谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶的制備及動力學(xué)研究PPT演示課件

1,谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶的制備及動力學(xué)研究,實驗內(nèi)容：（一）親和層析法制備谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶（二）測定酶活力、米氏常數(shù)和最大反應(yīng)速度（三）Folin-酚法測定蛋白質(zhì)含量，計算比活力,2,谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶簡介,谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶（GlutathionS-transferases，簡稱GSTs，EC2.5.1.18）廣泛存在于動物和人體的各種組織，哺乳動物肝臟中含量最高，約占肝可溶性蛋白的10%。GST是機體內(nèi)一組具有重要解毒作用的同工酶家族，均為由兩個亞基組成的二聚體，相對分子質(zhì)量為4500049000，各同工酶的等電點不同，多為堿性同工酶。,3,兔肝勻漿液及純化樣品SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜,4,GST參與芳香環(huán)氧化物、過氧化物和鹵化物的解毒作用，GST催化這些帶有親電中心的疏水化合物與還原型谷胱甘肽（GSH）的親核基團GS反應(yīng)，中和它們的親電部位，使產(chǎn)物水溶性增加，經(jīng)過一系列代謝過程，最后產(chǎn)物為巰基尿酸，被排出體外，從而達到解毒目的。另外，GST還能共價或非共價地與非底物配基以及多種疏水化合物結(jié)合，具有結(jié)合蛋白的解毒功能。,5,親和層析原理,有很多生物大分子與相應(yīng)的分子間具有專一的可逆結(jié)合的特性，如酶與其底物、抑制劑、輔助因子，抗體與抗原，核酸與互補的堿基序列、核酸聚合酶、結(jié)合蛋白，激素與其受體、載體蛋白，細胞與其表面特異蛋白等等，它們依靠分子間的氫鍵、范德華力進行結(jié)合，這種專一的可逆結(jié)合力的稱為親和力。親和層析的方法就是根據(jù)具有親和力的生物分子間可逆地結(jié)合和解離的原理建立和發(fā)展起來的。,6,將一對能可逆結(jié)合和解離生物分子的一方作為配基，與具有大孔徑、親水性的固相載體相偶聯(lián)，制成專一的親和吸附劑，當被分離物隨著流動相經(jīng)過親和吸附劑時，親和吸附劑上的配基就有選擇地吸附待分離物質(zhì)，通過解吸附使待分離物質(zhì)得以純化。親和層析的優(yōu)點：專一性結(jié)合，分辨率高，操作簡單，通過一次性操作即可得到較高純度的分離物質(zhì)；具有濃縮作用，可以從含量很低的溶液中得到高濃度的樣品；利用生物學(xué)的特異性進行分離，所以分離條件比較溫和，能夠很好地保持樣品原有的生物學(xué)性質(zhì)。,7,親和層析法分離生物大分子示意圖,8,9,親和層析介質(zhì)的制備,配基的選擇：選擇合適的配基是親和層析中的重要環(huán)節(jié)，配基可以是有機小分子、生物大分子、染料等。根據(jù)待分離物質(zhì)在溶液中與配基之間的親和力的大小和專一性等特性進行選擇，通過實驗來確定理想的配基。例如選擇酶的競爭性抑制劑、底物和輔助因子類配基可以純化酶，選擇互補的堿基序列、組蛋白、核酸聚合酶、核酸結(jié)合蛋白類配基可以純化核酸等等。在親和層析中，分離生物大分子的配基必須有適當?shù)幕瘜W(xué)基團能與活化基團發(fā)生偶聯(lián)作用，有較高的偶聯(lián)率，偶聯(lián)后配基和被分離生物大分子的專一結(jié)合特性不變，有效地分離目標產(chǎn)物；解吸附時不破壞生物大分子的生物活性和理化性質(zhì)。,10,載體的選擇：親和層析的載體一般是凝膠類層析介質(zhì)。一般比較理想的載體應(yīng)具備稀松的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，對于溶液具有良好的親水性、流動性和滲透性，大孔徑凝膠介質(zhì)可以有效地使凝膠內(nèi)部的羥基得到活化，以保證較高的活化效率，提高了配基的有效濃度，提供較高的親和容量；必須有足夠數(shù)量的化學(xué)基團，經(jīng)化學(xué)方法活化后，可以與大量的配基相偶聯(lián)；具有良好的機械性能，保證親和柱維持較好的流速；必須是不溶于水、化學(xué)惰性的，非特異性吸附作用弱；有良好的物理和化學(xué)的穩(wěn)定性，在配基偶聯(lián)、親和層析、再生處理過程中不會因離子強度、溫度、pH的變化，變性劑、去污劑的應(yīng)用而破壞載體的物理化學(xué)結(jié)構(gòu)，在介質(zhì)的反復(fù)使用過程中能抗微生物和酶的侵蝕。