多肽類藥物的研究進(jìn)展與發(fā)展方向

多肽類藥物的研究進(jìn)展與發(fā)展方向, 多肽是一類在氨基酸構(gòu)成及其連接方式上與蛋白質(zhì)相同, 但在某些性質(zhì)方面又有別于蛋白質(zhì)的物質(zhì), 如其空間結(jié)構(gòu)較簡單、穩(wěn)定性較高、免疫原性較低或無免疫原性等。所有生物細(xì)胞都能合成多肽, 同時(shí), 也受各種多肽的調(diào)節(jié)。多肽作為藥物和健康產(chǎn)品開發(fā)較多, 并且已經(jīng)形成了一定的產(chǎn)業(yè)化規(guī)模。,自1953年人工合成了第一個(gè)有生物活性的多肽 催產(chǎn)素以后，20世紀(jì)50年代都集中于腦垂體所分泌的各種多肽激素的研究。60年代，研究的重點(diǎn)轉(zhuǎn)移到控制腦垂體激素分泌的各種多肽激素的研究。 70年代，神經(jīng)肽的研究進(jìn)入高潮。生物胚層的發(fā)育淵源關(guān)系表明，很多腦活性肽也存在于腸胃組織中，從而推動(dòng)了腸胃激素研究的進(jìn)展。,1 多肽藥物的主要功能及重要性,肽具有極強(qiáng)的活性和多樣性。肽在生物體內(nèi)作為神經(jīng)遞質(zhì)，傳遞信息。肽在生物體內(nèi)作為載體和運(yùn)輸工具，將人們平常所食的營養(yǎng)物質(zhì)輸送到人體各個(gè)部位，充分發(fā)揮營養(yǎng)物質(zhì)功能。肽不僅能提供人體生長發(fā)育所需的營養(yǎng)物質(zhì)，而且具有特殊的生物學(xué)功能，可防治血栓、高血脂、高血壓，延緩衰老，抗疲勞，提高機(jī)體免疫力，促進(jìn)人體對蛋白質(zhì)、維生素、氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)和鈣、鐵、鋅、鎂、銅等多種有益的微量元素的吸收。,2 多肽類藥物的分類,按來源分生化藥物 來源于動(dòng)植物有機(jī)體基因工程藥物 來源于基因工程菌表達(dá)生產(chǎn)的藥物習(xí)慣分法多肽生化藥物、細(xì)胞生長因子、抗體藥物、抗菌肽、酶類藥物,2.1 生化類藥物,多肽類激素、多肽抗生素：消化道多肽、下丘腦多肽、腦多肽、激肽等；動(dòng)、植物蛋白。酶類與輔酶類藥物：蛋白水解酶類、凝血酶及抗栓酶，輔酶Q10等。,多肽類激素是機(jī)體的特定腺體合成并釋放的一種物質(zhì)，通過與遠(yuǎn)程敏感細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞表面的受體相互作用而使靶細(xì)胞發(fā)生變化。主要包括垂體多肽激素、下丘腦多肽激素、甲狀腺多肽激素、胰島多肽激素、腸胃道多肽激素和胸腺多肽激素等。,多肽類生化藥物功能特性調(diào)節(jié)各種各樣的生理活動(dòng)和生化反應(yīng)；生物活性高；分子小，結(jié)構(gòu)易于改造；許多活性多肽都是由無活性的蛋白質(zhì)前體經(jīng)酶加工剪切轉(zhuǎn)化而來,2.2 基因工程藥物,激素類及神經(jīng)遞質(zhì)類藥物：人生長激素釋放抑制因子，人胰島素，人生長激素細(xì)胞因子類藥物：人干擾素，人白細(xì)胞介素，集落刺激因子，促紅細(xì)胞生成素酶類及凝血因子類藥物：單克隆抗體、疫苗、基因治療藥物、白介素、生長因子、內(nèi)啡肽、反義藥物、人生長激素、促紅細(xì)胞生成素、腫瘤壞死因子等。,2.2.1 細(xì)胞生長因子,細(xì)胞因子是多種細(xì)胞所分泌的能調(diào)節(jié)細(xì)胞生長分化、調(diào)節(jié)免疫功能、參與炎癥發(fā)生和創(chuàng)傷愈合等小分子多肽的統(tǒng)稱。大多數(shù)細(xì)胞因子作用于或產(chǎn)生于構(gòu)成免疫與炎癥系統(tǒng)的白細(xì)胞。白細(xì)胞包括所有的有核血細(xì)胞，是免疫細(xì)胞的基本構(gòu)成。