腫瘤模型專題

腫瘤模型專題1. 最新的藥效學(xué)指導(dǎo)原則要求化藥臨床前進(jìn)行至少5種人源腫瘤的體內(nèi)抗癌活性評(píng)價(jià)，以確定藥效及抗瘤譜。2. 瘤株對(duì)藥物的敏感性通過(guò)體外篩選可以說(shuō)明，而體內(nèi)評(píng)價(jià)更大程度上是考慮藥物經(jīng)體內(nèi)吸收、分布、代謝之后的活性，由于目前的腫瘤模型多采用皮下接種，并不能完全反映藥物的組織分布對(duì)其影響，所以感覺(jué)這種要求就顯得不是很必要。注解：體內(nèi)的敏感性不是僅考慮吸收分布代謝的影響，一些樣品，體外活性都是不錯(cuò)的，體內(nèi)甚至是瘤內(nèi)直接注射給到很高劑量都沒(méi)有效果，腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)和體外的生存環(huán)境差別很大，體外模擬的生存環(huán)境完全不能體現(xiàn)出體內(nèi)的狀態(tài)。3. 皮下接種是一個(gè)目前能找到的最好的權(quán)宜之計(jì)了，實(shí)際上，SFDA明確表示，鼓勵(lì)原位腫瘤模型，但是由于技術(shù)的原因，很多瘤株都無(wú)法實(shí)現(xiàn)。而皮下模型有它的一系列優(yōu)點(diǎn)：穩(wěn)定，便于觀察，易于構(gòu)建，易于控制等等，能夠在一定程度上反映藥物經(jīng)過(guò)體內(nèi)過(guò)程的療效，所以目前只能用它來(lái)進(jìn)行評(píng)價(jià)。4. 實(shí)際上原位腫瘤模型仍然不能很好的反映臨床腫瘤的特點(diǎn)，目前能夠預(yù)見(jiàn)得到最好的模型應(yīng)該是經(jīng)過(guò)基因修飾（轉(zhuǎn)基因等）的能夠集中比較均勻的自發(fā)模型，這才是和臨床最接近的腫瘤模型。但是目前的經(jīng)過(guò)基因修飾的自發(fā)腫瘤模型種類很少，而且可控制性差，周期長(zhǎng)，所以還要經(jīng)過(guò)很長(zhǎng)時(shí)間的改善才能大規(guī)模的應(yīng)用。5. 常規(guī)的腫瘤細(xì)胞株接種后如果不能成瘤，細(xì)胞懸液就會(huì)被動(dòng)物吸收6. 瘤體積可用游標(biāo)卡尺量最長(zhǎng)徑（a)和最短徑（b），體積計(jì)算公式：V=ab2/6,每2-3天測(cè)一次。體積=寬2*長(zhǎng)/2的公式計(jì)算腫瘤體積；抑瘤率=（對(duì)照組-治療組）/對(duì)照組*100%； tumor size = width2 length 0.52).； ab2/6；關(guān)于腫瘤體積的計(jì)算：3.1415926./6約等于/2。如果想做得講究一點(diǎn)，應(yīng)該用RTV計(jì)算腫瘤體積： RTV（某日某老鼠的相對(duì)腫瘤體積）=TV(測(cè)量當(dāng)天該老鼠的腫瘤體積）/TV（分組當(dāng)天該老鼠的腫瘤體積）*100，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行平均值SD等數(shù)據(jù)的計(jì)算7. 是否必須稱重小鼠的胸腺和脾臟8. 超過(guò)7天的腹水再傳代就很容易出現(xiàn)血性；動(dòng)物的周齡也不要太大，6周左右。傳代次數(shù)太多也很容易出現(xiàn)血性腹水。