生命科學(xué)專題RNAi.ppt

梅洛 CraigMello 生于1960年 是被恐龍骨引入科學(xué)世界的 梅洛童年時經(jīng)常跟著父親在美國西部尋找化石 從那時起 他就迷上了遠古時代 地球歷史和人類生命的起源等問題 高中時代 梅洛的興趣逐漸轉(zhuǎn)移到了基因工程方面 法爾 AndrewFire 1959年出生在美國加利福尼亞州 本科在加利福尼亞大學(xué)伯克利分校主修數(shù)學(xué) 僅用3年時間就拿到學(xué)位 與梅洛類似 他逐漸對涉及生命奧秘的遺傳學(xué)產(chǎn)生興趣 并將其作為自己終身的學(xué)術(shù)追求 RNA干擾 RNAinterference RNAi 南通大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院譚湘陵 一 RNA干擾的發(fā)現(xiàn) 94年Cogoni等證明真菌中亦有類似現(xiàn)象 此稱為基因壓制 quelling 90年代初 美國和荷蘭的兩個轉(zhuǎn)基因植物實驗組RichJorgensen和同事 在對矮牽牛 petunias 進行的研究中有個奇怪的發(fā)現(xiàn) 將一個能產(chǎn)生色素的基因置于一個強啟動子后 導(dǎo)入矮腳牽牛中 試圖加深花朵的紫顏色 結(jié)果沒看到期待中的深紫色花朵 多數(shù)花成了花斑的甚至白的 也就是說轉(zhuǎn)基因的植株不僅沒有新基因表達 反而使原有的色素基因也受到了抑制 Jorgensen將這種現(xiàn)象命名為共抑制 cosuppression 一 RNA干擾的發(fā)現(xiàn) 一 RNA干擾的發(fā)現(xiàn) Negativecontrolshowinglackofstainingintheabsenceofthehybridizationprobe B Embryofromuninjectedparentshowingnormalpatternofendogenousmex 3RNA purplestaining C Embryofromparentinjectedwithpurifiedmex 3antisenseRNA Theseembryos andtheparentanimals retainmex 3mRNA althoughlevelsmaybesomewhatlessthanwildtype D Late4 cellstageembryofromaparentinjectedwithdsRNAcorrespondingtomex 3 nomex 3RNAisdetected TemplatesusedforinterferingRNAandinsituprobeswerelargelynon overlapping Effectsofmex 3RNAinterferenceonlevelsoftheendogenousmRNA NomarskiDICmicrographsshowinsituhybridizationof4 cellstageembryos 一 RNA干擾的發(fā)現(xiàn) 2001年 RNAi技術(shù)成功誘導(dǎo)培養(yǎng)的哺乳動物細胞基因沉默現(xiàn)象 Nature 2001 411 6836 494 498RNAi技術(shù)被 Science 評為2001年度的十大科技進展之一 二 RNA干擾的機制 dsRNA 雙鏈RNA 包含正義鏈和反義鏈Dicer 屬于RNase 家族 是dsRNA的特異性核酸內(nèi)切酶siRNA smallinterferingRNA RNAi的關(guān)鍵效應(yīng)分子 21 23個nt大小的雙鏈RNARISC RNA inducingsilencingcomplex 