碩士研究生畢業(yè)論文三七藥材及提取物農藥殘留測定分析.doc

XXXX 醫(yī)藥大學 XXXX 年碩士研究生畢業(yè)論文 1 碩士研究生畢業(yè)論文 三七藥材及提取物三七藥材及提取物 農藥殘留測定分析農藥殘留測定分析 XXXX 年 XX 月 XX 日 XXXX 醫(yī)藥大學 XXXX 年碩士研究生畢業(yè)論文 2 中文摘要中文摘要 三七是我國的名貴中藥，為了有效地監(jiān)測其農藥殘留情況，控制其內在質 量，滿足國際市場的要求，本論文建立了三七藥材及其提取物和制劑的農藥殘 留分析方法，并制定相應的限度標準，同時為其他中藥建立通用的農藥殘留分 析方法與嚴格完善的農藥殘留限量標準提供科學依據與方法借鑒，提高中藥品 質，增強中藥在國際市場上的競爭力，使中藥早日全面進入國際市場。 本論文結合國內外文獻，運用氣相色譜-質譜聯用技術，建立了三七藥材、 三七藥材提取物三七三醇皂苷及三七通舒膠囊中四大類 20 種農藥同時測定的定 性定量分析方法。首先對色譜柱、進樣口溫度、特征離子、離子源溫度等進行 優(yōu)選研究，確定了色譜、質譜條件，然后再通過對樣品提取溶劑、提取方法和 凈化方法的實驗研究，確定了三七藥材、三七三醇皂苷原料藥及三七通舒膠囊 的樣品前處理方法，之后對建立的方法進行方法學驗證，最后運用建立的分析 方法分別對 15 個批次的三七藥材、15 個批次的三七三醇皂苷原料藥及 15 個批 次的三七通舒膠囊進行 20 種農藥殘留量的檢測。 結果表明，實驗所建立的 20 種農藥殘留測定的分析方法準確靈敏、穩(wěn)定可 靠，重復性、專屬性和耐用性均很好，可控性強。15 批 PTS 和 15 批三七通舒 膠囊均未檢出 20 種農藥，而三七藥材中農藥殘留現象較為普遍，15 批藥材有 不同程度的農藥殘留檢出。 關鍵詞：關鍵詞：三七藥材；三七三醇皂苷；三七通舒膠囊；農藥殘留；氣相色譜- 質譜聯用；固相萃取。 XXXX 醫(yī)藥大學 XXXX 年碩士研究生畢業(yè)論文 3 ABSTRACTABSTRACT Panax Notoginseng is a very valuable medicine in China.To monitor its pesticide residues effectively,control its inner quality,meet the requirements of international markets,this thesis established methods of analysis for pesticide residues in Panax Notoginseng,its extract and its herbal preparation,and made limit standards.At the same time,it provided scientific basis and mothods reference for the establishment of universal methods of analysis for pesticide residues and strict,complete limit standards in other Chinese materia medica,improved the quality of Chinese materia medica,enhanced the competitiveness of Chinese materia medica in the international markets and made Chinese materia medica fully enter international markets as soon as possile. This thesis incorporated the literatures at home and abroad, made use of gas chromatography-mass spectrometry(GC-MS),to develop methods of qualitative and quantitative analysis simultaneously for 20 pesticide residues in Panax Notoginseng, its extract PTS and SanQiTongShu