血性腹水可以離心后加0.17 N的NH4CL溶液破紅細(xì)胞，然后精確一些的控制條件（接種量，傳代時(shí)間，動(dòng)物周齡等）傳幾代，很多情況下再傳一兩代后會(huì)有不血性的種鼠出現(xiàn)，然后用這只種鼠的腹水繼續(xù)傳代9. 皮下接種與剝瘤子：小鼠腫瘤剝瘤子是一個(gè)艱難的過(guò)程，但是可以一定程度上的改善一下：接種的時(shí)候要精確控制接種在皮下，靠皮內(nèi)會(huì)與皮膚強(qiáng)烈粘連，靠肌肉會(huì)與肌肉強(qiáng)烈粘連，而且不要太靠腋窩里面，可以往尾部靠一些，也可以稍微的往背部靠一點(diǎn)，不要往腹部靠，容易使腫瘤被墊料磨爛。10. LD50是毒理中的半數(shù)致死量，ED50是體外試驗(yàn)中的半數(shù)有效量，一般體內(nèi)實(shí)驗(yàn)沒(méi)有類似的指標(biāo)，如果想比較幾個(gè)類似物的藥效還是做量效曲線比較好。11. 劑量設(shè)置應(yīng)該按照LD10(10%致死劑量，也叫最大耐受劑量）來(lái)分組，一般分別采用 1/2 LD10, 1/4 LD10, 1/7 LD10 或 1/10 LD,但最大劑量不得超過(guò)LD10。這里面還得考慮ED 50，LD10與ED50的劑量相差越大越好。 用LD50作為標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置劑量是不現(xiàn)實(shí)的，因?yàn)閯?dòng)物實(shí)驗(yàn)是不可能允許10%以上動(dòng)物死亡的。12. 說(shuō)到療效的比較，如只是發(fā)文章，比較不同基團(tuán)之間可能對(duì)母體抑瘤率的影響，一般做做體外試驗(yàn)，比一比大家的IC50就好了，不太做體內(nèi)。如是真正的篩藥，我個(gè)人有些觀點(diǎn)：這個(gè)不是孤立起來(lái)看某個(gè)或者某幾個(gè)劑量下誰(shuí)比誰(shuí)的抑瘤率高。主要要看誰(shuí)更具有可開(kāi)發(fā)性。首先，要考慮它的毒性以及治療窗口的大小，通俗的說(shuō)，就是這個(gè)要在發(fā)揮療效的劑量下，毒性是否大？比如A藥，10mg抑瘤率有50%，但是體重下降了20%;而B(niǎo)藥，10mg的時(shí)候根本無(wú)效，30mg的時(shí)候有40%的抑瘤率，60mg的時(shí)候抑瘤率高達(dá)80%，而且體重幾乎沒(méi)有下降，這個(gè)時(shí)候A藥與B藥如何比較？特別如果是公司篩選新藥，還要考慮成本，病人可接受度（動(dòng)物上的有效劑量換算到人一天要吃2斤，這種藥也是不現(xiàn)實(shí)的），制劑，工藝等等方面。如果單純從藥理的角度給出答案，至少要考慮毒性和劑量限制的問(wèn)題。13. 關(guān)于劑量選擇，LD50的幾分之一是一種比較通用的方法，目前相對(duì)更合理一些的劑量選擇是做一個(gè)簡(jiǎn)單的多次給藥的毒理試驗(yàn)來(lái)確定劑量，我們一般會(huì)連續(xù)給藥一周，然后再觀察一周，這樣摸出來(lái)的最大劑量可以直接用于藥效試驗(yàn)，然后其他的劑量都在此劑量的基礎(chǔ)上往下減。14. 說(shuō)到給藥療程，一般初篩的藥物都是連續(xù)天天給藥，qd。 但是給藥途徑，特別是i.v與i.p的選擇，我們都是先做一個(gè)簡(jiǎn)單的PK試驗(yàn)考察一下，再確定，特別是如果PK試驗(yàn)的結(jié)果顯示，血藥濃度甚至達(dá)不到體外IC50的濃度，那么是否進(jìn)行體內(nèi)試驗(yàn)，就有待商榷了。連續(xù)i.p，小鼠的皮膚有時(shí)候會(huì)變厚，你可以換一邊給藥。