2012年衛(wèi)生專(zhuān)業(yè)技術(shù)高級(jí)職稱(chēng)評(píng)審臨床論文 (1).doc

晉升網(wǎng)官方域名：34株多重耐藥銅綠假單胞菌內(nèi)酰胺酶基因及類(lèi)整合子檢測(cè)分析 作者：萬(wàn)瑛1，陰晴1，成靜2，段秀杰1，高雁1，陸建成1 作者單位：(1.江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇 鎮(zhèn)江212001;2.江蘇大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江212013) 【摘要】目的：探討我院臨床分離多重耐藥銅綠假單胞菌的-內(nèi)酰胺酶相關(guān)基因及類(lèi)整合子(int1和qacE1-sul1)的攜帶情況，為臨床抗感染治療和控制醫(yī)院感染提供依據(jù)。方法：采用K-B法對(duì)臨床分離的銅綠假單胞菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，選出34株多重耐藥菌株，用PCR法檢測(cè)其相關(guān)耐藥基因16種。結(jié)果：在34株多重耐藥銅綠假單胞菌中共有13種耐藥基因陽(yáng)性，陽(yáng)性率較高的為qacE1-sul1、oprD2缺失、blaTEM。結(jié)論：多重耐藥銅綠假單胞菌可同時(shí)獲得多種耐藥基因，臨床應(yīng)根據(jù)藥敏結(jié)果選擇用藥，以減少耐藥菌株的產(chǎn)生，控制院內(nèi)感染。 【關(guān)鍵詞】 銅綠假單胞菌;耐藥基因;-內(nèi)酰胺酶;類(lèi)整合子 ABSTRACT Objective： To explore the resistance gene and prevalence of beta-lactamas and classintegron of clinical isolates of multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa (MDRPA) in our hospital， and provide evidence for clinical anti-infective therapy and control the nosocomial infection. Methods： Antimicrobial susceptibilities of the Pseudomonas aeruginosa isolates were detected by Kirby Bauer method. Out of 34 collected MDRPA strains， 16 kinds of resistance genes were detected by polymerase chain reaction (PCR) method. Results： Thirteen kinds of resistant genes were detected as positive for the 34 strains. Relevant higher positive rates were observed for qacE1-sul1、oprD2 defect and blaTEM. Conclusions： Multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa have several kinds of resistant genes. Antibiotics should be used rationally according to antimicrobial susceptibility in order to control the development of multidrug bacteria and nosocomial infection. KEY WORDS Pseudomonas aeruginosa;Resistant gene ;Beta-lactamase ; Class1integron 銅綠假單胞菌(PA)是醫(yī)院分離率最高的條件致病菌。近年來(lái)，隨著對(duì)3類(lèi)或3類(lèi)以上抗菌藥表現(xiàn)耐藥的多重耐藥(MDR)的PA不斷增加，給臨床抗感染治療帶來(lái)了極大困難。PA的耐藥機(jī)制非常復(fù)雜，包括產(chǎn)生多種-內(nèi)酰胺酶、氨基糖苷類(lèi)抗菌藥物修飾酶、外膜孔蛋白D2 (OprD2)缺失、外排機(jī)制等1-3。為了解我院臨床分離的銅綠假單胞菌耐藥基因，我們對(duì)34株多重耐藥PA菌的表型及其內(nèi)酰胺酶基因及類(lèi)整合子進(jìn)行了檢測(cè)與分析。 1材料與方法 1.1菌株來(lái)源及細(xì)菌鑒定 所有菌株分離自江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院20072009年臨床送檢的痰液、尿液、膿液等標(biāo)本，共34株。細(xì)菌的分離與鑒定參照全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程第3版，并經(jīng)VITEK GNI+鑒定卡鑒定。標(biāo)準(zhǔn)菌株為銅綠假單胞菌ATCC 27853，大腸埃希菌ATCC25922。 1.2藥敏試驗(yàn)及藥敏紙片 采用K-B法對(duì)臨床分離的銅綠假單胞菌進(jìn)行15種藥敏試驗(yàn)。根據(jù)CLSI 2009年版標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的臨界值判讀藥敏結(jié)果。其中氨曲南(AZM)、頭孢哌酮(CFP)、頭孢哌酮/舒巴坦(C/S)、左氧氟沙星(LVF)、哌拉西林(PIP)、哌拉西林/他唑巴坦(P/T)、頭孢他啶(CAZ)、阿米卡星(AMK)、慶大霉素(GEN)、妥布霉素(TOB)、環(huán)丙沙星(CIP)、復(fù)方新諾明(SXT)、奈替米星(NET)購(gòu)自北京天壇藥物生物有限公司，亞胺培南(IMP)購(gòu)自英國(guó)Oxoid公司，頭孢吡肟(FEP)購(gòu)自美國(guó)BD公司。水解酪蛋白(MH)瓊脂，購(gòu)自杭州天和微生物有限公司。 