色譜技術親和色譜.ppt

常見親合作用體系 1 離子強度 一般來說 提高離子強度 親和作用減弱或完成破壞 2 PH 在適當?shù)腜H下 親和結合作用較高 在其它PH下 親和作用減弱或完成破壞 3 抑制氫鍵形成的物質 脲和鹽酸胍的存在可減弱親和作用4 溫度 提高溫度 靜電作用 氫鍵 配位鍵減弱 但是 疏水性相互作用增強5 液體離子 SCN I CIO4 的存在 疏水性相互作用減弱6 螯合劑 影響配位鍵 使親和作用消失 影響親和作用的因素 利用生物分子之間的專一性識別或特定的相互作用進行分離的技術為親和分離技術親和配基是對生物分子具有專一性識別或特定的相互作用的物質 5 找與底物專一可逆結合的配基 將配基通過共價鍵偶聯(lián)到基質 配基與底物吸附 洗脫目標物 6 親和純化技術 親和層析 Affinitychromatography 親和過濾 膜分離 親和分配 雙水相萃取 親和反膠團萃取 反膠團萃取 親和沉淀 沉淀 親和電泳 電泳 配基 生物特異性配基擬生物親和配基親和配基必須具備的條件 1 專一性識別或特異性作用必須是可逆的2 結合常數(shù)要適當3 穩(wěn)定性好 可進行化學改性 專一性和特異性決定著分離純化的產品純度相互作用的強弱決定著吸附和解吸的難易程度 親和配基的分類 單專一性的小分子配基基團專一性的小分子親和配基專一性的大分子親和配基免疫親和配基基團專一性的大分子親和配基 親和配基的選擇 組合化學肽庫選擇親和配基目標肽 反義肽 組合合成 親和篩選 優(yōu)選序列噬菌體展示技術目標蛋白 可結合噬菌體 擴增 多輪篩選單克隆群體 氨基酸序列SELEX技術隨機序列 PCR擴增 特異性結合 重復篩選 親和洗脫 目標產物的洗脫方法有特異性洗脫和非特異性洗脫 特異性洗脫劑含有與親和配基或目標產物具有親和結合作用的小分子化合物 通過與親和配基或目標產物的競爭性結合 洗脫目標產物 非特異性洗脫通過調節(jié)洗脫液的pH 離子強度 離子種類或溫度等降低目標產物的親和吸附作用 親和色譜 親和層析 AffinityChromatography AC 是利用生物大分子具有對一類生物大分子特異識別和可逆結合的特性而建立起來的一種分離的色譜方法 也叫做生物親和或生物特異性親和色譜 是親和分離技術中最具優(yōu)勢的方法 親和層析的基本特點 1 純化過程簡單 迅速 且分離效率高2 特別適用于分離純化一些含量低 穩(wěn)定性差的生物大分子3 純化倍數(shù)大 產物純度高4 必須針對某一分離對象制備專一的配基及尋求穩(wěn)定的層析條件5 價格相對較昂貴 6 在洗脫中 交聯(lián)在層析介質上的配基可能脫落并進入產品中 從而造成不良影響 如抗體 染料等配基 基質的選擇理想的基質應符合下面的要求 1 極低的非特異性吸附 2 高度的親水性 3 較好的理化穩(wěn)定性 4 大量的化學基團能被有效地活化 而且容易和配體結合 5 適當?shù)亩嗫仔?一般親和吸附劑采用的基質有纖維素 聚丙烯酰胺凝膠 交聯(lián)葡聚糖 瓊脂糖 交聯(lián)瓊脂糖 多孔玻璃珠等 親和色譜介質的制備 配基的選擇 根據(jù)配體對待分離物質的親和性的不同 可以將其分為兩類 特異性配體 specificligand 和通用性配體 generalligand 特異性配體一般是指只與單一或很少種類的蛋白質等生物大分子結合的配體 如生物素和親和素 抗原和抗體 酶和它的抑制劑 激素 受體等 它們結合都具有很高的特異性 用這些物質作為配體都屬于特異性配體 