Capsules.First,we studied and optimized the chromatographic columns,injection temperature,characteristic ions,ion source temper- ature during the experiment,built the GC and MS condition.Then we studied the extra- ction solvents, extraction methods and purification methods of sample and built the pre-processing methods of Panax Notoginseng,PTS raw materials and SanQiTongShu Capsules.Then we studied method validation.Finally,we used the analytical methods built up to detect 20 pesticide residues in 15 batches of Panax Notoginseng, 15 batch- es of PTS and 15 batches of SanQiTongShu Capsules. The results showed that the analytical methods built up to determine 20 pesticide residues were accurate,stable and reliable,which had a high sensitivity,good repeatability,good specificity,good durability and good controllability.None of 20 pes- ticides were detected in 15 batches of PTS and 15 batches of SanQiTongShu Capsules .But the phenomenon of pesticide residues in Panax Notoginseng was common,and different levels of pesticide residues were detected in 15 batches of Panax Notogin- seng. Keywords:Keywords:Panax Notoginseng; Protopanaxatriol Saponin(PTS); SanQi TongShu Capsule;pesticide residues;gas chromatography-mass spectrometry;solid phase extrac- tion(SPE). XXXX 醫(yī)藥大學 XXXX 年碩士研究生畢業(yè)論文 4 目目 錄錄 中文摘中文摘要要 .1 1 ABSTABSTR RACTACT .2 2 目目 錄錄 .3 3 縮略詞英縮略詞英漢漢對照對照 .5 5 1.1.引引言言 .6 6 1.1 國內外研究現狀 .6 1.2 項目研究的意義與創(chuàng)新點 .7 2.2.正正文文 .8 8 2.1 實驗儀器與材料 .8 2.1.1 儀器與設備 .8 2.1.2 標準品 .8 2.1.3 試藥 .9 2.1.4 試劑 .10 2.2 實驗方法與結果 .10 2.2.1 標準品溶液和內標溶液的制備 .10 2.2.1.1 標準品儲備溶液的制備 .10 2.2.1.2 混合標準品溶液的制備 .11 2.2.1.3 內標儲備溶液的制備 .12 2.2.1.4 內標工作溶液的制備 .12 2.2.2 色譜、質譜條件 .13 2.2.3 供試品溶液的制備 .13 2.2.3.1 三七藥材供試品溶液的制備 .13 2.2.3.2 三七三醇皂苷原料藥供試品溶液的制備 .14 2.2.3.3 三七通舒膠囊供試品溶液的制備 .14 2.2.4 實驗方法的優(yōu)化研究 .15 2.2.4.1 色譜條件的選擇 .15 2.2.4.2 質譜條件的選擇 .15 2.2.4.3 樣品前處理方法的選擇 .17 2.2.5 方法學研究 .19 2.2.5.1 系統(tǒng)適應性試驗 .19 XXXX 醫(yī)藥大學 XXXX 年碩士研究生畢業(yè)論文 5 2.2.5.2 檢測限和定量限 .19 2.2.5.3 線性范圍考察 .21 2.2.5.4 回收率試驗 .26 2.2.5.5 重復性試驗 .29 2.2.5.6 精密度試驗 .30 2.2.5.7 專屬性試驗 .33 2.2.5.8 耐用性試驗 .35 2.2.6 農藥殘留量測定 .36 2.2.6.1 定性測定 .36 2.2.6.2 定量測定 .36 2.2.6.3 樣品測定 .36 2.3 結論 .38 2.4 討論 .39 2.4.1 三七藥材、PTS 及三七通舒膠囊 20 種農藥殘留量限量標準的制定 .39 2.4.2 基質效應的影響 .40 2.4.3 中藥農殘殘留研究中存在的問題 .41 2.4.4 展望 .41 3.3.總總結結 .4343 致致 謝謝 .4444 參考文獻參考文獻 .4545 附附 圖圖 .4848 綜綜 述述 .4949 后置部分后置部分 .6161 XXXX 醫(yī)藥大學 XXXX 年碩士研究生畢業(yè)論文 6 縮略詞英漢對照縮略詞英漢對照 縮略詞縮略詞英文名稱英文名稱中文名稱中文名稱 EIEIElectronElectron IonisationIonisation 電子電離電子電離 GCGCGasGas ChromatographyChromatography 氣相色譜氣相色譜 GPCGPCGelGel PermeationPermeation ChromatographyChromatography 凝膠滲透色譜凝膠滲透色譜 LODLODLimitLimit OfOf DetectionDetection 檢測限檢測限 LOQLOQLimitLimit OfOf QuantitationQuantitation 定量限定量限 MRLMRLMaximumMaximum ResidueResidue LimitLimit 最大殘留限量最大殘留限量 MSMSMassMass SpectrometrySpectrometry 質譜質譜 NDNDNoNo DetectedDetected 未檢出未檢出 PTSPTSProtoparaxotriolProtoparaxotriol SaponinsSaponins 三七三醇皂苷三七三醇皂苷 RSDRSDRelativeRelative StandardStandard DeviationDeviation 相對標準偏差相對標準偏差 SCANSCANSCANSCAN 全掃描全掃描 SIMSIMSelectedSelected IonIon MonitoringMonitoring 選擇離子監(jiān)測選擇離子監(jiān)測 SPESPESolidSolid PhasePhase ExtractionExtraction 固相萃取固相萃取 SPMESPMESolidSolid PhasePhase MicroextractionMicroextraction 固相微萃取固相微萃取 TICTICTotalTotal IonsIons ChromatographyChromatography 總離子流色譜總離子流色譜 XXXX 醫(yī)藥大學 XXXX 年碩士研究生畢業(yè)論文 7 1 1引引 言言 上世紀八十年代以來，隨著人類健康意識的增強和回歸大自然的浪潮高漲， 人們越來越重視中藥中農藥的殘留問題。資料顯示，我國的中藥材農藥污染現 象較為普遍，我國出口的中藥在日韓、歐美等國市場上多次因農藥殘留超標等 原因被查扣返回1，極大地影響了中藥的聲譽，農藥殘留問題已成為中藥走向 世界的“攔路虎” 。因此，中藥農藥殘留問題是我國中藥研究領域亟待解決的關 鍵問題之一。 1.11.1 國內外研究現狀國內外研究現狀 上世紀八十年代以來，由于現代分析技術和儀器的飛速發(fā)展，我國科學工 作者開始對中藥的農藥殘留檢測進行研究。但到目前為止，我國中藥農藥殘留 分析研究中絕大多數仍然采用傳統(tǒng)氣相色譜法或液相色譜法配備不同的檢測器 進行檢測，很少采用先進的各種色譜-質譜聯用技術。而且研究多集中在單一中 藥品種中的某一類農藥如有機氯類的分析方法研究，尚未出現中藥中農藥殘留 全成分研究的報道。近年來，也出現了少量運用固相萃取法（SPE） 、色譜-質譜 聯用技術檢測中藥中農藥殘留的報道2,3,4,5,6,7,8，但都是僅限于實驗室研究，尚 未大范圍應用。