細(xì)胞生物學(xué)小鼠細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)報(bào)告

廣 州 大 學(xué)綜合設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)報(bào)告學(xué) 院 生 命 科 學(xué) 學(xué) 院 課 程 細(xì) 胞 生 物 學(xué) 實(shí) 驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目 細(xì)胞培養(yǎng) 實(shí)驗(yàn)題目 小鼠肝細(xì)胞的原代培養(yǎng) 專 業(yè) 生物技術(shù) 年級、班別 生技142 姓 名 徐嘉寬 學(xué) 號 1414300030 任課教師 陳鯤 細(xì)胞培養(yǎng) 小鼠細(xì)胞的原代培養(yǎng)摘要 目的 探討體外分離和培養(yǎng)小鼠腎、腦、心肌細(xì)胞的方法。方法 采用脫臼法處死新生小鼠，結(jié)合 酶消化法和組織塊法對新生小鼠腎、腦、心肌細(xì)胞進(jìn)行了體外分離、培養(yǎng)。（用眼科剪把新生小鼠心肌細(xì)胞組織剪成小于1mm大小的植塊，然后用胰蛋白酶消化510min，最后將心肌組織塊接種于培養(yǎng)瓶中進(jìn)行體外培養(yǎng)。腦和腎直接進(jìn)行組織塊培養(yǎng)。）結(jié)果 比較成功地進(jìn)行了原代腎、腦、心肌細(xì)胞培養(yǎng)，并進(jìn)行了形態(tài)學(xué)觀察。 結(jié)論 采用該方法能夠?qū)崿F(xiàn)對小鼠心肌、腎、腦細(xì)胞的體外原代培養(yǎng)，較好觀察到心肌、腦、腎細(xì)胞的形態(tài)。關(guān)鍵詞 原代培養(yǎng) 小鼠細(xì)胞 組織塊法 酶消化法1前 言 初步了解動物細(xì)胞原代培養(yǎng)的基本方法、原理和基本操作過程，初步掌握無菌操作方法。學(xué)習(xí)植塊培養(yǎng)法、營養(yǎng)液的配置及酸堿度的調(diào)節(jié)。細(xì)胞培養(yǎng)是當(dāng)前細(xì)胞生物學(xué)乃至整個(gè)生命科學(xué)研究與生物工程中最基本的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。當(dāng)前，細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)、遺傳學(xué)、免疫學(xué)、腫瘤學(xué)、細(xì)胞工程等領(lǐng)域，已發(fā)展成為一種重要的生物技術(shù)。了解動物細(xì)胞培養(yǎng)的技術(shù)的基本操作過程，觀察體外培養(yǎng)細(xì)胞的生長特征，并對原代培養(yǎng)有一個(gè)基本概念。結(jié)合酶消化法和組織塊法通過無菌操作培養(yǎng)新生小鼠細(xì)胞。2實(shí)驗(yàn)原理原代細(xì)胞培養(yǎng)是指直接從動物體內(nèi)獲取的細(xì)胞、組織或器官，經(jīng)體外培養(yǎng)后，直到第一次傳代為止。這種培養(yǎng)，首先用無菌操作的方法，從動物體內(nèi)取出所需的組織（或器官），用植塊培養(yǎng)法或酶解法，在人工培養(yǎng)下，使其不斷地生長及繁殖。細(xì)胞培養(yǎng)是一種操作繁瑣而又要求十分嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)技術(shù)。要是細(xì)胞能在體外長期生長，必須滿足兩個(gè)基本要求：一是供給細(xì)胞存活所必須的條件，如適量的水、無機(jī)鹽、氨基酸、維生素、葡萄糖及其有關(guān)的生長因子、氧氣、適宜的溫度，注意外環(huán)境酸堿度與滲透壓的調(diào)節(jié)。二是嚴(yán)格控制無菌條件。3實(shí)驗(yàn)用品3.1器材 解剖剪、鑷1套；眼科剪7把、眼科鑷6把；吸管直、彎頭各7支，2 ml刻度吸管5支；吸管膠頭：小18個(gè)、大6個(gè)；細(xì)胞培養(yǎng)瓶5個(gè)；青霉素瓶及瓶塞：6個(gè)（其中一個(gè)用于分裝胰酶液）；培養(yǎng)皿(用于解剖取材)：大、小各1套。燒杯：510ml 2個(gè)、100 ml 1個(gè)。 用于無菌操作：解剖鑷1把，廣口瓶大、小各1個(gè)（裝消毒棉球），醫(yī)用棉花、紗布，有蓋白瓷盤1個(gè)、消毒盒3個(gè)、牛皮紙、棉繩。