配體的特異性是保證親和層析高分辨率的重要因素 但尋找特異性配體一般是比較困難的 尤其對于一些性質不很了解的生物大分子 要找到合適的特異性配體通常需要大量的實驗 通用性配體一般是指特異性不是很強 能和某一類的蛋白質等生物大分子結合的配體 如各種凝集素 lectine 可以結合各種糖蛋白 核酸可以結合RNA 結合RNA的蛋白質等 通用性配體對生物大分子的專一性雖然不如特異性配體 但通過選擇合適的洗脫條件也可以得到很高的分辨率 而且這些配體還具有結構穩(wěn)定 偶聯(lián)率高 吸附容量高 易于洗脫 價格便宜等優(yōu)點 所以在實驗中得到了廣泛的應用 20 配基的濃度 對親和勢比較低的時候 KL 10 4mol L 增加配基濃度有利于吸附 增加親和柱的長度來提高吸附率 配基濃度太高使吸附力太強 洗脫困難 理想的配基濃度為1 10 mol L 21 配基偶聯(lián)的位置 配基固定化時 其不參與親和結合的部位與載體進行偶聯(lián) 腺嘌呤N6 氨基接到載體上 對脫氫酶和甘油激酶有吸附力 磷酸基接到載體上 對甘油醛 3 磷酸脫氫酶有吸附力 22 配基分子的大小 選用大分子配基 小分子物質作為配基 載體和配基間插入一個 手臂 以消除空間障礙 親和吸附介質的配基 1 酶的抑制劑一些物質 它們并不引起酶蛋白變性 但能使酶分子上的某些必需基團 主要是指酶活性中心上的一些基團 發(fā)生變化 因而引起酶活力下降 甚至喪失 致使酶反應速度降低 能引起這類抑制作用的物質稱為酶的抑制劑 inhibitor 在生物體內蛋白酶的抑制劑可與蛋白酶的活性部位結合 抑制酶的活性 必要時保護生物組織不受蛋白酶的損害 酶的抑制劑在分子大小和形態(tài)上分布較廣 有天然的生物大分子 也有小分子化合物 2 抗體利用抗體為配基的親和層析又稱為免疫親和層析 Immunoaffinitychromatography 抗體與抗原之間具有高度特異性結合能力 結合常數(shù)一般為107 1012L mol 因此 利用免疫親和層析法 特別是以單抗為配基的免疫親和層析法是高度純化蛋白質類生物大分子的有效手段 3 A蛋白A蛋白 proteinA 為分子量約42KD的蛋白質 存在于黃色葡萄球菌 Staphylococcusaureus 的細胞壁中 占該細胞壁構成成分約5 A蛋白在確定其為蛋白質之前稱A抗原 與動物免疫球蛋白G immunogloblinG IgG 具有很強的親和結合作用 結合部位IgG分子的Fc片斷 Y字型IgG分子的主干部分 A蛋白不與抗體 IgG 的抗原結合部位結合 而且任何抗體的Fc片斷的結構都非常相似 因此A蛋白可作為各種抗體的親和配基 但不同抗體的結合常數(shù)有所不同 4 凝集素凝集素 lectin 是與糖特異性結合的蛋白質 酶和抗體除外 的總稱 大部分凝集素為多聚體 含有兩個以上的糖結合部位 不同的凝集素與糖結合的特異性不同 例如 常用做親和配基的伴刀豆球蛋白A concanavalinA conA 與葡聚糖和甘露糖的親和結合作用較強 而麥芽糖凝集素 wheatgermagglutinin WGA 與N 乙酰葡糖胺 N acetyl glucosamine 的親和結合作用較強 5 輔酶和磷酸酰苷各種脫氫酶和激酶需要在輔酶 coenzyme 的存在下表現(xiàn)其生物催化活性 即脫氫酶和激酶與輔酶之間具有親和作用 輔酶主要有輔酶 煙酰胺腺嘌呤二核苷酸 nicotinamideadeninedinucleotide NAD 輔酶 煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 NADphosophate NADP 和三磷酸腺苷 adenosinetriphosphate ATP 等 這些輔酶可用做脫氫酶和激酶的親和配基 此外 磷酸腺苷 adenosine5 monophosphate AMP 二磷酸腺苷 adenosine2 5 diphosphate ADP 的腺苷部分與上述輔酶的結構類似 與脫氫酶和激酶同樣具有親和結合作用 可用做這些酶的親和配基 6 過渡金屬離子Cu2 Ni2 Zn2 Co2 等過渡金屬離子可與N S和O等供電原子 electrondonoratom 產生配位鍵 因此可與蛋白質表面的組氨酸 His 的咪唑基 半胱氨酸 Cys 的巰基和色氨酸 Trp 的吲哚基發(fā)生親和結合作用 其中以His的咪唑基的結合作用最強 過渡金屬離子與咪唑基的結合強弱順序是Cu2 Ni2 Zn2 Co2 7 組氨酸在各種氨基酸中 組氨酸的性質比較獨特 具有弱疏水性 咪唑環(huán)為弱電性 因此組氨酸可與蛋白質發(fā)生親和結合作用 雖然這種親和作用的機理尚不十分清楚 但利用固定化組氨酸吸附蛋白質以及吸附蛋白的洗脫實驗結果表明 靜電和疏水性相互作用均有可能參與親和結合 在鹽濃度較低和pH約等于目標蛋白質等電點的溶液中 固定化組氨酸的親和吸附作用最強 隨著鹽濃度增大 親和吸附作用降低 因此利用組氨酸為配基可親和分離等電點相差較大的蛋白質 洗脫則可采用增大鹽濃度的梯度洗脫法 8 肝素肝素 heparin 是存在于哺乳動物的肝 肺 腸等臟器中的酸性多糖類物質 分子量一般為5 30KD 具有抗凝血作用 肝素與脂蛋白 脂肪酶 甾體受體 限制性核酸內切酶 抗凝血酶 凝血蛋白質等具有親和作用 可用作這些物質的親和配基 肝素的親和結合作用在中性pH和低濃度鹽溶液中較強 隨著鹽濃度的增大結合作用降低 活化基質的活化是指通過對基質進行一定的化學處理 使基質表面上的一些化學基團轉變?yōu)橐子诤吞囟ㄅ潴w結合的活性基團 溴化氰活化法溴化氰活化法是最常用的活化方法之一 活化過程主要是生成亞胺碳酸活性基團 它可以和伯氨 NH2 反應 主要生成異脲衍生物 反應如下 介質活化與耦聯(lián) 活化耦聯(lián)過程 20ml 2mol L碳酸氫鈉 20g濕瓊脂糖 冰浴4 5min 攪拌過程中加入溴化氰 4 5 10min 過濾 冷蒸餾水和緩沖液洗滌 加入溶于緩沖液中的配基 攪拌2h 4 保存 這種方法的缺點是溴化氰活化法的基質和配體偶聯(lián)后生成的異脲衍生物中氨基的pKa 10 4 所以通常會帶一定的正電荷 從而使基質可能有陰離子離子交換作用 增大了非特異性吸附 影響親和層析的分辨率 另外溴化氰活化的基質與配體結合不夠穩(wěn)定 尤其是當與小配體結合時 可能會出現(xiàn)配體脫落現(xiàn)象 另外溴化氰有劇毒 易揮發(fā) 所以操作不便 環(huán)氧基活化法在熱的濃堿溶液中 多糖類化合物與環(huán)氧氯丙烷作用生成環(huán)氧化合物 在堿性條件下 其環(huán)氧化合物又能與氨基酸或蛋白質上氨基偶聯(lián) 這種活化方法的優(yōu)點是活化后不引入電荷基團 而且基質與配體形成的N C O C和S C鍵都很穩(wěn)定 所以配體與基質結合緊密 親和吸附劑使用壽命長 而且便于在親和層析中使用較強烈的洗脫手段 另外這種處理方法沒有溴化氰的毒性 它的缺點是用環(huán)氧氯丙烷活化的基質在與配體偶聯(lián)時需要堿性條件 pH為9 13 