瘤胃發(fā)酵液揮發(fā)性脂肪酸的氣相色譜分析方法.docx

2006年4月甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)第4 1卷 第2期2426JoURNAL 0F GANSU AGRICULTURAL UNIVERSITY雙月刊瘤胃發(fā)酵液揮發(fā)性脂肪酸的氣相色譜分析方法丁學(xué)智，龍瑞軍，淡瑞芳，焦婷，張欣(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院甘肅蘭州 730073)摘要：以藏羊瘤胃發(fā)酵液為樣品，選用2一乙基丁酸(2EB)為內(nèi)標(biāo)物，采用毛細(xì)管氣相色譜法測定了瘤胃發(fā)酵液中 的有機(jī)酸含量結(jié)果表明，柱溫180，柱壓90 kPa時(shí)，可以有效分離乙酸、丙酸和丁酸其回收率分別為967、967和964O67肛L藏羊發(fā)酵液中，乙酸、丙酸、丁酸的濃度分別為(365士112)molL、(855士O92)molL和 (434O81)molL氣相色譜法具有操作簡便、快速、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)。是測定反芻動(dòng)物瘤胃發(fā)酵液揮發(fā)性脂肪酸較為理想 的方法關(guān)鍵詞：氣相色譜；瘤胃液；內(nèi)標(biāo)法；揮發(fā)性脂肪酸中固分類號(hào)：0 6577+l文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：l0034315(2006)02一0024103A determination method based on gas chromatography for analysis of volatile fatty acids in rumen fluidDING Xuezhi，LONG R伍-jun，DAN Ruifang，JIAO Ting，ZHANG Xin(College of Pratacultural Science。Gansu Agricuitural University，Lanzhou 730073，China)Abstract：Selecting undecanoic(2EB)as an internal standard，a simple and rapid method for the deter mination of v01atile fatty acids in rumen fermentation fluid was introducedThe results showed that under the circumstance of column temperature of 180，press of 90 kPa and using FID detector，the average recovery rate of acetate，propionate and butyrate were 967，967and 964respectively，and theconcentrate in 067肚L rumen fluid were(365112)molL，(855092)molL and(434士O81) molL，respectivelyThis method proved to be not only stable，practical，fast and easy to operate，but also better in repetition and accuracy，and would be an ideal way to determinate the vol醇ile，fatty acids of rumen fluid ，Key woIds：capillary gas chromatography；rumen fluid；internal stand4rd method；volatile fatty acids瘤胃發(fā)酵產(chǎn)生的揮發(fā)性脂肪酸(VFAs)是反芻 檢測室溫度等一系列色譜條件的探索，建立了1種動(dòng)物能量的重要來源，約占反芻動(dòng)物吸收能量的 用毛細(xì)管柱快速測定瘤胃體外發(fā)酵產(chǎn)物中揮發(fā)性脂7080。其中乙、丙、丁酸占瘤胃發(fā)酵VFAs肪酸的方法總量的95左右1，因此對(duì)揮發(fā)性脂肪酸的測定對(duì)1儀器與材料研究反芻動(dòng)物瘤胃發(fā)酵有著重要的意義目前，測定揮發(fā)性脂肪酸的方法主要有比色法、柱色譜法、紙色11試驗(yàn)儀器 譜法、滴定法及氣相色譜法口“，國內(nèi)基本上是采用美國熱電菲尼根(Themo Finnigan)Traee 不同材料的填充柱來檢測樣品中的VFAs含量，且GC 2000氣相色譜儀，氫火焰離子化檢測器，Chrom大多采用程序升溫，有的采用恒溫條件7本研究通 Chard色譜工作站，并配有空氣壓縮機(jī)(1000 