具有核酸內(nèi)切 外切以及解旋酶活性RdRP RNA dependentRNApolymerases 依賴RNA的RNA聚合酶 是RNAi的調(diào)節(jié)因子 使RNAi可以在生物體內(nèi)傳遞 預(yù)備知識 基因沉默 二 RNA干擾的機制 轉(zhuǎn)錄水平的基因沉默 TranscriptionalGeneSilencing TGS 轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默 Post transcriptionalGeneSilencing PTGS TGS是指轉(zhuǎn)基因在細胞核內(nèi)RNA合成受到了阻止而導(dǎo)致基因沉默 對于部分植物來說 轉(zhuǎn)基因引發(fā)的基因沉默可能是因為基因特異的甲基化而導(dǎo)致 PTGS則是指轉(zhuǎn)基因能夠在細胞核里被穩(wěn)定地轉(zhuǎn)錄 但在細胞質(zhì)里卻無相應(yīng)的mRNA存在這一現(xiàn)象 基因沉默 目前普遍認為 共抑制 基因壓制和RNAi很可能具有相同的分子機制 都是通過dsRNA的介導(dǎo)而特異地降解靶mRNA 抑制相應(yīng)基因的表達 均屬于PTGS 現(xiàn)已初步闡明dsRNA介導(dǎo)的同源性靶mRNA降解過程主要分為兩步 二 RNA干擾的機制 第一步 起始階段 是較長dsRNA在ATP參與下被RNase 樣的特異核酸酶切割加工成21 23nt的由正義和反義鏈組成的小干擾RNA smallinterferingRNA siRNA siRNA的兩條單鏈末端為5 磷酸和3 羥基 且3 端均有2 3個突出的核苷酸 果蠅中的RNase 樣核酸酶稱為Dicer Dicer有解旋酶活性并含有dsDNA結(jié)合域和PAZ結(jié)構(gòu)域 Dicer的類似物相繼在擬南芥 秀麗線蟲及哺乳動物等機體中被發(fā)現(xiàn) 二 RNA干擾的機制 第二步 效應(yīng)階段 是siRNA在ATP參與下被RNA解旋酶解旋成單鏈 并由其中反義鏈指導(dǎo)形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體 RNA inducedsilencingcomplex RISC 活化的RISC在單鏈siRNA引導(dǎo)下識別互補的mRNA 并在RISC中的核酸內(nèi)切酶作用下從siRNA引導(dǎo)鏈中心所對應(yīng)的靶基因位置切割靶mRNA 最后可能再被核酸外切酶進一步降解 從而干擾基因表達 RNAi能高效特異的阻斷基因的表達 在線蟲 果蠅體內(nèi) RNAi能達到基因敲除的效果 RNAi的放大效應(yīng)機制 二 RNA干擾的機制 siRNA不僅可引導(dǎo)RISC切割靶RNA 而且可作為引物在RNA依賴的RNA聚合酶 RdRP 作用下以靶mRNA為模板合成新的dsRNA 新合成的長鏈dsRNA同樣可被RNase 樣核酸酶切割 降解而生成大量的次級siRNA 次級siRNA又可進入合成 切割的循環(huán)過程 進一步放大RNAi作用 這種合成 切割的循環(huán)過程稱為隨機降解性PCR randomdegradativePCR GiselaStorz Science 296 5571 1263 1265 2002 RNAi是轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默機制 RNAi具有很高的特異性 只有dsRNA才能誘導(dǎo)產(chǎn)生RNAi 只有針對編碼區(qū)的dsRNA才能產(chǎn)生有效的和特異性的干擾 注射同源dsRNA可以引起內(nèi)源性mRNA特異性的降解 RNAi抑制基因表達具有很高的效率 可達到缺失突變體表型的程度 