丙型肝炎病毒核酸定量測定試劑盒說明書.doc

丙型肝炎病毒核酸定量測定試劑盒（PCR-熒光法）說明書精品文檔交流【產(chǎn)品名稱】通用名：丙型肝炎病毒核酸定量測定試劑盒（PCR-熒光法）英文名：PCR-Fluorescence Detection Kit for Hepatitis C Virus RNA漢語拼音：Bingxing Ganyan Bingdu Hesuan Dingliang Ceding Shijihe （PCR -Yingguang fa）【包裝規(guī)格】 32人份/盒【預期用途】本試劑盒用于丙型肝炎的輔助診斷及療程監(jiān)控。【原理和應用】本試劑盒利用一對丙型肝炎病毒（HCV）的特異性引物，一條特異性熒光探針，采用逆轉(zhuǎn)錄酶、耐熱DNA聚合酶（Taq酶）、四種單體核苷酸（dNTPs）等成分，并應用RT-PCR技術實現(xiàn)對HCV RNA保守基因的擴增，同時通過外標的方法實現(xiàn)對血清或血漿中的丙型肝炎病毒進行定量檢測。本試劑盒可作為丙型肝炎的輔助診斷及療程監(jiān)控?！驹噭┖薪M成】組成成分規(guī)格樣本處理試劑 裂解液DEPC水（無Rnase和Dnase的水）核酸擴增試劑 RT-PCR主反應液酶混合液 熒光探針對照品 陰性對照 強陽性對照（非感染性體外轉(zhuǎn)錄RNA） 107106IU/ml 臨界陽性對照（非感染性體外轉(zhuǎn)錄RNA） 104103 IU/ml校準品* 定量校準品1# （1.0-8.0）104IU/ml 定量校準品2# （1.0-8.0）105IU/ml 定量校準品3# （1.0-8.0）106IU/ml 定量校準品4# （1.0-8.0）107IU/ml4ml2400ul1 1ml120ul114 ul1350ul1350ul1350ul150ul150ul150ul150ul1* 定量校準品具體的參數(shù)根據(jù)批號不同而不同。詳見試劑盒內(nèi)給定值?！緝Υ鏃l件及有效期】裂解液為黃色液體，保存于4；其他試劑目測為透明液體，保存于-20，不宜反復凍融，使用前應在室溫下完全融化，并充分振蕩混勻后稍事離心；所有試劑應避光保存；有效期十二個月?！咀詡湮锲贰?. 自備試劑（分析純）氯仿、異丙醇（-20預冷）、75%乙醇（用不含Rnase和Dnase的水配制，-20預冷）2. 自備儀器高速臺式冷凍離心機、移液槍、一次性耗材（無酶吸頭、離心管、手套、帽子等）、專用工作服、工作鞋、辦公用品等。【適用儀器】PE-5700，PE-7000，PE-7300，PE-7700，Icycler定量熒光PCR儀【樣本要求】1. 樣本種類：血清或血漿血清以新鮮采集分離為好，采血6小時內(nèi)必須分離、收集血清，并將血清轉(zhuǎn)移至一次性使用無RNA酶的無菌微量離心管中。血漿不能用肝素作抗凝劑。2. 樣本儲存：待測樣本在2-8保存不應超過24hr，-20保存不應超過三個月，-70以下可長期保存。3. 避免反復凍融（最多凍融三次）。4. 樣本運輸：在冷凍狀態(tài)下運輸。【使用方法】1. 樣本處理（樣本處理區(qū)）取n個1.5ml無RNA酶的離心管（n=樣本數(shù)+1管強陽性對照+1管臨界陽性對照+1管陰性對照），作好標記。在上述每一管中加入待測樣本血清、強陽性對照、臨界陽性對照、陰性對照各100ul，然后再各加入300ul裂解液，盡快用吸頭反復吸打或輕微振蕩混勻（每樣本換用一個吸頭），再加入100ul氯仿，振蕩混勻5sec或顛倒混勻15次（以無肉眼可見的白色塊狀沉淀為準；注意不宜過于強烈，避免產(chǎn)生乳化層影響分層）。13000rpm離心10min（注意固定離心管方向，有條件的可在4離心，下同）。取與步驟1相同數(shù)量的離心管，各加入200ul異丙醇（-20預冷），作好標記。吸取步驟3各管中的上清轉(zhuǎn)移至相應的管中（在盡量吸盡上清的同時注意不要吸取中間層），顛倒混勻。13000rpm離心10min（注意固定離心管方向）。輕輕倒去上清或用吸頭吸干液體，加入500ul75%乙醇，顛倒洗滌。13000rpm離心5min（注意固定離心管方向），輕輕倒去上清或用吸頭吸干液體。7500rpm離心5sec（注意固定離心管方向），用吸頭盡量吸干被甩至管底的殘余液體（一份樣本換一個吸頭，注意吸頭不要碰到有沉淀的一面），室溫干燥1-5min（干燥時間隨殘余液體的吸干程度而不同，以沉淀表面無肉眼可見水珠為準；不宜過分干燥，以免RNA不溶）。各加入10ulDEPC水，輕輕混勻，溶解管壁上的RNA，稍微離心，冰上保存?zhèn)溆茫ㄕ堅?小時內(nèi)用于PCR擴增），暫時不用時保存于-20，時間不應超過3天。