15. 動(dòng)物選擇: KM小鼠,裸鼠,C57 等均可作為,但是個(gè)人認(rèn)為KM能做出來(lái)最好,畢竟比較有普遍性,還是正常生理狀態(tài)的健康動(dòng)物,比較有說(shuō)服力,還便宜,裸鼠或者其他特定品種,比較適合特定的瘤株16. 關(guān)于腫瘤細(xì)胞活力的問(wèn)題: 一般培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞活力往往是不夠的,很難在短時(shí)間內(nèi)長(zhǎng)到規(guī)定重量,所以建議至少在動(dòng)物體內(nèi)傳2代,讓腫瘤細(xì)胞活力充分體現(xiàn)以后再開(kāi)始用于實(shí)驗(yàn). 傳代數(shù)次的原因在于讓腫瘤細(xì)胞充分活化，要不活化也行，多接種點(diǎn)吧17. 關(guān)于接種部位的問(wèn)題:以小鼠為例一般可以選擇腋下或者后肢,背部血管不發(fā)達(dá),營(yíng)養(yǎng)不夠,一般不建議采用.接種一般采用皮下注射,針頭沿皮膚水平進(jìn)入,然后挑起表皮,注射18. 關(guān)于腫瘤重量的問(wèn)題: 模型組腫瘤重量應(yīng)該不低于0.5g19. 肺內(nèi)原位注射制作腫瘤模型效果頗好,流程如下:麻醉-固定-皮膚消毒-剪開(kāi)左側(cè)胸部皮膚,大約第2-3肋間的位置-用鑷子輕輕撥開(kāi)皮下筋膜,可以看到呼吸運(yùn)動(dòng)的肺葉-將準(zhǔn)備好的腫瘤細(xì)胞注射入肺,分層縫合OK20. 胸膜活檢穿刺針 規(guī)格：#20 #25(14G 12G) L 65 mm；用途：供人體胸腔穿刺，鉤取胸膜活體組織用21. 開(kāi)始做腫瘤藥效評(píng)價(jià)，應(yīng)該采用s180這些小鼠腫瘤模型。一個(gè)方面這些腫瘤對(duì)于藥物很敏感，而且周期短，花費(fèi)也少。但如果要成藥，裸鼠模型是必需的。22. 一般瘤重的SD在平均值的7080%以下就還湊活，漂亮一點(diǎn)的是在30%以下，實(shí)在不行，100%也勉強(qiáng)，就是特別難看，但是SD越大，統(tǒng)計(jì)上就越不利23. 皮下腫瘤模型中，腋下最適合腫瘤生長(zhǎng)。接種時(shí)由裸鼠體側(cè)腰部稍靠上的部位進(jìn)針，要保證與接種點(diǎn)的距離小于針頭的長(zhǎng)度，向頭部方穿行，絕對(duì)不能刺破皮膚或者刺破肌肉層，當(dāng)針頭到達(dá)接種位點(diǎn)時(shí)注射，退出針頭，這樣操作的目的并不完全是避免漏液，其實(shí)熟練后，不需要皮下穿行也不會(huì)漏液，主要是避免污染，進(jìn)針點(diǎn)還有少量污染的可能性的，針頭在皮下穿行一段后，接種點(diǎn)離進(jìn)針點(diǎn)較遠(yuǎn)，最大限度減少污染的可能。24. 如果是藥效試驗(yàn)，不建議你用手術(shù)標(biāo)本，因?yàn)镾FDA的臨床前研究指導(dǎo)原則上明確指出要用建株的腫瘤株進(jìn)行試驗(yàn)，因?yàn)橛檬中g(shù)標(biāo)本的試驗(yàn)可重復(fù)性太差25. 一般用4-5WK，體重1517g鼠，年輕鼠接種瘤容易長(zhǎng)26. 種植腎被膜下：第一該區(qū)免疫豁免，第二貼近腎可以從此獲得充分的養(yǎng)料.在實(shí)驗(yàn)時(shí)先用顯微用的鑷子在腎被膜上撕慨一個(gè)小口子,然后種植。注意:腎被膜和腎臟是有一個(gè)間隙可以用鑷子在被膜下趕腫瘤組織到遠(yuǎn)離撕開(kāi)口處,不用縫合被膜.