過對(duì)載氣、壓力、流速、柱溫、柱流量、氣化室溫度和25B)、氫氣發(fā)生器(Parker)、氮?dú)獍l(fā)生器(parker)、微量注射器作者簡介；丁學(xué)智(1979一)，男，甘肅天水人，碩士研究生研究方12色譜參數(shù)向?yàn)椴莸厣鷳B(tài)和反芻動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)色譜柱：HPINNOWAX(19091N一133)毛細(xì)資助基金：國際原子能機(jī)構(gòu)(IAEA)資助(126666RO)管柱(30 cmO32 mm05舯)，橫流模式，流量通訊作者：龍瑞軍，男，教授Email；10ngrui junsinacom收稿日期：200511一07O70 mLmin，線速度35 cmmin，柱壓90 kPa；柱溫：恒溫模式(180)；萬方數(shù)據(jù)第2期 丁學(xué)智等：瘤胃發(fā)酵液揮發(fā)性脂肪酸的氣相色譜分析方法進(jìn)樣口：載氣高純氮?dú)?，分流?0：1，進(jìn)樣量mL含有內(nèi)標(biāo)物2EB的25偏磷酸溶液，4下高 O67_uL，溫度220； 速離心(3 000 rmin)，上清液置于冰箱中備用，測檢測器：FID，溫度250，氫氣流量40定發(fā)酵液中乙酸、丙酸和丁酸的含量mLmin，空氣450 mLmin2結(jié)果與分析13 VFA梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)液的制備按表1配置100 mL混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液在5個(gè)21色譜條件的選擇15 mL離心管中加入O2 mL含有2一乙基丁酸 211 色譜柱的選擇瘤胃體外發(fā)酵產(chǎn)物乙、丙、 (2EB)的偏磷酸去蛋白溶液，然后分別加入1、o8、 丁酸為水相中存在的低分子有機(jī)酸，均為強(qiáng)極性物 o6、o4、o2 mL混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，以及O、o2、 質(zhì)，HPINNOWAX柱是強(qiáng)極性的聚乙二醇 O4、O6、O8 mL蒸餾水，即配制成5級(jí)VFA梯度 (PEG)交鏈鍵合毛細(xì)管柱，可以承受水溶劑的樣品 標(biāo)準(zhǔn)液(表2) 分離因此，可采用HPINNOWAX(19091N一表1 100 mL混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的制備133)毛細(xì)管柱進(jìn)行分析Tab1The ratio of mixture storage liquid 212柱溫及載氣壓力的選擇 由于瘤胃液中的 揮發(fā)酸主要是沸點(diǎn)較低的乙酸(118)、丙酸(141)和丁酸(1635)，且相互之間分子量差別不 大，因此可直接上樣，進(jìn)行恒溫法分析固定其他分析條件，分別在柱溫160、165、170、175、180、190表2 vFA梯度標(biāo)準(zhǔn)液中各組分濃度和氮?dú)鈮毫?0、85、90、100 kPa條件下測定乙、丙、Tab2 The concentration of different ingredient in丁酸標(biāo)準(zhǔn)液結(jié)果表明，柱溫在180，柱壓在90VFA standard sampleskPa時(shí)，乙、丙、丁酸峰形較好，且可以有效地進(jìn)行分標(biāo)準(zhǔn)貯備液 VFA梯度標(biāo)準(zhǔn)液濃度mm01L-1添加量mL 乙酸丙酸 丁酸 離22 乙、丙、丁酸標(biāo)準(zhǔn)圖譜的采集及色譜分離在上述色譜條件下，采用保留時(shí)間對(duì)照法和標(biāo) 準(zhǔn)追加物法，確定瘤胃發(fā)酵液中揮發(fā)性脂肪酸的保 留時(shí)間由標(biāo)準(zhǔn)色譜圖1可知，乙、丙、丁酸的峰形良好，出峰時(shí)間恰當(dāng)，以上標(biāo)準(zhǔn)圖譜的3個(gè)峰分別是14發(fā)酵產(chǎn)物的制備乙、丙、丁酸，其保留時(shí)間分別為312、356、424 在瘤胃體外發(fā)酵系統(tǒng)(HGT)8的100 mL培養(yǎng)mjn管內(nèi)，準(zhǔn)確添加粉碎后經(jīng)40目篩(或o5 mm篩)的苜蓿干草粉200 mg在活塞前端13部位均勻涂抹 凡士林，在39下預(yù)熱試驗(yàn)用瘤胃液取自2只裝 有永久性瘺管的藏羊，體重為(30士10)kg，舍飼，自 由采食苜蓿干草，自由飲水在晨飼前用自制吸管經(jīng)瘤胃瘺管從瘤胃腹囊下部吸取瘤胃內(nèi)容物，迅速裝 入預(yù)熱至39，且通入Co。的容器中，保溫(39) 迅速帶回實(shí)驗(yàn)室混合均勻后經(jīng)4層紗布過濾，量取 圖1乙、丙、丁酸標(biāo)準(zhǔn)色譜圖所需體積的瘤胃液加入至準(zhǔn)備好的人工瘤胃營養(yǎng)液Fig1 Chromatogram of acetate。