而且相對很少量的dsRNA分子就能完全抑制相應(yīng)基因的表達 這是通過催化放大的方式進行的 二 RNA干擾的機制 RNAi干擾現(xiàn)象具有以下幾個重要的特征 二 RNA干擾的機制 RNAi抑制基因表達的效應(yīng)可以長距離傳遞和維持信號甚至傳播至整個有機體以及可遺傳給F1 但F2往往恢復(fù)為野生型 dsRNA不得短于21個堿基 大于30bp的dsRNA不能在哺乳動物中誘導(dǎo)特異的RNA干擾 而是細胞非特異性和全面的基因表達受抑和凋亡 RNAi作用迅速 mRNA快速降解 RNAi效應(yīng)的依賴性 只有連續(xù)產(chǎn)生dsRNA才能產(chǎn)生長期效應(yīng) 否則只產(chǎn)生短暫的沉默反應(yīng) RNAi干擾現(xiàn)象具有以下幾個重要的特征 三 RNA干擾的應(yīng)用 1 基因功能研究 由于RNAi具有高度的序列專一性和有效的干擾活力 可以特異地使特定基因沉默 獲得功能喪失或降低突變 因此可以作為功能基因組學(xué)的一種強有力的研究工具 已有研究表明RNAi能夠在哺乳動物中抑制特定基因的表達 制作多種表型 而且抑制基因表達的時間可以控制在發(fā)育的任何階段 產(chǎn)生類似基因敲除的效應(yīng) 與傳統(tǒng)的基因敲除技術(shù)相比 這一技術(shù)具有投入少 周期短 操作簡單等優(yōu)勢 近來RNAi成功用于構(gòu)建轉(zhuǎn)基因動物模型的報道日益增多 標(biāo)志著RNAi將成為研究基因功能不可或缺的工具 三 RNA干擾的應(yīng)用 2 病毒性疾病的治療 研究人員開發(fā)出使用RNAi技術(shù)來阻止艾滋病病毒進入人體細胞 這個研究小組設(shè)計合成的lenti病毒載體引入siRNA 激發(fā)RNAi使其抑制了HIV 1的coreceptor CCR5進入人體外周 淋巴細胞 而不影響另一種HIV 1主要的coreceptor CCR4 從而使以lenti病毒載體為媒介引導(dǎo)siRNA進入細胞內(nèi)產(chǎn)生了免疫應(yīng)答 由此治療HIV 1和其他病毒感染性疾病的可行性大大增加 艾滋病 三 RNA干擾的應(yīng)用 2 病毒性疾病的治療 Shlomai和Shaul設(shè)計了各針對HBV基因19nt的兩種pSUPER載體 pSUPERX siRNA和pSUPERcore siRNA 已轉(zhuǎn)染含1 3XwtHBV基因質(zhì)粒載體的Huh7細胞再被X siRNA或core siRNA轉(zhuǎn)染后 core蛋白水平分別降低了89 63 轉(zhuǎn)染X siRNA的細胞中HBsAg降低60 但轉(zhuǎn)染core siRNA對HBsAg表達無明顯影響 X siRNA干擾沉默了所有的病毒轉(zhuǎn)錄物 而core siRNA僅沉默3 5kb 3 9kb的mRNA HBV 三 RNA干擾的應(yīng)用 2 病毒性疾病的治療 Randall等證明了針對HCVRNA的siRNA轉(zhuǎn)染細胞4天后可使細胞質(zhì)中復(fù)制的HCVRNA降低80倍 將siRNA轉(zhuǎn)染至已有HCV感染 復(fù)制的細胞 siRNA對98 以上可檢測到HCV抗原 HCV復(fù)制活躍的細胞有抑制作用 siRNA干擾沉默HCVRNA具有劑量依賴性和序列特異性 Kapadia等也證明了siRNA特異抑制HCVRNA復(fù)制 阻止相關(guān)蛋白表達的作用 HCV 三 RNA干擾的應(yīng)用 2 病毒性疾病的治療 RNAi還可應(yīng)用于其它病毒感染如脊髓灰質(zhì)炎病毒等 siRNA已證實介導(dǎo)人類細胞的細胞間抗病毒免疫 用siRNA對Magi細胞進行預(yù)處理可使其對病毒的抵抗能力增強 