通過滅活或者破壞異源物質(zhì)而發(fā)揮保護(hù)機(jī)體的功能。某些白細(xì)胞也具有識別和破壞自身變異細(xì)胞的能力。,作用特點(diǎn),絕大多數(shù)細(xì)胞因子是低分子量（1530kDa）的蛋白或糖蛋白。高效能作用：細(xì)胞因子可以自分泌、旁分泌、或內(nèi)分泌的方式發(fā)揮作用。一種細(xì)胞可產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，不同類型的細(xì)胞也可產(chǎn)生一種或幾種相同的細(xì)胞因子。多重調(diào)節(jié)作用（多效性/重疊性）：主要與調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫應(yīng)答、造血功能和炎癥反應(yīng)有關(guān)，還具有其他調(diào)節(jié)功能。與激素、神經(jīng)肽、神經(jīng)遞質(zhì)共同組成細(xì)胞間信號分子系統(tǒng)。,2.2.2 抗體藥物,抗體是機(jī)體在抗原性物質(zhì)的刺激下所產(chǎn)生的一種免疫球蛋白，能與細(xì)菌、病毒或毒素等異源性物質(zhì)結(jié)合而發(fā)揮預(yù)防、治療疾病作用。第一代抗體藥物 動(dòng)物多價(jià)抗血清第二代抗體藥物 利用雜交瘤技術(shù)制備的單克隆 抗體及其衍生物第三代抗體藥物 基因工程抗體,基因工程抗體特點(diǎn),可降低甚至消除人體對抗體的排斥反應(yīng)；分子量較小，可部分降低抗體的鼠源性，更有利于穿透血管壁，進(jìn)入病灶核心部位；可制備新型抗體；可采用多種表達(dá)形式，大量表達(dá)抗體分子，從而降低生產(chǎn)成本。,2.3 多肽抗生素,多肽抗生素是指分子量在10kDa以下，具有某種抗菌活性的多肽類物質(zhì)。特點(diǎn)：以物理的方式作用于細(xì)菌細(xì)胞膜，使細(xì)胞膜穿孔，細(xì)胞質(zhì)外溢而達(dá)到殺菌的目的。膜通道的形成能力對抗菌肽的活性起決定性作用。只對原核生物細(xì)胞產(chǎn)生特異性的溶菌活性，對最低等的真核生物及某些植物的原生質(zhì)體、某些腫瘤細(xì)胞等也有一定的殺傷力，而對人體正常的細(xì)胞無損傷作用。,3 多肽藥物的合成方法,多肽的合成主要有兩條途徑:化學(xué)合成和生物合成。化學(xué)合成主要通過氨基酸縮合反應(yīng)來實(shí)現(xiàn)。多肽的化學(xué)合成有固相合成和液相合成之分,其主要的區(qū)別在于是否使用固相載體。,多肽液相合成主要有逐步合成和片段組合兩種策略,逐步合成簡潔迅速,被用于各種生物活性多肽片段的合成;片段組合法為合成含100個(gè)以上氨基酸的多肽提供了最有前途的路線,并已成功地合成了多種有生物活性的多肽,其最大的特點(diǎn)是易于純制。在生物合成多肽方面,除了常用的發(fā)酵法、 酶解法外,隨著生物工程技術(shù)的發(fā)展, DNA 重組技術(shù)也被應(yīng)用于合成多肽。,3.1 氨基酸的羧內(nèi)酸酐法,氨基酸的羧內(nèi)酸酐是氨基酸的一種衍生物,它的氨基保護(hù)基也活化羧基。NCA法屬于陰離子開環(huán)聚合機(jī)理,其引發(fā)劑可選用多種親核試劑或堿類。采用NCA法合成多肽的基本反應(yīng)包括:在堿性條件下, 氨基酸陰離子進(jìn)攻NCA形成較為穩(wěn)定的氨基甲酸根離子,在酸化時(shí)該離子失去二氧化碳生成二肽。生成的二肽又進(jìn)攻其它的NCA,如此反復(fù)進(jìn)行下去。NCA法具有合成周期短、操作簡單、成本較低、產(chǎn)物分子量高等優(yōu)點(diǎn), 在目前多肽合成中所占比例較大,技術(shù)也較為通用。但是, 采用NCA逐步法只能合成短鏈多肽片段。