小培養(yǎng)皿(裝蓋玻片)1個(gè)。 3.2試劑 3.2.1清洗用液：5%稀鹽酸、1%稀鹽酸、2%NaOH、洗潔精、單蒸水、三蒸水、清洗液 （用 濃硫酸和重鉻酸鉀配制、全班共用）等。 3.2.2消毒劑（用前配制）：甲醛、高錳酸鉀、新潔爾滅、75%酒精、碘酒、過氧乙酸等。 3.2.3 培養(yǎng)用液： 3.2.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)用液（每大組100mL，用100mL鹽水瓶裝）：經(jīng)過濾過的F10 （RPMI1640）培養(yǎng)基占8090%、經(jīng)過濾除菌的小牛血清占1020%,加入經(jīng)過濾除菌、終 濃度各為100國際單位的抗菌素。 3.2.3.2細(xì)胞消化液（每小組1青霉素瓶，約5mL）：經(jīng)過濾除菌的0.25%胰蛋白酶 或EDTA胰蛋白酶液。 3.2.3.3平衡鹽溶液：不含鈣、鎂離子的Hank液：每組約50mL，用50（或100）mL 鹽水瓶裝。3.3 材料新生白小鼠4實(shí)驗(yàn)方法4.1技術(shù)路線清洗玻璃儀器,膠塞制備消毒棉球包裝分裝培養(yǎng)液用液用品消毒分裝培養(yǎng)用液用品分裝培養(yǎng)用液包裝原代培養(yǎng)接種用品實(shí)驗(yàn)時(shí)的準(zhǔn)備工作如小組所示在小組其他成員已打開腹腔的基礎(chǔ)上切取小鼠腎（心肌、腦）組織塊洗去血污 剔除多余成份剪成小于1mm大小的植塊接種貼壁培養(yǎng)觀察和記錄4.2實(shí)驗(yàn)步驟a) 玻璃儀器的初步清洗、開始培育小白鼠（第一批雌鼠與雄鼠混養(yǎng)、觀察記錄陰道口的情況等）b) 繼續(xù)培養(yǎng)乳鼠（第二批雌鼠與雄鼠混養(yǎng)、觀察記錄陰道口的情況等），玻璃儀器的清洗（清洗液浸泡）、膠制品的清洗。c) 繼續(xù)培養(yǎng)乳鼠（常規(guī)飼養(yǎng)工作）、完成清洗工作（包括各類物品）、制備消毒用棉球、包裝分裝培養(yǎng)用液用品。d) 繼續(xù)培養(yǎng)乳鼠（常規(guī)飼養(yǎng)工作、留意小鼠的出生）、消毒分裝培養(yǎng)用液用品、分裝培養(yǎng)用液、包裝原代培養(yǎng)接種用品。e) 消毒原代培養(yǎng)接種用品f) 細(xì)胞原代培養(yǎng)(1)洗手操作者用洗滌劑刷洗雙手自來水沖凈新潔爾滅浸泡進(jìn)入無菌室 (2)準(zhǔn)備工作：1操作者于超凈臺內(nèi)用酒精棉球消毒雙手，待酒精稍干后，然后用酒精棉球消毒工作面。2去掉Hank液、細(xì)胞培養(yǎng)液、酶液的包裝紙。3打開試管、吸管膠頭包裝，將試管插（盡量斜插）入試管架4取出需用的吸管（直、彎吸管各一支，刻度吸管一支）套上膠頭，試管一支，插入相應(yīng)的試管中。5打開培養(yǎng)皿以及解剖工具手持端的包裝(3)處死小鼠(脫臼法)消毒（放入含75%酒精的燒杯中浸泡數(shù)秒）。將以處死消毒的小鼠轉(zhuǎn)移至超凈工作臺內(nèi)的培養(yǎng)皿蓋內(nèi)，背部朝上。培養(yǎng)皿倒扣于包裝紙上待用。(4)解剖取腎：用酒精棉球擦拭背部，在腰部后緣用解剖鑷提起皮膚，用解剖剪呈倒T形剪開皮膚，再用解剖剪剪開腰部兩側(cè)肌肉，用眼科剪拿出2個(gè)腎臟置于無菌培養(yǎng)皿中。(5)用Hank液洗滌皮膚組織2次，吸去Hank。(6)剪碎組織塊：換另一套眼科剪將組織塊剪成小于1mm的組織塊（大小盡量一致）。用Hank液洗滌，棄Hank液。(7)酶消化：將胰蛋白酶液加入裝有組織塊的青霉素瓶中，蓋緊蓋子，置超凈工作臺內(nèi)中消化510min，知道組織塊變松軟、粘稠狀，顏色略變白色為止。(8)將培養(yǎng)液直接加入盛有胰蛋白酶和皮膚組織塊的青霉素瓶中，利用其中的牛血清終止酶消化的作用，棄去酶液和培養(yǎng)液的混合液。加入培養(yǎng)液重復(fù)此操作23次。(9)取一培養(yǎng)瓶，在培養(yǎng)瓶的上面做好標(biāo)志（在瓶側(cè)注明班、組別、姓名、材料名稱等信息）(10)用培養(yǎng)液濕潤的吸管小心吸取組織塊,輕輕吹出到培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)瓶面內(nèi),按照一定的間隔和形式用彎吸管將植塊排列好(11)翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶（培養(yǎng)面在上方），加入4ml的培養(yǎng)液。