《發(fā)酵大題范圍》PPT課件.ppt

參數(shù)檢測 例 鳥苷生產(chǎn) 在鳥苷發(fā)酵中 發(fā)現(xiàn)發(fā)酵到40小時后鳥苷合成速率下降 但糖耗速率并未下降 而且由于耗糖 使發(fā)酵過程pH下降 補入氨水增多 那么糖耗到哪里去了呢 于是進行以下一些測定與分析 什么因素導致pH下降 測定以下中間物 發(fā)酵后期丙酮酸積累 2 氨基酸的積累在有機酸分析的基礎上進一步通過HPLC測定發(fā)酵過程中不同時間發(fā)酵液中氨基酸 結果發(fā)現(xiàn)總氨基酸積累并且其積累晚于有機酸和 NH4 積累 氨基酸成分分析表明 初始發(fā)酵液中谷氨酸濃度比較高 其它氨基酸濃度都較低 隨著發(fā)酵過程的進行谷氨酸很快被用于菌體合成 在8小時之前已經(jīng)降到很低水平 并始終維持在低水平 而在48小時左右丙氨酸開始出現(xiàn)明顯的積累 發(fā)酵液中積累量達到初始量的12 6倍之多 其它十余種氨基酸濃度則變化不大 并且在整個發(fā)酵過程中都維持在較低水平 因此 丙氨酸濃度變化可能是導致代謝流遷移所致 3 分析原因發(fā)酵過程中積累的氨基酸主要是丙氨酸 而丙氨酸的合成可以直接由丙酮酸轉(zhuǎn)化而來 因此可以推斷由于EMP途徑代謝流的增加造成了丙酮酸的積累 丙酮酸隨后轉(zhuǎn)化為丙氨酸丙氨酸本身又會對谷氨酸合成酶 GS 造成反饋抑制和阻遏 使產(chǎn)苷速率降低 惡性循環(huán) 二 代謝流遷移的酶學證明糖代謝途徑關鍵酶糖酵解途徑 EMP 在糖酵解途徑中有兩個不可逆的步驟的酶 磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶磷酸果糖激酶的時序分析 12小時時由于生長處于對數(shù)生長初期 代謝活力較低 所以PFK的活力相對較低 24小時后隨著發(fā)酵過程進入平穩(wěn)產(chǎn)物形成期和細胞生長期 磷酸果糖激酶的活力也基本保持平穩(wěn) 但是到40小時以后 鳥苷形成速率減慢甚至停止 同時觀察到氨基酸和有機酸積累 PFK相對酶活增加 這表明此時通過EMP途徑的糖代謝通量已有了明顯的增加 丙酮酸激酶時序分析 丙酮酸激酶沒有表現(xiàn)出明顯的酶活增加 而是在24小時就基本上達到其最大值 隨后維持在恒定的水平 這表明在糖代謝時EMP途徑代謝流增加中丙酮酸激酶所起的作用不大 不是造成代謝流遷移的主要因素 磷酸戊糖途徑 HMP 關鍵酶 磷酸戊糖途徑中主要的限速酶是6 磷酸葡萄糖脫氫酶 該酶催化6 磷酸葡萄糖脫氫生成6 磷酸葡萄糖酸內(nèi)酯 6 磷酸葡萄糖脫氫酶時序分析 由圖可以看到 早期6 磷酸葡萄糖脫氫酶活力很高 這可能是前期菌體合成代謝比較活躍 通過HMP途徑合成用于細胞成分的核酸等組成物質(zhì) 隨后基本不變 從而保持EMP和HMP途徑通量的平衡 此時穩(wěn)定持續(xù)的形成產(chǎn)物 但是到40小時后 6 磷酸葡萄糖脫氫酶已經(jīng)表現(xiàn)出明顯的下降趨勢 并且隨著后期發(fā)酵過程的進行而持續(xù)下降 根據(jù)物料平衡原則 有可能糖代謝在HMP途徑通量下降而EMP途徑通量增加 三羧酸 TCA 