷鎢酸與磷鉬酸的混合物）發(fā)生福林酚反應。（福林酚反應：福林試劑在堿性條件下極其不穩(wěn)定，容易定量地被酚類化合物還原，生成鎢藍和鉬藍的混合物，而呈現(xiàn)出不同深淺的藍色。）利用比色法即可測定酪氨酸的生成量，用堿性蛋白酶在單位時間內水解酪蛋白產(chǎn)生的酪氨酸的量來表示酶活力。所謂固定化酶，就是用物理或化學方法處理水溶性的酶使之變成不溶于水或固定于固相載體的但仍具有酶活性的酶衍生物。在催化反應中,它以固相狀態(tài)作用于底物，反應完成后,容易與水溶性反應物分離，可反復使用。固定化酶不但仍具有酶的高度專一性和高催化效率的特點，且比水溶性酶穩(wěn)定，可較長期使用，具有較高的經(jīng)濟效益。將酶制成固定化酶，作為生物體內的酶的模擬，可有助于了解微環(huán)境對酶功能的影響。酶的固定化方法大致可分為載體結合法、交聯(lián)法和包埋法（圖1-1-1）等。載體結合法：將酶結合到非水溶性的載體上。一般來講,載體的親水性基團越多，表面積越大，單位載體結合的酶量也越大。最常用的是共價結合法，此外還有離子結合法、物理吸附法。交聯(lián)法：利用雙官能團或多官能團試劑與酶之間發(fā)生分子交聯(lián)來把酶固定化的方法。常用的試劑有戊二醛、亞乙基二異氰酸酯、雙重氮聯(lián)苯胺和乙烯- 馬來酸酐共聚物等。參與此反應的酶蛋白中的官能團有n末端的-氨基、賴氨酸的-氨基、酪氨酸的酚基和半胱氨酸的巰基等。交聯(lián)法反應比較激烈，固定化酶的活力，在多數(shù)情況下都較脆弱。包埋法：將酶包裹于凝膠網(wǎng)格或聚合物的半透膜微中,使酶固定化。所用的凝膠有瓊脂、海藻酸鹽以及聚丙烯酰胺凝膠等；用于制備微囊的材料有聚酰胺、聚脲、聚酯等。將酶包埋在聚合物內是一種反應條件溫和，很少改變酶蛋白結構的固定化方法，此法對大多數(shù)酶、粗酶制劑、甚至完整的微生物細胞都適用。但此法較適合于小分子底物和產(chǎn)物的反應，因為在凝膠網(wǎng)格和微囊中存在有分子擴散效應。加大凝膠網(wǎng)格，有利于分子擴散，但使凝膠的機械強度降低。圖1-1-1 酶固定化模式圖三、實驗用品1. 試劑（1） 海藻酸鈉、3.0氯化鈣；（2） 堿性蛋白酶：精確稱取干酶粉1克，加入10 ml ph 10緩沖溶液，在小燒杯中溶解，并用玻璃棒攪拌，靜止片刻后，將上層液小心傾入容量瓶中，沉渣部分再加入少量緩沖液，如此反復攪拌溶解4次，最后全部移入100ml容量瓶中。用緩沖溶液定容至刻度，充分搖勻，用二層紗布或四層紗布過濾，吸取濾液10 ml，移入100 ml容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度，所得液為稀釋1000倍的酶液（1.0 mg /ml）。（3） 福林試劑：在1l容積的磨口回流瓶中加入50g鎢酸鈉(na2wo42h2o)、125g鉬酸鈉(na2moo42h2o)、350ml蒸餾水、25 ml 85磷酸及50ml濃鹽酸，充分混勻后回流10h?；亓魍戤?，再加25g硫酸鋰、25 ml蒸餾水及數(shù)滴液體溴，開口繼續(xù)沸騰15分鐘，以便驅除過量的溴，冷卻后定容到500 ml。過濾，置于棕色瓶中暗處保存。使用前加4倍蒸餾水稀釋。（4） 1%酪蛋白溶液：稱取酪蛋白1克于研缽中，先用少量蒸餾水濕潤后，慢慢加入0.2 mol/l naoh 4ml，充分研磨，用蒸餾水洗入100 ml容量瓶中，放入水浴中煮沸15分鐘，溶解后冷卻，定容至100ml，保存于冰箱內。