1.3耐藥基因檢測(cè) 1.3.1模板DNA提取 挑純培養(yǎng)細(xì)菌菌落少許置入50 L滅菌水中，置100 水浴10 min， 8 000 r/min 30 s，上清液即為DNA模板液。 1.3.2基因擴(kuò)增 oprD2基因熱循環(huán)參數(shù)為93 預(yù)變性3 min93 30 s55 30 s72 60 s，最后一個(gè)72 延伸5 min，共循環(huán)35周期。其余基因熱循環(huán)參數(shù)為：93 預(yù)變性3 min93 60 s55 60 s72 60 s，最后一個(gè)72 延伸5 min，共循環(huán)35周期。純水為陰性對(duì)照。經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析。PCR方法引物序列見(jiàn)表14-5。 1.4試劑 PCR所需引物由上海生工技術(shù)有限公司合成， TaKaRa DR001A Tag酶為上海(大連)寶生公司產(chǎn)品;Mark為T(mén)aKaRa公司產(chǎn)品; GNI+鑒定卡為上海祥和科技有限公司產(chǎn)品。 1.5儀器 VITEK32型全自動(dòng)微生物鑒定藥敏測(cè)試儀，高速低溫離心機(jī)，梯度PCR擴(kuò)增儀，Gene Genius凝膠成像儀，恒溫水浴箱等。 2結(jié)果 2.1藥敏結(jié)果分析 34株多重耐藥銅綠假單胞菌體外對(duì)15種抗生素的藥敏結(jié)果見(jiàn)表2。從表2中可見(jiàn)，多重耐藥銅綠假單胞菌對(duì)頭孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢他啶、阿米卡星的敏感率較高，分別為55.88%、55.88%、55.88%、50%、47.06%。 2.2內(nèi)酰胺酶基因及類(lèi)整合子檢測(cè)結(jié)果 檢出率最高的是qacE1-sul1，占91.18%，與其體外復(fù)方新諾明藥敏試驗(yàn)結(jié)果基本符合。其他基因檢出率由高到低為oprD2缺失(47.06%)，TEM(44.12%)，OXA-10(38.24%)，VIM(11.76%)，SPM(8.82%)，VEB(5.88%)，未檢出IMP、GIM、PER、GES、CARB、DHA、CTX-M、int1。同一株細(xì)菌可同時(shí)攜帶2種或2種以上的耐藥基因，有多種基因型組合方式，有TEM+SHV+OXA-10+qacE1-sul1; TEM+SHV+OXA-10+VEB等多種基因組合。表1耐藥基因引物序列表234株銅綠假單胞菌對(duì)15種抗生素的藥敏結(jié)果 3討論 OprD2被認(rèn)為是亞胺培南擴(kuò)散的通道，其缺失可導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)亞胺培南的耐藥，使得臨床亞胺培南治療失敗。34株多重耐藥銅綠假單胞菌共檢出OprD2缺失菌占47.06%，OprD2缺失菌株大多伴有其他耐藥基因的存在，單純OprD2缺失只有一株?？梢?jiàn)本院銅綠假單胞菌對(duì)亞胺培南產(chǎn)生耐藥的機(jī)制是復(fù)雜的。 整合子水平式傳播是介導(dǎo)革蘭陰性菌特別是腸道菌和假單胞菌屬細(xì)菌多重耐藥的重要原因?，F(xiàn)已確認(rèn)起最主要作用的為類(lèi)整合子6,7。 int1與qacE1-sul1基因?yàn)轭?lèi)整合子的遺傳標(biāo)記，單獨(dú)或同時(shí)陽(yáng)性均表明細(xì)菌存在類(lèi)整合子。I類(lèi)整合子可同時(shí)攜帶多種耐藥基因，造成大面積的細(xì)菌同時(shí)對(duì)某類(lèi)(種)抗生素耐藥。類(lèi)整合子最常見(jiàn)，其5保守端有編碼整合酶的類(lèi)整合酶基因int1 及啟動(dòng)子，大多數(shù)3保守端有3個(gè)ORF：季銨鹽化合物及溴乙錠的耐藥基因(qacE1)、磺胺耐藥基因(sul1)、功能不明的開(kāi)放閱讀框架ORF5。本研究檢測(cè)34株銅綠假單胞菌qacE1-sul1，發(fā)現(xiàn)有31株(91.2%)為陽(yáng)性，表明本組菌株類(lèi)整合子攜帶率很高，與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致8。qacE1同時(shí)也是消毒劑耐藥基因，其產(chǎn)物可使多種化合物排出胞外，賦予細(xì)菌對(duì)季銨類(lèi)、雙胍類(lèi)消毒劑耐藥。sul1為二氫蝶酸合成酶的編碼基因，陽(yáng)性提示細(xì)菌對(duì)磺胺類(lèi)藥物耐受。本組34株P(guān)A均對(duì)復(fù)方新諾明全部耐藥，表明研究菌株的基因型與表型符合。 近來(lái)不斷發(fā)現(xiàn)水解卡巴配能的金屬酶IPM、VIM、SPM、SIM和GIM，有些還引起了醫(yī)院的爆發(fā)流行9,10。VIM已在我國(guó)許多地區(qū)發(fā)現(xiàn)，以VIM-2型為主，SPM型在我國(guó)尚未有此基因型的報(bào)道。本研究檢出VIM(11.76%)，SPM(8.82%)，未檢出IPM和GIM。TEM、SHV、OXA、CTX-M、VEB、GES等是常見(jiàn)的超廣譜內(nèi)酰胺酶，本研究對(duì)34株銅綠假單胞菌進(jìn)行上述基因的檢測(cè)，結(jié)果顯示本地區(qū)以TEM、OXA-10流行為主。（晉升網(wǎng)（）是目前國(guó)內(nèi)收錄中文最多最權(quán)威醫(yī)學(xué)雜志、醫(yī)學(xué)雜志；網(wǎng)羅和甄選海量?jī)?yōu)秀醫(yī)學(xué)論文，提供免費(fèi)全文閱讀。網(wǎng)站可以實(shí)現(xiàn)文章內(nèi)容的全文檢索，可以提供醫(yī)學(xué)論文的免費(fèi)查詢(xún)、閱讀、下載以及提供最及時(shí)的醫(yī)學(xué)信息，最豐富的醫(yī)學(xué)文獻(xiàn) ，最權(quán)威的期刊雜志，最有效的學(xué)習(xí)方法）。 【參考文獻(xiàn)】 1Doi Y， Ghilardi A C. 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