循環(huán)的關鍵酶 三羧酸循環(huán)是 消耗 丙酮酸的途徑 三羧酸流量大丙酮酸不會積累 三羧酸循環(huán)中的關鍵酶為檸檬酸合成酶 其催化乙酰輔酶A與草酰乙酸縮合形成檸檬酸 是三羧酸循環(huán)的啟動步驟 也是三羧酸循環(huán)中的主要控制點 由檸檬酸合成酶所催化的反應是三羧酸循環(huán)中的第一個限速步驟 檸檬酸合成酶時序分析 從圖可以看到 TCA循環(huán)的關鍵酶檸檬酸合成酶在整個發(fā)酵過程中 尤其是在后期產(chǎn)苷速率下降的過程中都維持比較平穩(wěn)的水平 這表明在發(fā)酵過程后期所發(fā)生的代謝流遷移時 TCA循環(huán)的通量并沒有發(fā)生明顯的增加 即代謝流遷移發(fā)生在EMP和HMP之間 主要是由于EMP和HMP途徑之間的分配平衡被打破所造成的 EMP途徑代謝流的增加造成了一種代謝流的溢流現(xiàn)象 丙氨酸脫氫酶的時序分析 在發(fā)酵中后期 丙氨酸脫氫酶活力出現(xiàn)了明顯的增加 丙氨酸脫氫酶催化由丙酮酸生成丙氨酸 該酶活性增加與丙酮酸和丙氨酸的時序增加相吻合 這些數(shù)據(jù)表明代謝流的溢流現(xiàn)象發(fā)生在檸檬酸合成酶之前的丙酮酸節(jié)點 通過丙氨酸脫氫酶生成丙氨酸 從而緩解了EMP途徑代謝流增加造成的代謝不平衡 結果加入EMP途徑的抑制劑 克服了代謝流遷移的問題 提高了鳥苷的產(chǎn)量 基因工程菌 三 基因不穩(wěn)定性 生產(chǎn)的目標是得到最大量的外源蛋白 但是大量外源蛋白的形成對宿主細胞是有損害的 通常是致死的 失去制造外源蛋白的能力的細胞一般生長得快得多 從而能替代有生產(chǎn)能力的菌株 這就導致基因的不穩(wěn)定性 基因的不穩(wěn)定性原因 分離丟失結構不穩(wěn)定性宿主細胞調(diào)節(jié)突變 1 分離丟失 指工程菌分裂時出現(xiàn)一定比例不含質(zhì)粒子代菌的現(xiàn)象 為什么會出現(xiàn)質(zhì)粒丟失呢 質(zhì)?？煞譃楦呖截愘|(zhì)粒 20拷貝 細胞 和低拷貝質(zhì)粒 有時低到每個細胞一至二個拷貝 低拷貝質(zhì)粒有專門的機制保證在子代細胞中有相等的分配 高拷貝質(zhì)粒通常很少遵循二分法分配到子代細胞 對于高拷貝質(zhì)粒 絕大多數(shù)子細胞接受一些質(zhì)粒 也有可能有的細胞沒有接受質(zhì)粒 出現(xiàn)質(zhì)粒丟失 雖然形成無質(zhì)粒細胞的可能性是低的 每百萬細胞分裂中一個 在大的反應器中含有非常多的細胞 總會存在無質(zhì)粒細胞 例如1000L發(fā)酵液 每毫升有109個細胞 總共就有1015個細胞 那么在這個反應器中就含有109個無質(zhì)粒細胞 質(zhì)粒的分離丟失受許多環(huán)境因素影響 如溶氧 溫度 培養(yǎng)基組成和恒化器中的稀釋速率 許多質(zhì)粒也會形成多聚體 它是相同質(zhì)粒附著在一起形成一個單位 分離丟失示意圖 2 質(zhì)粒結構不穩(wěn)定性 指外源基因從質(zhì)粒上丟失或堿基重排 缺失所致工程菌性能的改變 如果質(zhì)粒發(fā)生突變 仍保留了抗生素抗性基因 