(12)將培養(yǎng)皿加蓋封口,送入37度恒溫箱內(nèi),靜置（加入的培養(yǎng)液不浸泡植塊，不從瓶口流出）(13)按相同的方法取出心臟和腦組織，清洗后直接植塊培養(yǎng)。(14)4小時(shí)后，待組織塊充分貼壁后，翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶使植塊浸于培養(yǎng)液中且不漂?。?15)觀察至于37度培養(yǎng)的細(xì)胞，需逐日進(jìn)行觀察，主要觀察：1培養(yǎng)物是否被污染，如培養(yǎng)液變?yōu)辄S色且混濁，表示該瓶被污染。2細(xì)胞生長與培養(yǎng)液顏色的變化，如培養(yǎng)液變?yōu)樽霞t色，一般細(xì)胞生長不好?？赡苁瞧咳瓷w緊或營養(yǎng)液pH過高。3培養(yǎng)液若變?yōu)榻奂t色，一般表示細(xì)胞生長良好。經(jīng)過12天培養(yǎng)后，若細(xì)胞生長情況較差或培養(yǎng)液變紅了，則可換一次營養(yǎng)液。換液時(shí)也要注意無菌操作（若經(jīng)過12天培養(yǎng)后,若細(xì)胞生長情況較差或培養(yǎng)液變紅,則需換液。無菌室的準(zhǔn)備工作如小組方案中所示：1) 從37攝氏度培養(yǎng)箱中取出培養(yǎng)瓶，于超凈工作臺內(nèi)吸去全部舊培養(yǎng)液；2) 用平衡鹽溶液輕緩漂洗培養(yǎng)物12次,棄平衡鹽溶液；3) 加入與換液前相同的量的培養(yǎng)液；4) 放回原來的培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。若經(jīng)23天后，細(xì)胞營養(yǎng)液變黃，此時(shí)表示細(xì)胞已生長。每日觀察結(jié)果用文字記錄，換液也需記錄，在整個(gè)培養(yǎng)過程的不同階段（最少在前、中、后階段）置倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況并拍照記錄。5結(jié)果5.1.圖片展示圖一：小鼠腎細(xì)胞圖二：小鼠腎細(xì)胞5.2.結(jié)果分析(1)小鼠腎細(xì)胞培養(yǎng) 腎臟細(xì)胞在培養(yǎng)1d后，明顯看出細(xì)胞開始向組織塊四周擴(kuò)散，既有新生的細(xì)胞也有游離的組織塊碎片。翻轉(zhuǎn)組織塊能發(fā)現(xiàn)更多游離的細(xì)胞。圖一二中發(fā)亮的細(xì)胞即為有活力的腎細(xì)胞(梭形)。失去活力的細(xì)胞呈黑色或形狀不規(guī)則。圖三：小鼠神經(jīng)細(xì)胞圖四：小鼠神經(jīng)細(xì)胞（2）小鼠腦細(xì)胞培養(yǎng) 小鼠腦組織塊培養(yǎng)，在初始幾天并沒有發(fā)現(xiàn)游離的神經(jīng)細(xì)胞，待培養(yǎng)液顏色變黃（證明細(xì)胞有生長）且換培養(yǎng)液后，把腦組織塊翻轉(zhuǎn)，在顯微鏡下發(fā)現(xiàn)有一比較明顯的神經(jīng)細(xì)胞（如圖四所示）。 圖五：小鼠心肌細(xì)胞 圖六：小鼠心肌細(xì)胞（3）小鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng) 小鼠心肌細(xì)胞采用了酶消化法培養(yǎng)，培養(yǎng)1d后，視野中充滿長條纖維狀物體，其中大部分為失去活力的心肌纖維細(xì)胞，呈黑色。有活力的心肌纖維形態(tài)如圖五六所示，半透明，中間有條紋間隔。因?yàn)樾募〖?xì)胞生長緩慢，視野中所看到的均為游離的組織塊分離出來的細(xì)胞。6 結(jié)果分析與討論本實(shí)驗(yàn)結(jié)合酶消化法和組織塊法成功地培養(yǎng)出小鼠腎細(xì)胞，并且相對單一采用酶消化法或者組織塊法細(xì)胞貼壁生長的速度要大大提高了。原因是因?yàn)槠て?jīng)胰蛋白酶消化后，表皮很容易從真皮上分離下來。此時(shí)基底細(xì)胞聯(lián)接較松散，把組織塊放置于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)時(shí)，基底細(xì)胞即可輕易地游離到培養(yǎng)液中，然后在培養(yǎng)瓶底部進(jìn)行貼壁生長。 而單純的組織塊培養(yǎng)沒有經(jīng)過酶消化，單個(gè)的細(xì)胞不易從組織塊上脫落，因此細(xì)胞游離出來貼壁生長的速度比較慢。因此，通過該實(shí)驗(yàn)證明，經(jīng)過酶消化進(jìn)行的組織塊培養(yǎng)的這種方法是一種改良后的細(xì)胞培養(yǎng)的方法，此方