,3.2 液相分段合成法,液相分段合成法是多肽片段在溶液中依據(jù)其化學(xué)專一性或化學(xué)選擇性,自發(fā)連接成長肽的合成方法,其優(yōu)點(diǎn)是能得到長肽,但技術(shù)還不完善。常用的連接技術(shù)主要有: 天然化學(xué)連接、化學(xué)區(qū)域選擇連接、可去除輔助基連接、光敏感輔助基連接、施陶丁格連接和正交化學(xué)連接。,3.3 組合化學(xué)法,組合化學(xué)法是20世紀(jì)80年代在固相多肽合成的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。它將氨基酸的構(gòu)建單元按某種組合方式連接起來,合成出包含大量化合物的化學(xué)庫, 并從中篩選出具有某種物理、 化學(xué)或藥理活性化合物的一套合成策略和篩選方案。與傳統(tǒng)合成方法不同的是, 傳統(tǒng)合成方法一次只合成一種化合物,而組合化學(xué)法可同時(shí)合成多種化合物。,3.4 酶解法,用酶解法合成多肽,又稱酶法多肽,就是用生物酶降解蛋白質(zhì),將動(dòng)植物大分子蛋白質(zhì)降解成小分子活性多肽。酶解蛋白質(zhì)所用的酶,大多數(shù)是肽酶類。近年來，人們運(yùn)用酸、堿降解蛋白質(zhì)獲得多肽收獲甚微,固定投資大,周期長,污染嚴(yán)重,風(fēng)險(xiǎn)大,未能實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。,酶法多肽具有以下優(yōu)點(diǎn): 酶解不降低蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價(jià)值,可獲得比原食品蛋白質(zhì)更多的功能; 可保持多肽營養(yǎng)純天然綠色屬性,不含任何化學(xué)物質(zhì)等。但酶解得到的是一系列多肽, 分離純化難度較大, 因此不適于合成單一的多肽。另外,肽酶的催化具有專一性,因此,尋找合適的肽酶也是該方法的一個(gè)難點(diǎn)。,3.5 基因工程法,DNA 重組技術(shù)的誕生為合成序列確定的多肽奠定了基礎(chǔ),即可通過設(shè)計(jì)合適的DNA 模板來控制多肽的序列。利用DNA 重組技術(shù),可以通過重組 DNA 產(chǎn)生的工程菌來大量高效地合成多種生物活性多肽。基因工程法合成多肽具有表達(dá)定向性強(qiáng)、產(chǎn)品安全衛(wèi)生、原料來源廣泛等優(yōu)點(diǎn),可以得到質(zhì)量高療效好且具有天然活性的多肽類藥物, 但存在高效表達(dá)等技術(shù)難題,分離困難, 產(chǎn)率低, 成本昂貴, 難以用于大規(guī)模生產(chǎn)。,4 多肽藥物研究的主要類型,對于多肽藥物的研究依據(jù)不同用途或靶向目標(biāo)，可分為9大類，主要包括多肽疫苗、抗腫瘤多肽、抗病毒多肽、多肽導(dǎo)向藥物、細(xì)胞因子模擬肽、抗菌性活性肽、用于心血管疾病的多肽、其他藥用小肽、診斷用多肽等。,4.1多肽疫苗,和核酸疫苗一樣，多肽疫苗是目前疫苗研究領(lǐng)域內(nèi)備受關(guān)注的研究方向之一。這里主要介紹合成多肽疫苗、多抗原肽疫苗、脂肽疫苗。,合成多肽疫苗(synthetic peptide vaccine)就是用化學(xué)合成抗原表位氨基酸序列法制備而成的具有保護(hù)性作用的類似天然抗原決定簇的多肽疫苗。這種疫苗不含核酸，是最為理想的安全新型疫苗，也是目前研制預(yù)防和控制感染性疾病和惡性腫瘤的新型疫苗的主要方向之一。,多抗原肽疫苗(multiple antigen peptide，MAP)是將病原微生物蛋白表面的多種T細(xì)胞或B細(xì)胞表位的氨基酸連接于樹枝狀的多聚賴氨酸骨架上而形成的一種具有獨(dú)特三維空間結(jié)構(gòu)的大分子疫苗。主要具有抗HIV-1、V3、抗裂體吸蟲、脂多糖結(jié)合蛋白能模擬抗原位置等作用，在很大程度上促進(jìn)了多抗原肽疫苗的發(fā)展。