此外，我國的中藥農藥殘留限量標準不僅數量少，覆蓋農藥品 種少。 中國藥典2005 版一部9中對于農藥殘留量的測定只規(guī)定了 9 種有機氯 類農藥、12 種有機磷類農藥和 3 種擬除蟲菊酯類農藥三類農藥的 3 種測定方法， 覆蓋農藥品種少，而且分析方法均為單一的氣相色譜法，對中藥提取物和中藥 制劑中的農藥殘留均未進行限制。我國現在執(zhí)行的涉及中藥農藥殘留限量的標 準有中國藥典2005 年版中規(guī)定的甘草、黃芪標準；香港中藥材標準（第一 冊） ；國家藥用植物及制劑外經貿綠色行業(yè)標準 （WM/T2-2004） ；國家標準人 參（GB/T 155l7.1 及 GB/T l8335） ；國家標準甘草（GB/T l9618-2004） ；國家 標準枸杞（GB/T 18672-2002） ；國家標準三七（GB 19086-2003） ；北京市中 藥炮制規(guī)范中人參、枸杞飲片1。但以上標準都只檢測相關藥材中六六六、 滴滴涕等少數幾種有機氯類農藥。 在國外，歐美、日韓等發(fā)達國家多采用先進成熟的分析檢測技術進行植物 XXXX 醫(yī)藥大學 XXXX 年碩士研究生畢業(yè)論文 8 藥農藥殘留監(jiān)測工作，如固相萃取法（SPE） 、固相微萃取技術(SPME)、氣相色 譜與質譜聯用技術、液相色譜與質譜聯用技術、超臨界流體色譜技術、毛細管 電泳技術等10,11,12,13,14,15，這些技術的應用大大提高了農藥殘留檢測的靈敏度、 定性、定量能力，擴大了檢測農藥的覆蓋范圍，目前國外已發(fā)展出可以同時檢 測上百種農藥的多殘留分析系統(tǒng)，如美國 FDA 的多殘留檢測方法可檢測 360 多 種農藥，德國 DFG 的方法可檢測 325 種農藥，加拿大多殘留檢測方法可檢測 251 種農藥（其中 GC-MS 檢測 239 種）16,17。歐盟除規(guī)定了有機氯類農藥殘留 量外，還規(guī)定了有機磷類農藥和除蟲菊酯類農藥的限量，對植物藥中農藥殘留 的限量規(guī)定遠嚴于中國。目前，歐盟已經對 133 種農藥設定了 17000 個限量， 并通過與美國藥典 、 日本藥典的協(xié)調，使各國藥典的檢查項和限量標準 達成一致，規(guī)定了植物藥中 34 種農藥的最大殘留限量18。 而對于中藥提取物和中藥制劑的農藥殘留分析研究，相關的報道非常少。 由于中藥提取物和中藥制劑在制備過程中，原料中藥材經過提取、凈化、濃縮、 干燥、制劑成型等復雜的步驟后農藥的殘留量變得很低，而且中成藥制劑、劑 型多樣，使得農藥的提取、分離、凈化與富集難度增大，檢測更為復雜。迄今 為止，國內外尚未統(tǒng)一制定出中成藥中農藥殘留量的檢測方法和限量標準。 1.21.2 項目研究的意義與創(chuàng)新點項目研究的意義與創(chuàng)新點 查閱近 20 年來關于三七中農藥殘留檢測研究的文獻，僅有 6 篇19,20,21,22,23,24， 且多數僅僅對三七藥材中的六六六、滴滴涕等少數幾種有機氯類農藥進行了測 定。本項目研究的目的在于建立三七藥材及其提取物和制劑的中藥農藥多殘留 分析方法，并制定相應的限度標準，使中藥三七滿足國際市場的要求，同時更 重要的是為中藥建立先進通用的農藥殘留分析方法與嚴格完善的農藥殘留限量 標準提供科學依據與方法借鑒，提高中藥品質，樹立中藥在國際市場上的良好 聲譽，增強中藥在國際市場上的競爭力，使中藥早日全面進入國際市場。 本研究的創(chuàng)新點在于：首次運用氣相色譜-質譜聯用技術（GC-MS）對三七 藥材、藥材提取物及其制劑進行檢測分析；首次運用先進成熟的固相萃取法 （SPE）對三七藥材、藥材提取物及其制劑樣品進行前處理。 XXXX 醫(yī)藥大學 XXXX 年碩士研究生畢業(yè)論文 9 2.2.正正 文文 2.12.1 實驗儀器與材料實驗儀器與材料 2.1.12.1.1 儀器與設備儀器與設備 Agilent 7890A 氣相色譜儀（安捷倫科技公司） ， Agilent 5975C 質譜儀（安捷倫科技公司） ， Sartorius BP211D 十萬分之一分析天平（德國賽多利斯公司） ， METTLER AE240 萬分之一分析天平（瑞士梅特勒公司） ， Waters 固相萃取儀（美國沃特世公司） ， Caliper TurboVap LV 全自動氮吹儀（美國 Caliper Life Sciences 公司） ， IKA MS3 數碼渦旋振蕩儀（廣州儀科實驗室技術公司） ， HY-2A 往復振蕩器（江蘇常州澳華儀器公司） ， Auto Science AS5150A 超聲波清洗器（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）, Gilson Pipetman P20、P100、P200、P1000 移液器（法國吉爾森公司） ， Agela ODS C18 固相萃取柱（天津艾杰爾博納公司） ， Agela Florisil 固相萃取柱（天津艾杰爾博納公司） ， Agela PestiCarb/NH2 固相萃取柱（天津艾杰爾博納公司） 。 