2. 擴增試劑準備（PCR前準備期）從試劑盒中取出RT-PCR主反應液、酶混合液和熒光探針，在室溫下融化并振蕩混勻簡短離心。每個測試反應體系配制如下：試劑RT-PCR主反應液酶混合液熒光探針用量（ul）290.60.4計算好各試劑使用量，加入一適當體積離心管中，充分混勻，簡短離心，向設定的n個（n=樣本數(shù)+1管強陽性對照+1管臨界陽性對照+1管陰性對照+4個校準品）PCR反應管中分別加入30ul，轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū)。3. 加樣（樣本處理區(qū)）在PCR反應管中分別加入步驟2.9.中制備的RNA溶液及定量校準品（1-4）各10ul，蓋緊管蓋，簡短離心，將反應管放入熒光PCR檢測儀中，記錄樣本擺放順序。4. RT-PCR反應（檢測區(qū)）：步驟循環(huán)數(shù)溫度()反應時間(min:sec)114230:0021953:003595105530721:004409556030熒光信號的收集定為FAM，數(shù)據(jù)的采集定在60?！窘Y(jié)果分析】1. 結(jié)果分析條件設定:使用 ABI PRISM 7000熒光PCR檢測儀進行結(jié)果分析時基線（baseline）取6-10或6-15個循環(huán)的熒光信號；閾值（threshold）設定原則以基線剛好超過陰性對照品擴增曲線的最高點，且Ct值=40為準。定量標準曲線的相關系數(shù)應達0.97以上。2. 質(zhì)控標準2.1 本試劑盒的定量線性范圍：103測定結(jié)果108IU/ml。2.2 將校準品1-4的濃度輸入，儀器自動以定量質(zhì)控參考品的拷貝數(shù)的對數(shù)值為橫坐標，以其實際測得的Ct值為縱坐標給出標準曲線，標準曲線的相關系數(shù)應0.970，否則實驗無效。2.3 陰性對照測定結(jié)果為0，Ct值一欄顯示為undet。2.4 強、臨界陽性對照的定量結(jié)果在試劑盒提示的規(guī)定允許范圍內(nèi)。3. 結(jié)果判斷3.1 對于103測定結(jié)果108IU/ml的樣本，提示本次測定結(jié)果在試劑盒有效定量檢測線性范圍內(nèi)?？芍苯訄蟾鏀?shù)據(jù)。3.2 對于測定結(jié)果108IU/ml的樣本，提示病毒含量高于試劑盒定量檢測線性范圍上限，所測結(jié)果僅供參考，報告上注明108IU/ml。如需精確定量，可根據(jù)所測結(jié)果，將該標本用陰性血清稀釋至試劑盒測定范圍內(nèi)復測。3.3 對于500測定結(jié)果103IU/ml的樣本，提示病毒含量低于試劑盒定量檢測線性范圍下限，所測結(jié)果僅供參考，報告上注明103IU/ml，并謹慎跟蹤隨訪。3.4 測定結(jié)果為0（Ct值一欄為undet）的標本為HCV RNA陰性標本【檢驗方法的局限性】血漿樣本不能用肝素作抗凝劑。 不能直接作為臨床確診依據(jù)，僅供臨床醫(yī)生參考使用?！驹噭┖行阅堋繖z測限度為500IU/ml。 定量檢測范圍為1.01038.0108IU/ml。本試劑盒對HAV、HBV、HIV、HDV、TTV、CT、NG、HSV、HPV、UU、TB標本均無非特異性擴增。經(jīng)過對臨床常見高濃度膽紅素、血紅蛋白、血脂血漿樣本的系統(tǒng)研究，此類樣本不影響本試劑盒的定量檢測結(jié)果。經(jīng)實驗驗證，血漿樣本以EDTA、檸檬酸鈉、草酸鈉或ACD液抗凝，檢驗結(jié)果不受影響?！咀⒁馐马棥?. 待測新鮮血清標本若不及時檢測，應保存于-20或-70。2. 試劑盒各組分使用前應充分融化混勻，離心數(shù)秒后使用。3. PCR操作各階段應嚴格分區(qū)操作。如：PCR前準備區(qū): 準備擴增所需試劑樣本處理區(qū): 處待測樣本和對照品檢測區(qū): PCR擴增檢測4. 在試劑和標本準備階段應分別使用負壓超凈臺和生物安全柜以免污染。5. 應穿專用工作服，戴一次性手套并經(jīng)常替換，使用一次性用品。6. PCR操作人員應具有經(jīng)驗和受過培訓。7. 操作過程中用到的超凈臺、移液器、離心機、等儀器設備應經(jīng)常用10%次氯酸或70%酒精或紫外燈消毒。8. 使用本試劑盒檢測的標本具有傳染性物質(zhì)，請按傳染病實驗室檢查規(guī)程操作。9. 本試劑盒僅用于體外輔助診斷?！旧a(chǎn)單位】企業(yè)名稱：艾康生物技術（杭州）有限公司地址：浙江省杭州市天目山路398號古蕩經(jīng)濟園區(qū)郵政編碼：310023電話號碼真號碼址：.