溫度為20 40 這樣的條件對于一些比較敏感的配體可能不適用 上面兩種方法是比較常用的方法 另外還有甲苯磺酰氯法 雙功能試劑法 親和配基耦聯(lián)密度測定 耦聯(lián)密度決定了介質的吸附容量分光光度法量差法分析水解作用分析元素分析法 間臂分子 當配基的分子量較小時 將其直接固定在載體上 會由于載體的空間位阻 配基與生物大分子不能發(fā)生有效的親和吸附作用 如果在配基與載體之間連接間隔臂 可以增大配基與載體之間的距離 使其與生物大分子發(fā)生有效的親和結合 加入間臂的長度要恰當 太短則效果不明顯 太長則容易由疏水性非特異吸附造成彎曲 反而降低吸附效率 間臂的疏水性也需要考慮 應盡量減小對配基的影響 如間臂和配基疏水性較強 則效果不明顯 常見的親和色譜 核苷酸及輔酶親和色譜固定化金屬離子親和色譜染料親和色譜免疫親和色譜基團專一性大分子親和色譜 核苷酸及輔酶親和色譜 指將核苷酸 或輔酶 作為親和配基固定在色譜介質上進行親和色譜的技術 主要利用核苷酸特別是輔酶因子和蛋白質之間的專一性識別達到分離純化目的 介質制備 碳二亞胺直接法偶聯(lián)溴化氫活化瓊脂糖 連接氨基己酸 加入核苷酸 溶液中保存 洗滌 偶聯(lián)間接偶聯(lián)法間臂分子和核苷酸 活化的介質 吸附和解吸 選擇合適的緩沖液條件下吸附一般采用輔酶或鹽溶液進行梯度洗脫 固定化金屬離子親和色譜 蛋白質上的氨基酸殘基 如組氨酸的咪唑基 半胱氨酸的巰基和色氨酸的吲哚基 有利于蛋白質與固定化金屬離子結合 從而達到分離的目的 金屬離子如鋅和銅 46 將活化的介質與金屬螯合劑偶聯(lián) 再用金屬離子溶液處理制成金屬螯合親和層析柱 金屬螯合劑 亞氨二醋酸 氨基水楊酸 8 羥基喹啉 羧甲基氨基酸等 親和作用機理 靜電作用配位鍵結合共價鍵生產 鍵 吸附 采用50mmol L的金屬鹽溶液通過色譜柱 直至色譜介質吸附飽和 平衡緩沖溶液洗去未螯合的金屬離子加入適宜濃度的NaCl和選擇合適pH值有利于減少非特異性吸附 解吸 吸附蛋白質解吸的方法 改變pH值競爭性洗脫采用50 100mmol L的EDTA洗脫 可將蛋白質和金屬離子解吸 洗滌 重新上柱平衡 固定所需的金屬離子 pH與氯化銨濃度的影響 固定化親和離子色譜的應用 基因修飾蛋白質的純化遺傳修飾 具親和尾蛋白 色譜分離 親和尾切除 色譜分離 酶切位點 親和尾大小 52 染料親和色譜 有機染料具有類似于NAD 的結構 需核苷酸類物質為輔酶的酶 對染料具有一定親和力 染料共價偶聯(lián)到瓊脂糖載體上 能制得親和層析柱 染料親和層析已成功的分離純化了多種酶 染料親和色譜介質的制備 配基性質 染料結構和染料取代度是制備過程中需要考慮的主要因素 以下途徑可以實現(xiàn)制備 采用瓊脂糖凝膠 染料連接在 OH上 該過程可在一定條件下直接完成 染料也可通過活性基團和基質偶聯(lián) 該方法可引入高密度的染料 吸附蛋白質量增多 選擇親和作用力較小的染料有利于解吸 吸附與解吸 采用磷酸鹽緩沖液 在pH6 0 7 0條件下吸附常用解吸方法 增加鹽濃度改變pH值采用水溶性高聚物親和洗脫最后對雜蛋白進行變性處理 洗滌 緩沖液平衡再生介質 免疫親和色譜 抗原和抗體的作用具有高度的專一性 并且它們的結合親和力極強 因此用適當?shù)姆椒▽⒖乖蚩贵w結合到吸附劑上 便可有效地分離和純化免疫物質 特點 分離效率高 成本高 而且蛋白質親和配基不穩(wěn)定 容易降解 免疫親和色譜過程 目標蛋白質 抗體制備 上樣與洗脫 介質制備 單抗制備復雜 成本高 但