2.1.22.1.2 標準品標準品 20 種農藥標準品和內標標準品的名稱、分子量、分類、含量及生產廠家見 表 1。 XXXX 醫(yī)藥大學 XXXX 年碩士研究生畢業(yè)論文 10 表表 1 1 2020 種農藥標準品和內標標準品的名稱、分子量、分類、含量及廠家種農藥標準品和內標標準品的名稱、分子量、分類、含量及廠家 編號中文名稱英文名稱分子量分類 含量 （%） 生產廠家 01 -六六六 Alpha-HCH290.82 有機氯類 97.5 德國 GmbH 公司 02 -六六六 Beta-HCH290.82 有機氯類 98.4 德國 GmbH 公司 03 -六六六 Gamma-HCH290.82 有機氯類 98.5 德國 GmbH 公司 04 五氯硝基苯 Quintozene295.33 有機氯類 97.0 德國 GmbH 公司 05 百菌清 Chlorothalonil265.91 有機氯類 97.5 德國 GmbH 公司 06 七氯 Heptachlor373.32 有機氯類 98.7 德國 GmbH 公司 07 甲基五氯 苯基硫醚 Methyl-pentachlorophenyl sulfide 296.43 有機氯類 99.0 德國 GmbH 公司 08 毒死蜱 Chlorpyrifos350.59 有機磷類 99.0 德國 GmbH 公司 09 艾氏劑 Aldrin364.91 有機氯類 98.5 德國 GmbH 公司 10 腐霉利 Procymidone284.14 殺真菌劑 99.5 德國 GmbH 公司 11 -氯丹 Gamma-Chlordane409.78 有機氯類 99.7 德國 GmbH 公司 12 順式氯丹 Cis-Chlordane409.78 有機氯類 99.0 德國 GmbH 公司 13 4，4-滴滴伊p，p-DDE 318.02 有機氯類 98.5 德國 GmbH 公司 14 4，4-滴滴滴p，p-DDD 320.04 有機氯類 98.0 德國 GmbH 公司 15 2，4-滴滴涕o，p-DDT 354.49 有機氯類 98.5 德國 GmbH 公司 16 4，4-滴滴涕p，p-DDT 354.49 有機氯類 98.5 德國 GmbH 公司 17 甲氰菊酯 Fenpropathrin349.43 擬除蟲菊酯類 99.5 德國 GmbH 公司 18 功夫菊酯 Lambda-cyhalothrin449.90 擬除蟲菊酯類 98.5 德國 GmbH 公司 19 -氯氰菊酯 Alpha-Cypermethrin416.33 擬除蟲菊酯類 99.5 德國 GmbH 公司 20 順式氰戊菊酯 Esfenvalerate419.90 擬除蟲菊酯類 98.0 德國 GmbH 公司 21 三硫磷（內標） Carbophenothion342.87 有機磷類 99.4 德國 GmbH 公司 2.1.32.1.3 試藥試藥 三七藥材 15 批及空白陰性藥材 1 批，三七藥材提取物三七三醇皂苷 XXXX 醫(yī)藥大學 XXXX 年碩士研究生畢業(yè)論文 11 （PTS）原料藥 15 批及空白陰性 PTS 1 批、三七通舒膠囊 15 批及空白陰性三七 通舒膠囊 1 批，以上三種試藥均由成都華神集團公司制藥廠提供。各供試品的 編號及批號見表 2。 