在最近全世界約30個國家和地區(qū)散發(fā)或流行的嚴重急性呼吸綜合征 severeacuterespiratorysyndrome SARS 的防治研究中 RNAi也受到了重視 siRNA在感染的早期階段能有效地抑制病毒的復(fù)制 病毒感染能被針對病毒基因和相關(guān)宿主基因的siRNA所阻斷 這些結(jié)果提示RNAi能勝任許多病毒的治療 其它病毒 三 RNA干擾的應(yīng)用 3 腫瘤治療 用RNAi特異性地抑制癌基因 癌相關(guān)基因或突變基因的過度表達 使這類基因保持在靜默或休眠狀態(tài) 從而有望用這種新的手段治療各種惡性腫瘤 1 RNAi可應(yīng)用于敲除點突變激活的癌基因 2 RNAi可應(yīng)用于抑制插入基因及融合基因的表達 3 RNAi可應(yīng)用于抑制基因擴增 Li等在3個肝癌細胞系Hep3B HepG2 SNU449中對cyclinE的研究中發(fā)現(xiàn) 轉(zhuǎn)染siRNA組48h后生長抑制均達到90 而對照組無作用 3天后凋亡率分別為16 44 和3l 而對照組僅為l 三 RNA干擾的應(yīng)用 3 腫瘤治療 Survivin基因是迄今為止克隆出的最小凋亡抑制蛋白家族成員 可通過抑制caspase級鏈反應(yīng)下游的caspase3 caspase7發(fā)揮其抗凋亡作用 現(xiàn)在研究已證實survivin基因參與了肝癌的發(fā)生與發(fā)展 并且還與化療的耐藥性相關(guān) 降低survivin基因在肝癌細胞中的表達不僅可誘導(dǎo)肝癌細胞的凋亡 抑制肝癌細胞的生長 還可增強其對化療的敏感性 從而提高肝癌治療的整體療效 CHENG等通過RNAi抑制肝癌細胞SMMC7721中survivin基因的表達 使細胞株中survivin基因表達幾乎缺失 凋亡指數(shù)增加15 6 肝癌細胞生長被抑制 三 RNA干擾的應(yīng)用 3 腫瘤治療 MDR Muhidrugresistance 是腫瘤化療失敗的主要原因 形成MDR的最常見的因素是腫瘤細胞MDR基因編碼的糖蛋白過度表達 其中 MDR1對于細胞的多重耐藥性起著重要的作用 Nieth等表明 特異siRNA可以抑制MDR1基因的表達 從而顯著降低腫瘤細胞的耐藥性 PLK1基因在很多種癌癥時都呈高度表達 當(dāng)使用RNAi技術(shù)減少其表達后 所有癌細胞的PLKlmRNA和蛋白水平都有顯著降低 如MCF 7乳腺癌細胞的PLKlmRNA下降了7O 蛋白水平下降了90 而且細胞凋亡率提高了百分之幾至50不等 所以 PLK1的siRNA具有抵抗癌細胞的增殖作用 是一種治療癌癥的新途徑 三 RNA干擾的應(yīng)用 4 藥物開發(fā) 利用RNAi技術(shù)來研究藥物作用的特異性和機制對于加快藥物開發(fā)的研制速度大有益處 因為基因組研究成果和高通量的篩選技術(shù) 為更好更快發(fā)現(xiàn)藥靶和候選藥物提供了重要基礎(chǔ) 在藥物開發(fā)過程中 用RNAi技術(shù)可以對靶基因的功能進行分析 有助于搞清藥物的作用機制以及與基因編碼產(chǎn)物 及與相應(yīng)化合物的相互作用 從而更正確地發(fā)現(xiàn)藥靶 開發(fā)更有效的候選藥物 四 RNA干擾的研究方法 一般技術(shù)路線 四 RNA干擾的研究方法 siRNA的設(shè)計 1 從mRNA的AUG起始密碼開始 尋找 AA 二連序列 并記下其3 端的19個堿基序列 作為潛在的siRNA靶位點 有研究結(jié)果顯示GC含量在30 50 左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更為有效 2 將潛在的序列和相應(yīng)的基因組數(shù)據(jù)庫 