獸藥殘留樣品前處理技術

,獸藥殘留前處理技術,Pre-treatment Technology of Veterinary Drug Residue,馬勤川威海德生技術檢測有限公司,目錄,contents,01,PART,概述,Introduction,濃縮,凈化,提取,03,02,01,樣品前處理是指樣品的制備和對樣品中的待測組分進行提取、凈化和濃縮的過程。樣品前處理的目的是消除基質(zhì)干擾，保護儀器，提高檢測方法的靈敏度、選擇性、準確度、精密度。,基體復雜,各目標化合物性質(zhì)差異大,殘留濃度低,檢測限越來越嚴格,01,02,03,04,SAMPLE TYPES,獸藥殘留分析中，最常用的生物樣品是組織樣品和禽蛋，其次是奶、血液和尿液樣品。,肌肉中水分約占75%，蛋白質(zhì)（肌漿蛋白、肌原蛋白、膠原蛋白和彈性蛋白）占19%，脂肪（中性脂肪、脂肪酸和磷脂）占2.5%，糖類占1.2%，以及一些無機鹽、維生素和酶類。肌漿蛋白（肌紅蛋白、糖解酶）可溶于水，肌原蛋白（肌球蛋白、肌動蛋白）溶于濃鹽水，膠原蛋白和彈性蛋白（結(jié)締組織）在上述溶劑中均不溶。,禽蛋包括蛋黃和蛋清。蛋黃的含水量約50%、蛋白質(zhì)16.5%、脂肪33%、糖類0.2%，以及一些無機鹽、維生素和酶類（淀粉酶、脂肪酶、磷酸酶、肽酶和過氧化氫酶）。蛋清含水量達88%，蛋白質(zhì)10.5%和極少量的碳水化合物和脂肪。,與蛋清相比較，蛋黃基本上為疏水性環(huán)境，低極性藥物的殘留較多。如果需要分別測定蛋黃和蛋清中的殘留，最好將剛產(chǎn)出后的蛋分離蛋黃和蛋清，避免藥物由蛋黃向蛋清擴散。,奶中還含有大量由酪蛋白或脂蛋白構成的束膠體系，當酸化或加熱時，束膠結(jié)構解體，蛋白質(zhì)沉淀析出。非解離性的或極性較低的藥物易由血漿向奶中擴散，導致奶中殘留。與血漿樣品類似，奶中的藥物可與蛋白結(jié)合。,牛奶的含水量約87%，蛋白質(zhì)（以酪蛋白為主）為3.3%，脂肪（甘油三酯）為3.7%，糖類（乳糖）為4.7%，以及一些無機鹽、維生素和酶類（過氧化物酶、脂肪酶等）。,血液由血漿和血清組成。血漿和血清的化學成分與組織液相近，測定血漿或血清中藥物濃度，比全血更能反映作用部分藥濃的變化，測定方法一般也可互相通用。若血漿中含有抗凝劑對測定有影響，則應使用血清樣品。通常藥物在血漿中均與血漿蛋白（白蛋白、球蛋白、糖蛋白、脂蛋白）發(fā)生一定程度的結(jié)合，一些藥物的蛋白結(jié)合率甚至可達90%以上。因此在萃取之前，必須將結(jié)合態(tài)的藥物分離出來。,尿中藥物大多呈結(jié)合狀態(tài)，主要以葡萄苷酸和硫酸酯結(jié)合物存在，因此無論直接測定或萃取分離之前，都必須將結(jié)合態(tài)的藥物水解，使藥物游離處理。,尿液的主要成分是水、尿素及鹽類。在所有體液樣品中，尿樣最容易獲得，并且樣品最多，內(nèi)含藥物（母體藥物及代謝物）濃度高；正常尿液中僅含微量蛋白質(zhì)，不需要去蛋白處理。,02,PART,樣品預處理,Sample Pretreatment,常用的結(jié)合物水解的方法有酸水解和酶水解,藥物在體內(nèi)經(jīng)第二相代謝反應之后，常形成葡萄糖苷酸、硫酸酯及磷酸酯等結(jié)合物。以結(jié)合狀態(tài)存在的藥物多存在于尿中，但也存在于肝臟、肌肉及血液中。,Lorem ipsum dolor sit amet consectetur adipisicing elit,酸水解,有的藥物的結(jié)合物則必須采取較劇烈的條件，如加入3 mol/L鹽酸溶液后還必須煮沸1h，水解后的樣品呈強酸性，必要時可用堿液調(diào)整pH后再進行萃取。,酸水解通常使用無機酸（鹽酸），至于加入鹽酸的濃度、酸化時間以及是否需要加熱等，隨藥物性質(zhì)而異，但最終應通過實驗確定。,酶水解,-葡糖苷酸酶可專門水解藥物的葡萄糖醛酸苷，芳基硫酸酯酶和磷酸酯酶分別水解藥物的硫酸酯和磷酸酯。也可用幾種酶的混合物，將生物樣品中藥物的葡萄糖醛酸酐及硫酸酯同時水解。,酶水解是專屬性很強的水解結(jié)合物的方法。通常使用的水解酶是-葡糖苷酸酶、芳基硫酸酯酶、磷酸酯酶等。,蛋白質(zhì),生物樣品如肝臟、腎臟、血漿等含有大量的蛋白質(zhì)，它們能結(jié)合藥物，因此對于某些藥物檢測，必須先將與蛋白質(zhì)結(jié)合的藥物游離之后再作進一步處理。,除蛋白過程是將蛋白質(zhì)變性處理后，把與蛋白質(zhì)結(jié)合的藥物解離出來，離心分離出去蛋白。通常除蛋白的方法是在含蛋白樣品中加入適當?shù)某恋韯┗蜃冃詣沟鞍踪|(zhì)脫水而沉淀（如有機溶劑、中性鹽），有的是由于和蛋白質(zhì)形成不溶性鹽而析出（如一些酸類：三氯乙酸、高氯酸、磷酸、苦味酸）,去蛋白原理,有機溶劑沉淀劑,甲醇與蛋白形成絮狀沉淀易于離心分離，得到澄清的上清液；乙腈與蛋白形成致密沉淀，易離心除去，沉淀效率較甲醇高。