表表 2 2 三種試藥三種試藥 4545 批供試品的編號及其批號批供試品的編號及其批號 編號三七藥材批號PTS 批號三七通舒膠囊批號 01060601071204080102 02061101071223080501 03070101080105080607 04070301080416080802 05070401080503080907 06071001080504081105 07071002080505090201 08071003080507090202 09071101080601090203 10071102080606090204 11071103081105090205 12071104081106090206 13071201081201090207 14071202081202090209 15080301081203090210 16 061201（空白）080101（空白）080601（空白） 2.1.42.1.4 試劑試劑 乙腈，正己烷，丙酮，乙酸乙酯，甲苯，無水硫酸鈉。除無水硫酸鈉為分 析純外，其余均為色譜純。高純氦氣（純度99.999%） （四川梅塞爾氣體公司） 。 2.22.2 實驗方法與結果實驗方法與結果 2.2.12.2.1 標準品溶液和內標溶液的制備標準品溶液和內標溶液的制備 2.2.1.12.2.1.1 標準品儲備溶液的制備標準品儲備溶液的制備 分別精密稱取一定量的 20 種農藥標準品，各置于 100ml 容量瓶中，加入乙 酸乙酯適量溶解，再加入乙酸乙酯定容至刻度，搖勻，即得 20 種農藥的標準品 XXXX 醫(yī)藥大學 XXXX 年碩士研究生畢業(yè)論文 12 儲備溶液。20 種農藥的稱樣量及單標濃度見表 3。 表表 3 3 2020 種農藥標準品的稱樣量及單標濃度種農藥標準品的稱樣量及單標濃度 農藥名稱稱樣量（mg）單標濃度（g/ml） -六六六 10.1198.57 -六六六 11.19110.11 -六六六 11.15109.83 五氯硝基苯 9.6793.80 百菌清 9.7695.16 七氯 12.55123.87 甲基五氯苯基硫醚 10.59104.84 毒死蜱 10.84107.32 艾氏劑 9.2090.62 腐霉利 11.18111.24 -氯丹 9.5294.91 順式氯丹 3.2131.78 4，4-滴滴伊 10.33101.75 4，4-滴滴滴 10.31101.04 2，4-滴滴涕 9.2591.11 4，4-滴滴涕 9.8597.02 甲氰菊酯 9.8397.81 功夫菊酯 10.92107.56 -氯氰菊酯 12.58125.17 順式氰戊菊酯 10.33101.23 2.2.1.22.2.1.2 混合標準品溶液的制備混合標準品溶液的制備 精密移取上述 20 種農藥標準品儲備溶液各一定量置于置于同一 100ml 容量 瓶中，加入乙酸乙酯稀釋定容至刻度，搖勻即得。20 種農藥的取液量及濃度見 表 4。 XXXX 醫(yī)藥大學 XXXX 年碩士研究生畢業(yè)論文 13 表表 4 4 2020 種農藥的取液量及混標濃度種農藥的取液量及混標濃度 農藥名稱取液量（ml）混標濃度（g/ml） -六六六 1.00.99 -六六六 1.01.10 -六六六 1.01.10 五氯硝基苯 3.02.81 百菌清 1.00.95 七氯 2.02.48 甲基五氯苯基硫醚 1.51.57 毒死蜱 3.03.22 艾氏劑 3.02.72 腐霉利 3.03.34 -氯丹 1.51.42 順式氯丹 5.01.59 4，4-滴滴伊 1.01.02 4，4-滴滴滴 1.01.01 2，4-滴滴涕 2.01.82 4，4-滴滴涕 2.01.94 甲氰菊酯 4.03.91 功夫菊酯 4.04.30 -氯氰菊酯 5.06.26 順式氰戊菊酯 5.05.06 2.2.1.32.2.1.3 內標儲備溶液的制備內標儲備溶液的制備 精密稱取三硫磷標準品 15.51mg 置于 100ml 容量瓶中，加入乙酸乙酯適量 溶解，再加入乙酸乙酯定容至刻度，搖勻即得。 2.2.1.42.2.1.4 內標工作溶液的制備內標工作溶液的制備 XXXX 醫(yī)藥大學 XXXX 年碩士研究生畢業(yè)論文 14 精密移取內標儲備液 5ml 置于 50ml 容量瓶中，加入乙酸乙酯定容至刻度， 搖勻即得。 2.2.22.2.2 色譜、質譜條件色譜、質譜條件 色譜條件：色譜條件：色譜柱：HP-1MS 毛細管色譜柱（30m0.32mm1m） ；柱溫升 溫程：80（保持 1min） ，以 15/min 升至 180，再以 3/min 升至 205 （保持 10min） ，再以 5/min 升至 270（保持 3min） ，最后以 30/min 升至 280（保持 9min） ；載氣：高純氦氣，載氣速度：1.0ml/min（0-44min） ， 3.0ml/min（44-63min） ；進樣方式：脈沖不分流，1.5min 后打開分流閥；進樣 口溫度：260；進樣量：2l。 