（5） ph 10緩沖溶液：甲液（0.05 mol/l硼砂溶液）：取硼砂(na2b4o710h2o) 19克，用蒸餾水溶解并定容至1000 ml。乙液：0.2 mol/l氫氧化鈉溶液。配制ph 10硼砂氫氧化鈉溶液：吸取甲液50 ml，再加入乙液21ml，用蒸餾水定容至200 ml。（6） 標準酪氨酸溶液：精確稱取酪氨酸50mg，加入1ml 1mol/l鹽酸溶解后用蒸餾水定容至50 ml，即得1 mg/ml酪氨酸標準溶液。（7） 0.4 mol/l碳酸鈉溶液，0.4 mol/l三氯醋酸溶液。2. 儀器磁力攪拌器、恒溫水浴鍋、注射器、燒杯（100 ml，500 ml）、布式漏斗、分析天平、容量瓶、移液管、分光光度計；四、實驗步驟1. 酶的固定化稱取1.00 g海藻酸鈉于盛有30 ml蒸餾水的燒杯中，加熱至沸騰完全溶解后，放置室溫漸冷卻至38左右，加入預先制備好的堿性蛋白酶溶液20 ml。用注射器抽取海藻酸鈉酶混合物，將混合物緩慢滴入盛有200 ml 3.0氯化鈣溶液的燒杯中，同時燒杯置于磁力攪拌器上勻速攪拌，滴完后靜置硬化30 min，傾去氯化鈣溶液，用適量蒸餾水洗滌2-3次，除去漂浮的空化珠狀顆粒后，即制備得到固定化的堿性蛋白酶。2. 酶活力測定制備酪氨酸標準曲線(1) 取7支試管，編號，按下表配制不同含量的酪氨酸溶液。（見下表）(2) 在上述7支試管中，分別加入1%酪蛋白溶液1ml，于40水浴中保溫15 min，取出后，加入0.4 mol/l三氯醋酸3 ml，充分搖勻，各管分別用濾紙過濾。(3)分別吸取濾液1ml放入另7支試管中，加入0.4 mol/l碳酸鈉溶液5 ml，福林試劑1ml，充分搖勻，于40水浴中保溫15 min，然后于每管中各加入3 ml蒸餾水，充分搖勻。(4) 用721型分光光度計，以0號管作對照，在680 nm處測定光密度。(5) 以光密度為縱坐標，酪氨酸含量（微克數(shù)）為橫坐標，繪制標準曲線。表 酪氨酸標準曲線制作試管編號酪氨酸含量（g ）1/ml酪氨酸標準溶液（ml）蒸餾水( ml )0123456010020030040050060000.10.20.30.40.50.62.01.91.81.71.61.51.4固定化酶活力測定上述固定化的蛋白酶或相當量的游離蛋白酶（20 ml）置于盛有20 ml ph 10緩沖液的三角瓶中，加20 ml 1%酪蛋白溶液，于40水浴保溫15min后，取3 ml置于試管中，加3 ml三氯醋酸溶液。對照管為1 ml緩沖液1 ml蛋白酶液3 ml三氯醋酸溶液1 ml 1%酪蛋白溶液（順序不可顛倒），于40水浴保溫15min。搖勻后，各管分別過濾，吸取濾液1ml，加入0.4 mol/l碳酸鈉溶液5ml，福林試劑1 ml，充分搖勻，于40水浴保溫15min，然后每管各加入3 ml蒸餾水，搖勻。用721型分光光度計在波長680 nm處，以對照管為對照，測定吸光值。3.結果與計算2. 本實驗中堿性蛋白酶活力單位的定義：1克堿性蛋白酶粉在ph 10，40的條件下，每分鐘水解酪蛋白能產(chǎn)生1微克酪氨酸，定為一個酶活力單位（u）。3. 本實驗中堿性蛋白酶活力單位的計算：每克堿性蛋白酶的活力單位 = m / t fm： 樣品所測定的光密度值，經(jīng)查標準曲線求得的酪氨酸量（g）；t： 酶促反應的時間（15 min）；f： 酶的稀釋倍數(shù)，本實驗中f = 1000；五、注意事項1. 酶液與加熱溶解