,脂肽疫苗( lipopeptide vaccines) 是最近10多年來才開發(fā)出的一種多肽疫苗, 它是將具有佐劑活性的脂質(zhì)分子共價(jià)連接于抗原多肽鏈而制備成的。這種疫苗不需其它佐劑就能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生廣泛的免疫應(yīng)答,而且沒有佐劑的副作用, 是一種很有應(yīng)用前景的疫苗設(shè)計(jì)方法。例如, 用脂肽 P3C核心作為內(nèi)源性佐劑, 將蛋白的T 細(xì)胞表位和 B 細(xì)胞表位與水溶性的脂肽P3C 通過肟鍵連接制成四分枝的聚肟疫苗( polyoxime vaccine) ,在沒有任何外源性佐劑的情況下即具有良好的免疫原性。,4.2 抗腫瘤多肽,腫瘤的發(fā)生是多種原因綜合作用的結(jié)果，但最終都要涉及到癌基因的表達(dá)調(diào)控。不同的腫瘤產(chǎn)生時(shí)所需要的酶等調(diào)控因子不同?，F(xiàn)在已發(fā)現(xiàn)很多腫瘤相關(guān)基因及腫瘤產(chǎn)生調(diào)控因子，篩選與這些靶點(diǎn)特異結(jié)合的多肽，已成為尋找抗癌藥物的新熱點(diǎn)。小分子多肽不僅廣泛存在于自然界，也可通過人工方法合成，在腫瘤的臨床治療上有重要的價(jià)值。美國科學(xué)家發(fā)現(xiàn)了一種含6個(gè)氨基酸的小肽能在體內(nèi)顯著抑制包括肺、胃及在大腸腺癌等腺癌的生長，為治療這一死亡率很高的惡性腫瘤開辟了一條新的途徑。,4.3 抗病毒多肽,病毒感染后一般要經(jīng)過吸附(宿主細(xì)胞)、穿入、脫殼、核酸復(fù)制、轉(zhuǎn)錄翻譯、包裝等多個(gè)階段。阻止以上任意過程的進(jìn)行均可防止病毒復(fù)制，而最有效的抗病毒藥物是作用在病毒吸附及核酸復(fù)制2個(gè)階段，因此篩選抗病毒藥物主要考察藥物的抗病毒吸附和復(fù)制能力。病毒通過與宿主細(xì)胞上的特異受體結(jié)合吸附細(xì)胞，依賴其自身的特異蛋白酶進(jìn)行蛋白加工及核酸復(fù)制。因此可從肽庫內(nèi)篩選與宿主細(xì)胞受體結(jié)合的多肽或能與病毒蛋白酶等活性位點(diǎn)結(jié)合的多肽，用于抗病毒的治療。,4.4 多肽導(dǎo)向藥物,傳統(tǒng)的抗癌藥物在腫瘤治療過程中通過血液循環(huán)，化學(xué)藥物在體內(nèi)擴(kuò)散后分布于身體各個(gè)臟器，并且藥物的選擇性差，在殺死病變細(xì)胞同時(shí)也攻擊正常細(xì)胞，產(chǎn)生很大的毒副作用。很多毒素(如綠膿桿菌外毒素)、細(xì)胞因子(如白細(xì)胞介素系列)等均有較強(qiáng)的腫瘤細(xì)胞毒性，如果長期或大量使用時(shí)，它亦可以損傷正常細(xì)胞，給機(jī)體帶來了很大的副作用，影響對腫瘤的治療效果。針對上述缺點(diǎn)，科學(xué)家開展了靶向藥物的研究。利用特異性作用于腫瘤組織或器官的結(jié)合分子能解決這個(gè)問題，從而改善抗癌藥物的傳遞系統(tǒng)，提高藥物導(dǎo)向的特異性，實(shí)現(xiàn)治療的針對性和安全性。,4.5 細(xì)胞因子模擬肽,細(xì)胞因子是由免疫系統(tǒng)細(xì)胞以及其他類型細(xì)胞主動(dòng)分泌的一類小分子量的可溶性蛋白質(zhì)，包括淋巴因子、干擾素、白介素、腫瘤壞死因子、趨勢化因子和集落刺激因子等。它是免疫系統(tǒng)細(xì)胞間以及免疫系統(tǒng)細(xì)胞與其他類型細(xì)胞間聯(lián)絡(luò)的核心，能改變分泌細(xì)胞自身或其他細(xì)胞的行為或性質(zhì)，通過與細(xì)胞特異的膜受體而起作用。利用已知細(xì)胞因子的受體從肽庫內(nèi)篩選細(xì)胞因子模擬肽，成為近年來國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。