質譜條件：質譜條件：離子源：電子電離（EI）源；電離能量：70eV；離子源溫度： 250；GC-MS 接口溫度：280；四級桿溫度：180；溶劑延遲：14min；掃 描模式：選擇離子監(jiān)測（SIM） ，1 個定量離子，2-3 個定性離子。所有離子按各 農藥保留時間的先后順序，分時段分別檢測。 2.2.32.2.3 供試品溶液的制備供試品溶液的制備 2.2.3.12.2.3.1 三七藥材供試品溶液的制備三七藥材供試品溶液的制備 提取提取 取供試品粉末（過三號篩）約 2g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中， 加入乙腈 20ml，無水硫酸鈉 8g，振蕩 60min（250r/min） ，濾過，濾液備用；藥 渣加入乙腈 10ml，振蕩 10min（250r/min） ，濾過，濾液與前濾液合并，置氮吹 儀上 40吹至約 1ml，待凈化。 凈化凈化 將上述提取濃縮液置于 C18 固相萃取柱（1000mg/6ml，加樣前柱 上加無水硫酸鈉約 1cm 高，用乙腈 5ml 預淋洗）上，容器用乙腈洗滌 3 次，每 次 1ml，洗液置于同一 C18 柱上，再用乙腈 15ml 洗脫，收集洗脫液，置氮吹儀 上 40吹至約 1ml，加少量正己烷替換兩次至乙腈除盡，殘渣加正己烷 1ml 使 溶解，置于弗羅里硅土（Florisil）固相萃取柱（1000mg/6ml，加樣前柱上加 無水硫酸鈉約 1cm 高，依次用正己烷-丙酮（9:1）10ml 和正己烷 10ml 預淋洗） 上，容器用正己烷-丙酮（9:1）洗滌 3 次，每次 1ml，洗液置于同一 Florisil 柱上，再用正己烷-丙酮（9:1）15ml 洗脫，收集洗脫液，置氮吹儀上 40吹至 約 1ml，加少量乙腈替換兩次至正己烷、丙酮除盡，殘渣加乙腈 1ml 使溶解， XXXX 醫(yī)藥大學 XXXX 年碩士研究生畢業(yè)論文 15 置于石墨化碳/氨基（PestiCarb/NH2）串聯固相萃取柱（500mg+500mg/6ml，加 樣前柱上加無水硫酸鈉約 1cm 高，用乙腈-甲苯（3:1）5ml 預淋洗）上，容器 用乙腈-甲苯（3:1）洗滌 3 次，每次 1ml，洗液置同一 PestiCarb/NH2串聯柱上， 再用乙腈-甲苯（3:1）25ml 洗脫，置氮吹儀上 40吹至近干，加入內標工作溶 液 40l、乙酸乙酯 960l 使溶解，渦旋混勻，經 0.2m 濾膜濾過，取續(xù)濾液， 即得。 2.2.3.22.2.3.2 三七三醇皂苷原料藥供試品溶液的制備三七三醇皂苷原料藥供試品溶液的制備 提取提取 取供試品粉末約 2g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加入乙腈 20ml，無水硫酸鈉 8g，振蕩 60min（250r/min） ，濾過，濾液備用；藥渣加入乙 腈 10ml，振蕩 10min（250r/min） ，濾過，濾液與前濾液合并，置氮吹儀上 40 吹至約 1ml，待凈化。 凈化凈化 將上述提取濃縮液置于 C18 固相萃取柱（1000mg/6ml，加樣前柱 上加無水硫酸鈉約 1cm 高，用乙腈 5ml 預淋洗）上，容器用乙腈洗滌 3 次，每 次 1ml，洗液置于同一 C18 柱上，再用乙腈 15ml 洗脫，收集洗脫液，置氮吹儀 上 40吹至約 1ml，置于石墨化碳/氨基（PestiCarb/NH2）串聯固相萃取柱 （500mg+500mg/6ml，加樣前柱上加無水硫酸鈉約 1cm 高，用乙腈-甲苯 （3:1）5ml 預淋洗）上，容器用乙腈-甲苯（3:1）洗滌 3 次，每次 1ml，洗液 置同一 PestiCarb/NH2串聯柱上，再用乙腈-甲苯（3:1）25ml 洗脫，置氮吹儀 上 40吹至近干，加入內標工作溶液 40l、乙酸乙酯 960l 使溶解，渦旋混勻， 經 0.2m 濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。 2.2.3.32.2.3.3 三七通舒膠囊供試品溶液的制備三七通舒膠囊供試品溶液的制備 提取提取 取供試品膠囊內容物約 2g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加入 乙腈 20ml，無水硫酸鈉 8g，振蕩 60min（250r/min） ，濾過，濾液備用；藥渣加 入乙腈 10ml，振蕩 10min（250r/min） ，濾過，濾液與前濾液合并，置氮吹儀上 40吹至約 1ml，待凈化。 