propionate and butyrate中(瘤胃液與人工培養(yǎng)液的體積比為1：2)，制成混 分別抽取O67弘L的5級(jí)梯度標(biāo)準(zhǔn)液，手動(dòng)進(jìn) 合人工瘤胃培養(yǎng)液，用磁力攪拌器攪拌，同時(shí)通入無 樣至氣相色譜FID進(jìn)樣口，據(jù)峰面積的出峰時(shí)間， 氧CO。用自動(dòng)移液器向培養(yǎng)管中加人人工瘤胃培 確定它們?cè)谏V柱上的保留時(shí)間，用峰面積法定量， 養(yǎng)液30 mL，排出培養(yǎng)器中的氣體，用夾子夾住前端 根據(jù)濃度和峰面積的關(guān)系，建立線性回歸方程 硅橡膠管，記錄初始刻度(mL)，將其置于已預(yù)熱的 (表3)恒溫水浴箱(39)中體外發(fā)酵培養(yǎng)23 回收率和精密度試驗(yàn) 量取經(jīng)過一定時(shí)間發(fā)酵的瘤胃液5 mL，加入1按表4配置不同濃度的乙酸、丙酸和丁酸溶液，萬方數(shù)據(jù)甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)2006年用上述方法重復(fù)lo次分別測定溶液中乙酸、丙酸和 生化處理4甲酯衍生化可改善被測樣品的揮發(fā)性 丁酸的含量，計(jì)算其回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差從表2 和穩(wěn)定性，降低有機(jī)酸極性較強(qiáng)而產(chǎn)生的拖尾現(xiàn)象， 可知，乙酸、丙酸、丁酸的回收率在944 使被測樣品由水相轉(zhuǎn)為有機(jī)相5但這種方法會(huì)增967，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在123171之間， 加成本，而且復(fù)雜費(fèi)時(shí)本研究通過對(duì)載氣壓力及流 說明采用氣相色譜法測定乙酸、丙酸和丁酸的含量， 速、柱溫、汽化室和檢測室溫度等一系列條件的探 精確度和可信度均較高 索，可在45 min之內(nèi)快速、準(zhǔn)確地測定瘤胃發(fā)酵液襲3乙、丙、丁酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性回歸方程 中乙酸、丙酸和丁酸的含量Tab3 The linear equations and regression coefficientsof the standard curves參考文獻(xiàn)1 Erwin E S，Marco G J，Emery E MVolatile fatty acid aIllyses of food and rumen fluid by gas chromatography 口Dairy Sci，1961，44：17681771瞳 Jaroslav J，Stranska E，F(xiàn)rancisci E P，以口ZBlood cul表4乙酸、丙酸、丁酸回收翠和精密度tures evaluation by gas chromatography of volatile fat Tab4 The results of recovery and precision of different ty acids口Med sci Mollit，2000，6：605610acetate，propionate and butyrate levelsD Sullivan H M。Martin S AE“ects of a SaccIlammyces組分，罷=墨一。囂翟cerevisiae Culture on in vitro Mixture Rumen MicroorgaIlism FermentationJDairy Sci，1999，82：20112016乙酸50 4835士O35967 123l!I 黃小蘭，陳云華發(fā)酵液中酸性物質(zhì)的氣相色譜測定法 丙酸 125 1207士O15967 171口食品與發(fā)酵工業(yè)，2001，27(7)：1214 丁酸10 944士O11 944 137口 陳喜斌，馮仰廉瘤胃VFA產(chǎn)量與瘤胃可發(fā)酵有機(jī)物24發(fā)酵產(chǎn)物中乙、丙、丁酸濃度的測定關(guān)系的研究口動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)報(bào)，1996(2)：3236螢取處理后的發(fā)酵液o67 pL進(jìn)樣，根據(jù)保留邸 秦為琳氣相色譜法測定瘤胃中揮發(fā)性脂肪酸的含量 時(shí)間和峰面積，計(jì)算出發(fā)酵產(chǎn)物中乙酸、丙酸、丁酸口南京農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)，1982，(4)：110115 濃度，分別為(3165112)、(855o92)、(434 口 胡偉蓮皂甙對(duì)瘤胃發(fā)酵與甲烷產(chǎn)量及反芻動(dòng)物生產(chǎn)081)mm01L 性能影響的研究D浙江大學(xué)，2005眵 Menke K H，Raab LSalewsl【i A以口Z