但不合成外源蛋白 那么這些突變株仍能在含有抗生素的培養(yǎng)基中生長 而且由于不合成外源蛋白 生長得比原來的工程菌更快 使得在這種培養(yǎng)物中帶有突變質(zhì)粒的菌占統(tǒng)治地位 這種培養(yǎng)情況就是結構不穩(wěn)定性 3 宿主細胞突變 宿主細胞的突變也會造成生產(chǎn)能力的下降 這些突變通常改變細胞調(diào)節(jié) 結果減少目標蛋白的合成 例如 控制外源蛋白表達的啟動子 利用宿主細胞的啟動子 如果宿主細胞啟動子的改變 將大大改變質(zhì)粒編碼蛋白的生產(chǎn)水平 乳糖操縱子是常用是操縱子 通過加入乳糖或它的結構類似物 如IPTG 來啟動表達 如果乳糖操縱子編碼半乳糖苷透酶的基因發(fā)生突變就會阻止乳糖或乳糖的結構類似物進入細胞 從而不能啟動細胞的表達 4 生長速率占優(yōu)勢的不穩(wěn)定性 所有這三種因素的關鍵是變異了的宿主載體系統(tǒng)和原宿主 載體系統(tǒng)的生長速率不同 如果變異了的宿主載體系統(tǒng)比原來的宿主 載體系統(tǒng)有生長優(yōu)勢 那么變異了的系統(tǒng)將最終占優(yōu)勢 基因不穩(wěn)定性就出現(xiàn) 四 表達的誘導基因工程菌的產(chǎn)物表達需要誘導 誘因主要有 溫度誘導 乳糖或乳糖結構類似物誘導 氧饑餓誘導 葡萄糖饑餓誘導 甲醇誘導等 提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法1 兩階段培養(yǎng)法 第一階段使菌體生長至一定密度 第二階段誘導外源基因的表達 在培養(yǎng)基中加入選擇性壓力如抗生素等 以抑制質(zhì)粒丟失菌的生長 2 通過控制環(huán)境參數(shù) 溫度 PH 培養(yǎng)基組分和溶解氧濃度 調(diào)節(jié)比生長速率 使工程菌生長具有優(yōu)勢 有些含質(zhì)粒的菌對發(fā)酵環(huán)境的改變比不含質(zhì)粒的菌反應慢 因而間歇改變培養(yǎng)條件以改變這兩種菌的比生長速率 可以改善質(zhì)粒的穩(wěn)定性 染菌 3 不同時間染菌對發(fā)酵的影響 污染時間是指用無菌檢測方法確準的污染時間 不是雜菌竄入培養(yǎng)液的時間 雜菌進入培養(yǎng)液后 需有足夠的生長 繁殖的時間才能顯現(xiàn)出來 顯現(xiàn)的時間又與污染菌量有關 污染的菌量多 顯現(xiàn)染菌所需的時間就短 污染菌量少 顯現(xiàn)染菌的時間就長 1 種子培養(yǎng)期染菌 由于接種量較小 生產(chǎn)菌生長一開始不占優(yōu)勢 而且培養(yǎng)液中幾乎沒有抗生素 產(chǎn)物 或只有很少抗生素 產(chǎn)物 因而它防御雜菌能力低 容易污染雜菌 如在此階段染菌 應將培養(yǎng)液全部廢棄 2 發(fā)酵前期染菌 發(fā)酵前期最易染菌 且危害最大 原因發(fā)酵前期菌量不很多 與雜菌沒有競爭優(yōu)勢 且還未合成產(chǎn)物 抗生素 或產(chǎn)生很少 抵御雜菌能力弱 在這個時期要特別警惕以制止染菌的發(fā)生 染菌措施可以用降低培養(yǎng)溫度 調(diào)整補料量 