這樣就可以了27. 人腫瘤模型用裸鼠，基本上沒(méi)有可成腹水的，只能皮下接種傳代28. nude mice的數(shù)據(jù)在SCID mice上是比較有參考價(jià)值的，另外，因?yàn)槊庖呦到y(tǒng)的進(jìn)一步缺乏，腫瘤生長(zhǎng)的進(jìn)程可能會(huì)比nude mice上更快一點(diǎn)29. 接種后，用干凈的棉簽按住注射部位才拔針,拔針后再按住10秒種左右,一般不會(huì)有液體滲出30. K562第一代細(xì)胞接種的成瘤很好，傳一代就很差了，沒(méi)有幾只成瘤的，到第三代就全軍覆沒(méi)31. 不贊同用7901這個(gè)瘤株，國(guó)際公認(rèn)度比較差32. 分組要求平行性，盡量縮小組間差異，組內(nèi)差異是實(shí)際情況的反映。你可以按照腫瘤體積分層隨機(jī)分組，這樣平行性比較好33. 腫瘤細(xì)胞懸液裸鼠接種前稀釋效果順序：相應(yīng)的無(wú)血清培養(yǎng)基PBSsaline34. 現(xiàn)在常用的陽(yáng)性對(duì)照藥物是CTX和cisplatin，另外乳腺癌可以用Taxol。陽(yáng)性藥的劑量途徑和療程不要求和樣品一致，不過(guò)給藥途徑盡量一樣。還有，最好選用機(jī)制類似或者結(jié)構(gòu)類似的陽(yáng)性對(duì)照。一般來(lái)說(shuō)陽(yáng)性對(duì)照的抑制率都會(huì)在60%以上或者更大，少數(shù)情況下只有50%左右。35. 細(xì)胞毒類抗腫瘤藥物臨床前體內(nèi)試驗(yàn)一般至少應(yīng)選用6種人癌移植瘤模型，其中應(yīng)包括II期臨床試驗(yàn)中擬篩選的腫瘤組織類型。36. 針對(duì)每一種人癌移植瘤模型，推薦采用相對(duì)腫瘤增殖率T/C（%）作為試驗(yàn)評(píng)價(jià)指標(biāo)，評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)通常為：T/C（%）40 %為無(wú)效；T/C（%） 40%，并經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理P 0.05為有效。在體內(nèi)有效性試驗(yàn)采用的全部人癌移植模型中，一般至少應(yīng)有1/3達(dá)到有效標(biāo)準(zhǔn)。注解：對(duì)于T/C40%，按照這個(gè)標(biāo)準(zhǔn)，很多現(xiàn)有的一線化療藥物都會(huì)被淘汰37. 適于接種的瘤源的直徑最好為1cm或者稍大一點(diǎn)，直徑2cm可能對(duì)于有些瘤株來(lái)說(shuō)會(huì)太大了一點(diǎn)。一般來(lái)說(shuō)，插塊法，一個(gè)瘤源接種30只動(dòng)物是沒(méi)有問(wèn)題的，勻漿法一般2只也可以接種30只了38. 新的抗腫瘤藥物指導(dǎo)原則上強(qiáng)調(diào)要3代以上才能用，并且不能超過(guò)1520代（人腫瘤）。39. 只有少部分的小鼠實(shí)體瘤可以腹水傳代，人實(shí)體瘤幾乎沒(méi)有能夠腹水傳代的40. 一般來(lái)說(shuō)，小鼠腫瘤比較推薦路易斯肺癌和B16。國(guó)內(nèi)的S180并不好，各實(shí)驗(yàn)室之間的變異很大。國(guó)外基本都不用它。