人 或者小鼠 大鼠等等 進行比較 排除那些和其他編碼序列 EST同源的序列 例如使用BLAST3 選出合適的目標(biāo)序列進行合成 通常一個基因需要設(shè)計多個靶序列的siRNA 以找到最有效的siRNA序列 四 RNA干擾的研究方法 siRNA的設(shè)計 4 一個完整的siRNA實驗應(yīng)該有陰性對照 作為陰性對照的siRNA應(yīng)該和選中的siRNA序列有相同的組成 但是和mRNA沒有明顯的同源性 通常的做法是將選中的siRNA序列打亂 同樣要檢查結(jié)果以保證它和其他基因沒有同源性 5 計算機軟件輔助設(shè)計 如Rational siRNA design xls等 6 Internet資源的應(yīng)用 目前已證實的siRNA序列 四 RNA干擾的研究方法 siRNA的制備 1 化學(xué)合成siRNA是最貴的方法 但是卻是最方便的 許多公司都可以根據(jù)用戶要求提供高質(zhì)量的化學(xué)合成siRNA 主要的缺點包括價格高 定制周期長 特別是有特殊需求的 由于價格比其他方法高 為一個基因合成3 4對siRNAs的成本就更高了 比較常見的做法是用其他方法篩選出最有效的序列再進行化學(xué)合成 最適用于 已經(jīng)找到最有效的siRNA的情況下 需要大量siRNA進行研究 不適用于 篩選siRNA等長時間的研究 主要原因是價格因素 四 RNA干擾的研究方法 siRNA的制備 2 體外轉(zhuǎn)錄合成siRNA相對化學(xué)合成法而言成本比較低 是一種性價比高的篩選siRNAs的好方法 更重要的是能夠更快的得到siRNAs 體外轉(zhuǎn)錄得到的siRNAs只要較低的濃度就可以達到化學(xué)合成siRNAs較高濃度得到的效果 不足之處 實驗的規(guī)模受到限制 雖然一次體外轉(zhuǎn)錄合成能提供足夠做數(shù)百次轉(zhuǎn)染的siRNAs 但是反應(yīng)規(guī)模和量始終有一定的限制 最適用于 篩選siRNAs 特別是需要制備多種siRNAs 化學(xué)合成的價格成為障礙時 不適用于 實驗需要大量的 一個特定的siRNA 長期研究 四 RNA干擾的研究方法 3 用RNaseIII消化長片斷雙鏈RNA制備siRNA其他制備siRNA的方法的缺陷是需要設(shè)計和檢驗多個siRNA序列以便找到一個有效的siRNA 這種方法 制備一份混合有各種siRNAs 混合雞尾酒 就可以避免這個缺陷 這個方法是選擇通常是200 1000堿基的靶mRNA模版 用體外轉(zhuǎn)錄的方法制備長片斷雙鏈dsRNA 然后用RNaseIII orDicer 在體外消化 得到siRNAs 混合雞尾酒 在除掉沒有被消化的dsRNA后 這個siRNA混合物就可以直接轉(zhuǎn)染細胞 方法和單一的siRNA轉(zhuǎn)染一樣 由于siRNA混合物中有許多不同的siRNAs 通常能夠保證目的基因被有效地抑制 siRNA的制備 四 RNA干擾的研究方法 dsRNA消化法的主要優(yōu)點在于可以跳過檢測和篩選有效siRNA序列的步驟 為研究人員節(jié)省時間和金錢 不過這種方法的缺點也很明顯 就是有可能引發(fā)非特異的基因沉默 特別是同源或者是密切相關(guān)的基因 雖然現(xiàn)在多數(shù)的研究顯示這種情況通常沒有發(fā)生 最適用于 快速而經(jīng)濟地研究某個基因功能缺失的表型不適用于 長時間的研究項目 或者是需要一個特定的siRNA進行研究 特別是基因治療 siRNA的制備 四 RNA干擾的研究方法 4 利用質(zhì)?