用酸堿調(diào)pH值 縮短培養(yǎng)周期等措施予以補救 如果前期染菌 且培養(yǎng)基養(yǎng)料消耗不多 可以重新滅菌 補加一些營養(yǎng) 重新接種再用 3 發(fā)酵中期染菌 發(fā)酵中期染菌會嚴重干擾產(chǎn)生菌的代謝 雜菌大量產(chǎn)酸 培養(yǎng)液pH下降 糖 氮消耗快 發(fā)酵液發(fā)粘 菌絲自溶 產(chǎn)物分泌減少或停止 有時甚至會使已產(chǎn)生的產(chǎn)物分解 有時也會使發(fā)酵液發(fā)臭 產(chǎn)生大量泡沫 措施降溫培養(yǎng) 減少補料 密切注意代謝變化情況 如果發(fā)酵單位到達一定水平可以提前放罐 或者抗生素生產(chǎn)中可以將高單位的發(fā)酵液輸送一部分到染菌罐 抑制雜菌 4 發(fā)酵后期染菌 發(fā)酵后期發(fā)酵液內(nèi)已積累大量的產(chǎn)物 特別是抗生素 對雜菌有一定的抑制或殺滅能力 因此如果染菌不多 對生產(chǎn)影響不大 如果染菌嚴重 又破壞性較大 可以提前放罐 帶圖題 谷氨酸正常發(fā)酵與異常發(fā)酵溶解氧變化 氧氣 實例一 對黃色短桿菌生物合成氨基酸時發(fā)現(xiàn) 菌體的臨界溶氧濃度為0 01mg L 當溶氧濃度低于1 0時 谷氨酸和天冬氨酸族氨基酸合成受到影響 但苯丙氨酸 纈氨酸和亮氨酸最佳合成的溶氧濃度分別為0 55 0 60和0 85 從合成途徑中可知 谷氨酸和天冬氨酸族的氨基酸來自于三羧酸循環(huán) TCA 的中間體 而苯丙氨酸 纈氨酸和亮氨酸來自于糖酵解的中間體 即來自于丙酮酸和磷酸稀醇式丙酮酸 溫度 在四環(huán)素發(fā)酵中 還發(fā)現(xiàn)生物熱和菌的呼吸強度的變化有對應關系 特別是在80小時以前 從此實驗中還可看到 當產(chǎn)生的生物熱達到高峰時 糖的利用速度也最大 另外也有人提出 可從菌體的耗氧率來衡量生物熱的大小 四環(huán)素生物合成過程中系列參數(shù)的動態(tài)變化過程1 效價 2 呼吸強度 3 生物熱 4 糖濃度 第二題 1 微生物對溫度的要求不同與它們的膜結構物理化學性質(zhì)有密切關系根據(jù)細胞膜的液體鑲嵌模型 細胞在正常生理條件下 膜中的脂質(zhì)成分應保持液晶狀態(tài) 只有當細胞膜處于液晶狀態(tài) 才能維持細胞的正常生理功能 使細胞處于最佳生長狀態(tài)微生物的生長溫度與細胞膜的液晶溫度范圍相一致 二 微生物與溫度相關性的原理 2 蛋白質(zhì)結構 人們采用二種方案來研究酶在低溫條件下的結構完整性和催化功能 1 通過自然或誘導突變 將特定殘基發(fā)生改變的蛋白與其天然結構進行對比 2 對比同屬嗜熱 嗜溫及嗜冷菌的蛋白結構 通過對嗜冷酶的蛋白質(zhì)模型和x一射線衍射分析表明 嗜冷酶分子間的作用力減弱 與溶劑的作用加強 酶結構的柔韌性增加 使酶在低溫下容易被底物誘導產(chǎn)生催化作用 嗜冷菌具有在0 合成蛋白質(zhì)的能力 這是由于其核糖體 酶類以及細胞中的可溶性因子等對低溫的適應 蛋白質(zhì)翻譯的錯誤率最低 許多中溫菌不能在O0C合成蛋白質(zhì) 一方面是由于其核糖體對低溫的不適應 翻譯過程