凱氏定氮法測定食品中蛋白質(zhì)

.,.,凱氏定氮法測定食品中蛋白質(zhì),.,3,一、概述,蛋白質(zhì)是以氨基酸為最小構(gòu)成單元的大分子的含氮化合物，它是由20種氨基酸通過酰氨鍵以一定方式結(jié)合，并具有一定的空間結(jié)構(gòu)。,.,生理功能及在食品中的作用,.,5,常見食物中蛋白質(zhì)的含量,牛肉,螺旋藻,.,6,常見食物氮系數(shù),氮系數(shù)：蛋白質(zhì)含氮量的倒數(shù)，常用6.25表示。,.,7,蛋白質(zhì)測定方法,.,二、凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)（粗蛋白）,凱氏定氮法是通過測出樣品中的總含氮量再乘以相應(yīng)的蛋白質(zhì)系數(shù)而求出蛋白質(zhì)的含量。1.原理,.,2.實驗步驟,.,第一步：樣品消化,樣品與濃硫酸加熱消化，硫酸使有機物脫水并破壞有機物，C、H氧化為二氧化碳、水逸出，蛋白質(zhì)分解為氨、與硫酸結(jié)合生成硫酸銨、留在溶液中,.,11,（1）消化總反應(yīng)式：,.,消化裝置“自動回流消化儀”,.,定氮消化的不同狀態(tài),RCH2(NH2)COOH+H2SO4CO2+H2O+SO2+(NH4）2SO4,澄清,消泡,碳化,.,消化過程中試劑作用,硫酸鉀：提高溶液沸點、加快反應(yīng)進程；硫酸銅（藍綠色）：催化作用,.,(NH4)2SO4+2NaOHNH3+Na2SO4+2H2O,第二步蒸餾,.,注意事項：,.,(3）吸收與滴定吸收：加熱蒸餾所放出的氨，硼酸溶液滴定：鹽酸標準溶液，硼酸呈微弱酸性（Ka1=5.810-10），用酸滴定不影響指示劑的變色反應(yīng)，它有吸收氨的作用硫酸、鹽酸溶液也可用作吸收劑。,.,18,各步驟操作細節(jié)圖解：,樣品消化蒸餾滴定（1）樣品消化,樣品+0.4g硫酸銅+6g硫酸鉀+20ml濃硫酸+玻珠數(shù)粒,先小火炭化，無泡沫后，加大火力，液體變藍綠透明，繼續(xù)加熱微沸30分鐘,45度角,消化終點,瓶口不能對著人,蓋上小漏斗,.,19,（2）蒸餾,將消化液全部轉(zhuǎn)移到100ml容量瓶中,加10ml硼酸溶液和混合指示劑23d,加入NaOH溶液后顏色為深藍色或褐色,通入蒸汽開始蒸餾,冷凝管下口浸入硼酸溶液中,取10ml消化稀釋液沿小玻璃杯移入反應(yīng)室，少量蒸餾水沖洗，塞緊棒狀玻璃塞，向小玻璃杯內(nèi)加入10ml40%NaOH,提起玻璃塞，使NaOH緩慢流入反應(yīng)室，立即塞緊玻璃塞，并在小玻璃杯中加水使之密封。,.,20,吸收液變藍色后繼續(xù)蒸餾5分鐘，將冷凝管尖端提離液面再蒸餾1min，用蒸餾水沖洗冷凝管尖端，取下接收瓶，關(guān)閉電源,.,21,（3）滴定,取下接收瓶，用0.1000mol/L的鹽酸或硫酸標準溶液滴定至終點。,滴定前,滴定終點,同時做一試劑空白實驗，記錄空白滴定消耗鹽酸的體積。,.,22,實驗注意事項消化,（1）不時轉(zhuǎn)動凱氏燒瓶、緩和沸騰消化（2）消化至呈透明后，繼續(xù)消化30分鐘，一般消化時間約4小時（3）可加如少量辛醇、硅油做消泡劑（4）樣品不易澄清時可冷卻后加入30%過氧化氫2-3ml,.,小結(jié),.,24,.,25,自動凱氏定氮儀法,在凱氏定氮法的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的自動凱氏定氮儀法，具有安全、高效、準確的優(yōu)點。儀器：,消化爐,自動蒸餾裝置,.,26,1、原理及適用范圍2、特點：（1）消化裝置用優(yōu)質(zhì)玻璃制成的凱氏消化瓶，紅外線加熱的消化爐。（2）快速：一次可同時消化8個樣品，30分鐘可消化完畢。（3）自動：自動加堿蒸餾，自動吸收和滴定，自動數(shù)字顯示裝置?？捎嬎憧偟俜趾坎⒂涗?，12分鐘完成1個樣。,.,27,雙縮脲法（分光光度法）,1.原理雙縮脲反應(yīng)堿性條件下、雙縮脲與硫酸銅作用生成紫紅色配合物的反應(yīng)。肽鍵（-CO-NH-）與雙縮脲結(jié)構(gòu)相似、能呈現(xiàn)此反應(yīng)。560nm處、由顏色深淺判定蛋白質(zhì)含量多少。,KOH、CuSO4、酒石酸鉀鈉配置,.,標準曲線,標準曲線（standardcurve）是指通過測定一系列已知組分的標準物質(zhì)的某理化性質(zhì)，而得到的性質(zhì)的數(shù)值曲線。,.,2.標準曲線繪制,（1）配置一定濃度（10mg/ml）的蛋白質(zhì)標準溶液；（2）分別量取4ml、5ml、6ml、7ml、8ml、9ml、10ml蛋白質(zhì)標準液于7支50ml比色管中；（3）向上述7支試管中分別加入1ml四氯化碳后、用堿性酒石酸銅溶液稀釋至50ml，振搖、靜止1h；（4）取上清液在2000r/mi