；虿《据d體表達siRNA多數(shù)的siRNA表達載體依賴3種RNA聚合酶III啟動子 polIII 中的一種 操縱一段小的發(fā)夾siRNA在哺乳動物細胞中的表達 包括的人源和鼠源的U6啟動子和人H1啟動子 之所以采用RNApolIII啟動子是由于它可以在哺乳動物細胞中表達更多的小分子RNA 而且它是通過添加一串 3到6個 U來終止轉(zhuǎn)錄的 使用這類載體 需要2段編碼短發(fā)夾RNA序列的DNA單鏈 退火 克隆到相應(yīng)載體的polIII啟動子下游 siRNA的制備 四 RNA干擾的研究方法 siRNA的制備 siRNA表達載體的構(gòu)建 四 RNA干擾的研究方法 由于涉及到克隆 這個過程需要幾天的時間 同時也需要經(jīng)過測序以保證克隆的序列是正確的 不過幸好載體容易大量擴增 這個優(yōu)點足以彌補所有缺陷 特別是當(dāng)載體在實驗中確實有效的時候 siRNA表達載體的優(yōu)點在于這是眾多方法中唯一可以進行長期研究的方法 帶有抗生素標(biāo)記的載體可以在細胞中持續(xù)抑制靶基因的表達 持續(xù)數(shù)星期甚至更久 即使是對轉(zhuǎn)染帶有篩選標(biāo)記質(zhì)粒的細胞進行瞬時篩選 也有助于富集帶質(zhì)粒的細胞 這也可以幫助解決一些難轉(zhuǎn)染的細胞由于轉(zhuǎn)染效率低造成的問題 siRNA的制備 四 RNA干擾的研究方法 開始研究逆轉(zhuǎn)錄病毒和其他病毒載體用于siRNA表達 其優(yōu)勢在于可以直接高效率感染細胞進行基因沉默的研究 避免由于質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率低而帶來的種種不便 最適用于 已知一個有效的siRNA序列 需要維持較長時間的基因沉默 或者需要用抗生素篩選能表達siRNA的細胞 適用于長期研究 不適用于 篩選siRNA序列 其實主要是指需要多個克隆和測序等較為費時 繁瑣的工作 siRNA的制備 除質(zhì)粒載體外 科研人員已經(jīng)成功地采用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體 腺相關(guān)病毒載體和慢病毒載體將表達siRNA的DNA模板序列轉(zhuǎn)移入哺乳動物細胞 現(xiàn)在許多學(xué)者正在加緊腺病毒載體的siRNA轉(zhuǎn)移研究 四 RNA干擾的研究方法 siRNA的制備 5 PCR方法制備siRNA的表達框架siRNA表達框架 siRNAexpressioncassettes SECs 是一種由PCR得到的siRNA表達模版 能夠直接導(dǎo)入細胞進行表達而無需事前克隆到載體中 這個方法最早是由Castanotto采用 包括一個RNApolIII啟動子 一段發(fā)夾結(jié)構(gòu)siRNA 一個RNApolIII終止位點 和siRNA表達載體不同的是 SECs不需要載體克隆 測序等頗為費時的步驟 可以直接由PCR得到 因此 SECs成為篩選siRNA的最有效工具 甚至可以用來篩選在特定的研究體系中啟動子和siRNA的最適搭配 四 RNA干擾的研究方法 如果在PCR兩端添加酶切位點 那么通過SECs篩選出的最有效的siRNA后 可以直接構(gòu)建siRNA表達載體 構(gòu)建好的載體可以用于穩(wěn)定表達siRNA和長期研究 主要缺點是PCR產(chǎn)物很難轉(zhuǎn)染到細胞中 如果有適合的新型轉(zhuǎn)染試劑能提高SEC的轉(zhuǎn)染效率的話 那問題就可以解決了 另外 沒有克隆到載體中的PCR片斷并不適于大規(guī)模制備 最適用于 篩選siRNA序列 在克隆到載體前篩選最佳啟動子 不適用于 長期抑制研究 如果克隆到載體后就可以了 siRNA的制備 四 RNA干擾的研究方法 siRNA的制備 5種siRNA制備方法的比較 四 RNA干擾的研究方法 siRNA的制備 5種siRNA制備方法的比較 四 RNA干擾的