使用時應加入足量的沉淀劑，通常加入量為樣品體積的1.52倍。,酸沉淀劑,常用的酸性沉淀劑有三氯乙酸和高氯酸，其它還有鎢酸、鉬酸、磷鎢酸、磷鉬酸和苦味酸等。酸性沉淀劑能同蛋白質(zhì)的陽離子形成不溶性鹽而沉淀，必要的條件是溶液的pH要低于蛋白的等電點。,LOREM IPSUM,一些無機鹽如硫酸銨、硫酸鈉和氯化鈉等，能使蛋白質(zhì)膠體脫水并中和其電荷，使蛋白質(zhì)失去膠體性而沉淀下來。無機鹽中以硫酸銨最常用。,鹽沉淀劑,03,PART,提取與凈化,Extraction & Cleanup,提取凈化方法,液-液萃取,基質(zhì)固相分散技術,超臨界流體萃取,固相微萃取,免疫親和色譜,固相萃取,04,01,02,03,通過萃取可將被測組分自大量內(nèi)源性物質(zhì)中分離出來，減少雜質(zhì)對測定的干擾,操作簡單快速、經(jīng)濟實用,可一次進行多個樣品的萃取,可將萃取液蒸發(fā)，使組分富集,經(jīng)典,溶劑的極性,1,根據(jù)相似相溶原理，極性組分易溶于極性溶劑，反之亦然，應根據(jù)被測組分的極性選擇相似極性的溶劑,2,溶劑的沸點,萃取分離后的有機相通常需要旋蒸至干，因此萃取溶劑的沸點就不應接近或高于水的沸點，否則揮發(fā)困難,3,溶劑的毒性,使用對人體有害的萃取溶劑時，應在通風櫥內(nèi)進行,4,與水的互溶性,有的溶劑如乙醚，萃取后可混入大約1.2%的水分，因此伴隨帶入一些水溶性雜質(zhì),液-液萃取常用的有機溶劑有甲醇、乙腈、丙酮、氯仿、二氯甲烷、四氯化碳、乙醚、叔丁基甲醚、乙酸乙酯、苯、甲苯、正己烷。,陽離子藥物,陰離子藥物,陽離子藥物配對的離子對試劑則為陰離子，其中以烷基磺酸類（RSO3H）為最常用，實際起配對作用的是其陰離子（RSO3-），R為烷基，其碳鏈越長，生成的離子對絡合物脂溶性越高。,一些酸性或堿性較強的有機藥物在體液中呈離解狀態(tài)，成為親水性較強的帶電離子，即使控制pH也不能抑制它們的電離，不能用有機溶劑將其自體液中提取出來。,陰離子藥物配對的離子對試劑主要為烷基季銨類化合物，可用通式R4N+X-表示，X-可為酸根或氫氧根，R為烷基。烷基碳鏈長度常用C4C12，甚至可選用C20，碳鏈越長，則生成的離子對絡合物的脂溶性越高。,固相萃取是一種基于色譜分離的樣品前處理方法。固相萃取包括固相（具有一定官能團的固體吸附劑）和液相（樣品及溶劑）。液體樣品在正壓、負壓或重力的作用下通過裝有固體吸附劑的固相萃取裝置。由于固體吸附劑具有不同的官能團，能將特定的化合物吸附并保留在SPE柱上。,吸附目標物,吸附雜質(zhì),基質(zhì)分散固相萃?。∕SPD，matrix solid-phase dispersion），其原理是將涂漬有C18等多種聚合物的擔體固相萃取材料與樣品一起研磨，得到半干狀態(tài)的混合物并將其作為填料裝柱，然后用不同的溶劑淋洗柱子，將各種待測物洗脫下來。其優(yōu)點是濃縮了傳統(tǒng)的樣品前處理中的樣品勻化、組織細胞裂解、提取、凈化等過程，不需要進行組織勻漿、沉淀、離心、pH調(diào)節(jié)和樣品轉(zhuǎn)移等操作步驟，避免了樣品的損失。,超臨界流體具有類似氣體的較強穿透力和類似于液體的較大密度和溶解度，具有良好的溶劑特性，可作為溶劑進行萃取、分離單體。,固相微萃取（SPME）與固相萃取原理相似，其基本原則也是“相似相溶原理”，主要依據(jù)分析物質(zhì)的分子量（揮發(fā)性）與極性。纖維頭上的薄膜由極性的聚丙烯酸酯、聚乙二醇，或非極性的聚二甲硅氧烷組成。,04,PART,實例分析,Analysis of Example,進出口動物源食品中克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇和特布他林殘留量的測定 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法,-受體激動劑是指含氮激素中的苯乙胺類藥物。苯乙胺類藥物具有苯乙醇胺結(jié)構母核，苯環(huán)上連接有堿性的-羥胺（腫胺）側(cè)鏈。按照苯環(huán)上取代基的差異，可將PEAs分為苯胺型和苯酚型。,稱取5g試樣，添加50L內(nèi)標工作液，加入20mL乙酸銨緩沖溶液（pH5.2），均質(zhì)1min,8000r/min離心5min，收集上清液，加入20mL正己烷，振蕩脫脂,加入40L-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶，混勻，37酶解16h。,12000r/min離心5min，下層水相過濾，待凈化,01,02,03,04,依次用3 mL甲醇、3mL水和3mL 0.1mo