其實(shí)并不是因?yàn)镾180有多好大家才選用他，而是他進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的成本低，周期短，操作較容易41. 灌胃藥溶解用生理鹽水可以嗎：不一定，根據(jù)混懸效果來(lái)看，一般多用0.5-2% 甲基纖維素鈉（CMC-Na）42. 實(shí)體腫瘤不可以采用生命持續(xù)時(shí)間這個(gè)指標(biāo)，這個(gè)是明確有規(guī)定的43. 正常的實(shí)體腫瘤都是越長(zhǎng)越大，最后可能會(huì)潰破，但是沒(méi)有消亡這個(gè)現(xiàn)象，如果腫瘤整體的自發(fā)消亡，說(shuō)明模型有問(wèn)題，最大可能是被污染了44. 出針掛組織的問(wèn)題，關(guān)鍵在于針頭的磨制，在針后部的小突起于小缺口吻合后，實(shí)體針彎曲方向應(yīng)該與套管針磨制的斜面一致，接種時(shí)，實(shí)體針要推到底，也就是后面的小突起與小缺口契合，然后針頭“舔住”肌肉層轉(zhuǎn)一圈再退針，還有就是瘤塊一定要完全塞入針頭內(nèi)，外面不能有漏出來(lái)的。45. S180、H22不需要測(cè)量腫瘤體積，試驗(yàn)結(jié)束后直接剝?nèi)∧[瘤成瘤重46. 瘤株皮下成瘤率好，那么到了原位應(yīng)該會(huì)更好47. 建議最好流水線操作，確保每一個(gè)步驟都是同一個(gè)人做到底的，比如插塊法，可以一個(gè)人切，一個(gè)人塞瘤塊，一個(gè)人接種；比較忌諱每個(gè)人自己切自己塞自己接種，然后只做一部分的動(dòng)物48. B16是小鼠黑色素瘤，宿主一般多用C57小鼠，因?yàn)檫@個(gè)腫瘤的細(xì)胞是黑色的，用它做肺轉(zhuǎn)移，在白色的肺葉上是黑色的轉(zhuǎn)移灶，很容易分辨。49. 在注射腫瘤細(xì)胞前對(duì)小鼠使用環(huán)磷酰氨或放射線照射,有利于移植瘤的生長(zhǎng)50. 對(duì)于水不溶藥物：低濃度的DMSO確實(shí)是一個(gè)不錯(cuò)的解決手段，當(dāng)然這么做進(jìn)行報(bào)批是不能夠被接受的，因?yàn)榕R床不允許這樣的制劑血液給藥，但是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)湊合可以，1%的濃度很低了，實(shí)際上，給小鼠（包括裸鼠）尾靜脈注射DMSO，5%以下基本沒(méi)有任何反應(yīng)，10%的時(shí)候需要較慢的速度注射，但是動(dòng)物也能夠接受，再高就不行了51. 瘤內(nèi)注射：總注射量只能為瘤體積的10%，最多20%，瘤內(nèi)注射有一定的技巧，我們就是用的4號(hào)針頭，但是進(jìn)針點(diǎn)要遠(yuǎn)一點(diǎn)，讓針頭在皮下多走一段，然后再刺入瘤內(nèi)，一個(gè)腫瘤可以多點(diǎn)注射，但是一定要注意，刺入一點(diǎn)注射完畢以后，針頭退出瘤組織，但是絕對(duì)不能退出皮下，然后換個(gè)地方再刺進(jìn)去，一個(gè)點(diǎn)只能注射1015ul，不要多打，比如要注射20ul，就分兩個(gè)點(diǎn)注射，每個(gè)點(diǎn)10ul。52. 腫瘤模型一般常用的有小鼠模型和人腫瘤裸小鼠移植瘤模型。其中用得最多的是皮下模型，另外還有腹水（或者尾靜脈注射）以及原位模型，其他的模型很少用53. 小鼠模型分三大類：a) 第一類：以S180、EAC、H22等為代表的，他們的宿主小鼠多選用KM，可產(chǎn)生腹水，也可在皮下成瘤。