現(xiàn)已經(jīng)篩選出的肽類小分子模擬物主要包括競爭性結(jié)合受體和非競爭性結(jié)合受體2種類型的模擬肽。國外已篩選到人促紅細(xì)胞生成素、人促血小板生成素、人生長激素等多種生長因子的模擬肽。,4.6 抗菌性活性肽,昆蟲在受到微生物或其他外源物質(zhì)的浸染時(shí)，血淋巴會(huì)產(chǎn)生相當(dāng)數(shù)量的抗菌蛋白或抗菌肽，這些肽類物質(zhì)主要是由脂肪體合成后分泌到血淋巴中，是一種十分有效的防御機(jī)制，可用來迅速殺死或清除外源的微生物。很多抗菌肽不僅有很強(qiáng)的抗菌、殺菌能力, 而且還能殺死腫瘤細(xì)胞。,4.7 用于心血管疾病的多肽,很多植物中藥有降血壓、降血脂、溶血栓等作用，不僅可用作藥物，亦可用作保健食品。但由于其作用成分不能確定，其應(yīng)用受到很大限制。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道多肽在心血管牛理和病理活動(dòng)的調(diào)常和信號傳導(dǎo)中發(fā)揮著不可替代的作用，是一種診斷、預(yù)防和治療心血管疾病的有效方法?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)很多有效成分是小分子多肽，比如我國科學(xué)家從大豆內(nèi)加工分離出的活性多肽，可通過小腸直接吸收，能防治血栓、高血壓和高血脂，還能延緩變老，提高肌體免疫力。從人參、茶葉、銀杏葉等植物內(nèi)也分離出很多用于心血管疾病的小肽。,4.8 其他藥用小肽,許多生理必需的調(diào)節(jié)因子都是很小的肽類，生物技術(shù)的發(fā)展也促進(jìn)了大量小分子肽藥物的出現(xiàn)，使得小分子肽藥物變得越來越重要。除上述幾大方面已取得較大進(jìn)展外，在其他很多領(lǐng)域也取得一些進(jìn)展。如某種合成肽能促進(jìn)傷口血管的再生，加速皮膚深度傷口的愈合。另外2種合成肽能抑制破骨細(xì)胞對骨質(zhì)的重吸收。,4.9 診斷用多肽,多肽最主要的用途是用作抗原檢測病毒、細(xì)胞、支原體、螺旋體等微生物和囊蟲、錐蟲等寄生蟲的抗體，多肽抗原比天然微生物或寄生蟲蛋白抗原的特異性強(qiáng)，且易于制備，因此裝配的檢測試劑，其檢測抗體的假陰性率和本底反應(yīng)都很低，易于臨床應(yīng)用?，F(xiàn)在用多肽抗原裝配的抗體檢測包括：甲、乙、丙、庚肝病毒、艾滋病病毒、單純皰疹病毒、風(fēng)疹病毒、梅毒螺旋體、囊蟲、錐蟲、萊姆病及類風(fēng)濕等。使用的多肽抗原大部分是從相應(yīng)致病體的天然蛋白內(nèi)分析篩選獲得，有些是從肽庫內(nèi)篩選的全新小肽。,5 多肽藥物給藥途徑的研究,多肽類藥物相對于一般的西藥來說穩(wěn)定性較差, 其穩(wěn)定性易受溫度、 pH值等的影響,在體內(nèi)易降解,半衰期短。這些特殊性使得該類藥物的主要臨床應(yīng)用劑型為注射劑,但是注射劑, 尤其是對于胰島素等需頻繁給藥的藥物來說, 不僅患者的依從性差,并且副作用也大。因此,相對于注射制劑,蛋白質(zhì)多肽類藥物的口服、 經(jīng)呼吸道以及經(jīng)皮膚或黏膜給藥制劑更具優(yōu)越性。,5.1 口服給藥途徑,胃腸道對多肽類藥物的低吸收及其中的酶對藥物的降解是口服給藥面臨的兩個(gè)最大障礙。因此,尋找合適的吸收位點(diǎn),避免胃腸道的酶降解作用以及肝臟的首過效應(yīng)是解決問題的關(guān)鍵。除對藥物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行化學(xué)修飾,加入吸收促進(jìn)劑、酶抑制劑等方法外,脂質(zhì)體、微囊、 微球、納米粒、乳劑等微粒給藥系統(tǒng)也可有效地促進(jìn)藥物經(jīng)胃腸道吸收入血液循環(huán),提高多肽類藥物口服的生物利用度。,5.2 呼吸道給藥途徑,制備蛋白質(zhì)多肽