凈化凈化 將上述提取濃縮液置于 C18 固相萃取柱（1000mg/6ml，加樣前柱 上加無水硫酸鈉約 1cm 高，用乙腈 5ml 預淋洗）上，容器用乙腈洗滌 3 次，每 次 1ml，洗液置于同一 C18 柱上，再用乙腈 15ml 洗脫，收集洗脫液，置氮吹儀 XXXX 醫(yī)藥大學 XXXX 年碩士研究生畢業(yè)論文 16 上 40吹至約 1ml，置于石墨化碳/氨基（PestiCarb/NH2）串聯固相萃取柱 （500mg+500mg/6ml，加樣前柱上加無水硫酸鈉約 1cm 高，用乙腈-甲苯 （3:1）5ml 預淋洗）上，容器用乙腈-甲苯（3:1）洗滌 3 次，每次 1ml，洗液 置同一 PestiCarb/NH2串聯柱上，再用乙腈-甲苯（3:1）25ml 洗脫，置氮吹儀 上 40吹至近干，加入內標工作溶液 40l、乙酸乙酯 960l 使溶解，渦旋混勻， 經 0.2m 濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。 2.2.42.2.4 實驗方法的優(yōu)化研究實驗方法的優(yōu)化研究 2.2.4.12.2.4.1 色譜條件的選擇色譜條件的選擇 （1 1）色譜柱的優(yōu)選）色譜柱的優(yōu)選 對 HP-1MS 毛細管柱（30m0.25mm0.25m） 、HP-1MS 毛細管柱 （30m0.32mm 1m）和 DB-35MS 毛細管柱（30m0.32mm0.25m）進行了試驗比較，結果 發(fā)現第一柱各農藥出峰時間比后兩柱短，但是個別定量離子相同的峰不能達到 基線分離；第三柱雖然能夠使 20 種農藥峰基線分離，然而多數峰形差，部分峰 出現嚴重的拖尾；只有第二柱雖然各物質出峰時間比第一柱長一些，但是能使 20 中農藥全部達到基線分離，而且峰形較好，故實驗選擇 HP-1MS 毛細管柱 （30m0.32mm1m） 。 （2 2）進樣口溫度的確定）進樣口溫度的確定 進樣口溫度直接影響著目標物的響應值、峰形和峰分離度，是一個很重要 的實驗條件。取混合標準品溶液分別于進樣口溫度 230、240、250、 260、270時進樣分析，結果表明：當進洋口溫度250時，20 種農藥的 響應值變化不大，峰形較好，達到基線分離。由于實驗所用的 20 種農藥沸點差 異較大，為保證其充分汽化，并考慮到儀器的承受能力和使用壽命，最終實驗 選擇進樣口溫度為 260。 2.2.4.22.2.4.2 質譜條件的選擇質譜條件的選擇 （1 1）特征離子的確定）特征離子的確定 移取內標工作溶液 0.1ml，混合標準品溶液 1.0ml 置于同一 2ml 容量瓶內， XXXX 醫(yī)藥大學 XXXX 年碩士研究生畢業(yè)論文 17 加乙酸乙酯定容至刻度，搖勻，進樣分析，選擇全掃描方式（SCAN）得到 20 種 農藥和內標三硫磷的總離子流色譜圖（TIC）,提取出每個峰的質譜圖，再在化 合物譜庫中進行檢索，確證每一種農藥。然后在每種農藥的質譜圖中選擇三至 四個豐度高、質量數大、干擾小的碎片離子作為相應農藥的定性、定量特征監(jiān) 測離子，其中定量離子 1 個，定性離子 2-3 個，采用選擇離子監(jiān)測（SIM）方式 進行定性和定量分析。20 種農藥和內標三硫磷的總離子流色譜圖（TIC）見圖 1，保留時間、定量離子、定性離子與 SIM 開始時間見表 5。 表表 5 5 2020 種農藥和內標三硫磷的保留時間、定量離子、定性離子與種農藥和內標三硫磷的保留時間、定量離子、定性離子與 SIMSIM 開始時間開始時間 農藥名稱 保留時間 (min) 定量離子 (m/z) 定性離子 (m/z) SIM 開始 時間(min) -六六六 15.70181(100)219(96),254(71),111(80)14.50 -六六六 16.22183(92)219(100),254(63),109(73)16.00 -六六六 17.06181(100)219(95),254(77),111(43)16.70 五氯硝基苯 17.58237(100)295(73),214(52),177(35)17.30 百菌清 18.03266(100)264(83),268(23)17.80 七氯 22.32272(100)237(63),337(15)21.50 甲基五氯苯基硫醚 23.95296(100)246(7