多以腹水傳代，實(shí)驗(yàn)時(shí)抽取腹水，經(jīng)過(guò)一定稀釋后皮下接種構(gòu)建模型，接踵后第二天開(kāi)始給藥，給藥7到10天，接種10天后結(jié)束試驗(yàn)，剝?nèi)∧[瘤稱瘤重。i. 關(guān)于構(gòu)建瘤種：可以用體外細(xì)胞株培養(yǎng)后，用PBS懸浮至13106/0.1ml/mouse，i.p接種即可，最好用6號(hào)左右的針頭，就是常用的2ml一次性注射的針頭。ii. 關(guān)于腹水傳代：觀察到第一代的種鼠肚子較大后（一般約89天左右），可以傳代，傳代時(shí)取1ml注射器，用2ml注射器的針頭，種鼠腹部消毒后直接將針頭插入抽取腹水即可，注意不要把針頭插得很深，盡量淺一點(diǎn)，還可以把老鼠拎起來(lái)，利用重力，讓腹水集中在某處便于抽取，一般抽個(gè)0.5ml就可以了，不用離心，直接用PBS36倍稀釋后，接種到新的老鼠腹腔，腹水顏色為白色或者略有發(fā)黃都是正常的，但是血性腹水說(shuō)明不好，需要注意調(diào)整，第二代以后，盡量67天的時(shí)候傳代，不要等的時(shí)間太久，否則腹水容易血性。三代后可用于試驗(yàn)。iii. 關(guān)于接種進(jìn)行試驗(yàn)：這個(gè)時(shí)候抽取的腹水需要量比較多，一般需要處死種鼠后，小心地用消毒眼科剪刀鑷子剝開(kāi)腹部皮膚，注意不要弄破肌肉，然后，用鑷子（最好是那種前面有倒勾的鑷子，學(xué)名好像是唇型鑷）拎起腹部的肌肉，用剪刀剪開(kāi)一個(gè)小口，然后用玻璃滴管或者去掉針頭的注射器吸取腹水。然后經(jīng)過(guò)一定的稀釋后，接種到小鼠的腋下。關(guān)于稀釋量，各個(gè)實(shí)驗(yàn)室的情況都不一樣，最好摸索一下，開(kāi)始的時(shí)候可以適當(dāng)?shù)挠?jì)數(shù)，但是要用臺(tái)盼蘭染色后計(jì)活細(xì)胞數(shù)。接種部位在小鼠腋下，但是不要深入到腋窩里面，會(huì)給以后的操作帶來(lái)麻煩。接種時(shí)的進(jìn)針處離接種處遠(yuǎn)一點(diǎn)，讓針頭在皮下多走一段，不容易污染。有的人接種的時(shí)候喜歡針頭向上用力，緊貼著表皮往里走，然后注射的時(shí)候感覺(jué)阻力較大，打出來(lái)的皮丘又緊又圓，這樣的接種，會(huì)使腫瘤與皮膚嚴(yán)重粘連，不利于最后腫瘤的剝?nèi)?。也不要緊靠肌肉，腫瘤會(huì)與肌肉嚴(yán)重粘連。應(yīng)該在兩者之間，進(jìn)針的感覺(jué)輕松自如，針頭很自由，雖然打出來(lái)的腫瘤不會(huì)很圓很漂亮，但是相對(duì)好剝?nèi)∫恍?。iv. 關(guān)于觀測(cè)指標(biāo)：主要是按時(shí)稱體重，試驗(yàn)結(jié)束后剝?nèi)∧[瘤稱瘤重。因?yàn)槌隽鲆呀?jīng)是接種后的第6天左右了，第10天就結(jié)束時(shí)間，瘤體積的數(shù)據(jù)意義就不大。小鼠腫瘤很難剝，這是沒(méi)有辦法的，只能耐心，沒(méi)有太好的辦法，剝多了以后，手上會(huì)掌握一些巧力，有一些幫助，但是我們還是很頭痛小鼠腫瘤試驗(yàn)結(jié)束。腫瘤組織周?chē)?jīng)常會(huì)有一些血竇的形成，弄破后會(huì)有血和黃色的液體流出，正常的，但是剝瘤子的時(shí)候不要把它弄破，會(huì)嚴(yán)重影響瘤重。按照SFDA的規(guī)定，平均瘤重小于1g，或者單個(gè)瘤重小于200mg，認(rèn)為腫瘤生長(zhǎng)不良，試驗(yàn)作廢。b) 第二類