,11,瓊脂糖凝膠：目前應(yīng)用最多的瓊脂糖凝膠是瑞典Pharmacia公司生產(chǎn)的Sepharose，它具有理想載體的特性。它是由D-半乳糖和3,6-脫水-L-半乳糖交替結(jié)合而成的大分子多聚糖，靠糖鏈之間的次級鍵交聯(lián)成的穩(wěn)定網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的珠狀凝膠，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的疏密依靠改變瓊脂糖濃度的方法來控制。如Sepharose2B，4B和6B，其中阿拉伯數(shù)字表示凝膠中干膠的百分含量，機械強度隨凝膠濃度降低而減弱。目前廣泛使用Sepharose4B來分離生物大分子，本實驗采用的是本院自己研制的SepharoseQT4，相當于Sepharose4B。瓊脂糖凝膠的多聚合鏈不是由共價鍵連接而成的，在使用中應(yīng)當注意的問題有受熱失去穩(wěn)定性，引起部分溶解，故不宜加熱消毒，低溫保存，凍結(jié)會破壞其結(jié)構(gòu)，要避免在pH低于4高于9下長期工作，使用破壞氫鍵的試劑會降低凝膠的穩(wěn)定性，一般情況下不能進行干燥，適宜濕態(tài)保存。,12,常用活化劑：活化劑一般用溴化氰和環(huán)氧氯丙烷較多，二者各有利弊：(1)溴化氰：溴化氰活化載體是目前用得最多、效果最好的活化方法?；罨矢撸俣瓤?。缺點是溴化氰容易分解產(chǎn)生劇毒的氫氰酸及溴，活化臂短，不利于生物大分子的結(jié)合。(2)環(huán)氧氯丙烷：環(huán)氧氯丙烷活化效率高，活化臂較長，有利于生物大分子的結(jié)合。毒性很小，可以在常規(guī)條件下操作。缺點是活化溫度較高，4550，活化時間較長。,13,偶聯(lián)條件的選擇：(1)偶聯(lián)pH值：配基偶聯(lián)最佳pH在8-10之間最有效，在這個pH范圍內(nèi)配基上的氨基多是非質(zhì)子化形式，要盡可能地選用堿性條件。但是在高pH值時，可能會改變配基的高級結(jié)構(gòu)，甚至喪失活性，所以在偶聯(lián)時pH的選擇要根據(jù)具體情況而定。(2)偶聯(lián)溫度和時間：溴化氰活化的載體，一般都在4左右偶聯(lián)過夜，也可以室溫（20-25）下反應(yīng)2h。環(huán)氧氯丙烷活化的載體，一般在3545偶聯(lián)。偶聯(lián)時間要根據(jù)配基的濃度來確定，一般情況要1624小時。(3)偶聯(lián)配基的濃度：偶聯(lián)時并不總是需要大量的配基才能制成高效的親和吸附劑，高濃度配基的偶聯(lián)可以增加結(jié)合強度、空間位阻和非特異性結(jié)合，空間位阻可以引起親和吸附劑結(jié)合效率的降低，尤其是當高濃度大分子蛋白被偶聯(lián)時。對于多數(shù)親和吸附劑選用的配基濃度是1-20mol/mLgel，2mol/mL是最常用的配基使用量。,14,親和層析技術(shù),吸附條件的選擇：純化生物大分子一般采用柱層析吸附法，根據(jù)親和吸附劑的吸附容量和待分離物質(zhì)的總量選擇大小合適的層析柱。選擇吸附條件時要考慮平衡緩沖液的組成、pH范圍和離子強度，樣品上柱的體積、溫度和流速等因素，使親和介質(zhì)與被分離物質(zhì)具有較強的親和力。樣品溶液的pH和離子強度要與平衡緩沖液一致，一般接近中性。假如樣品中雜質(zhì)多，純化對象與配基結(jié)合力弱時，可以控制樣品上柱的流速或重復(fù)過柱，以使純化對象與配基間充分起作用。樣品上柱后，用平衡緩沖液除去未吸附的雜蛋白，也可以用較高離子強度的鹽溶液進一步洗去非專一吸附的雜質(zhì)，盡可能在親和柱上只留下專一吸附的結(jié)合物。,15,洗脫條件的選擇：親和層析的洗脫屬于特異性的解離方式，洗脫劑的選擇必須不引起待分離物的變性失活。洗脫劑多數(shù)采用改變層析條件如改變pH、離子強度或緩沖液組成的方法，使固定化配基和生物大分子之間的親和力降低，以致解開二者的結(jié)合。主要有幾種基本洗脫類型：(1)競爭性洗脫：特異的配基競爭性洗脫或底物競爭性洗脫，即在洗脫液中加入與親和吸附劑上相同或不同的配基，這些水溶性的配基和固定相配基相互競爭與大分子結(jié)合，由于前者游離的配基較高，結(jié)合力大大超過后者時，將被吸附的大分子洗脫下來。使用親和力更強的配基或底物洗脫效果更好。洗脫液中配基或底物的濃度要根據(jù)配基與結(jié)合物親和力的大小來決定。(2)離子強度洗脫：洗脫液離子強度增加有利于洗脫，可以是一步法或梯度變化，在強離子的作用下，使親和層析的結(jié)合力減弱，將被吸附物洗脫下來。增加鹽濃度可以使被吸附物解吸附，NaCl是最常用的鹽。,16,(3)pH離子強度洗脫：pH的變化改變結(jié)合位點上帶電基團的離子化程度，解吸附一般是降低pH，pH使用的限度要考慮載體、配基和被吸附物質(zhì)的化學(xué)穩(wěn)定性。pH變化和離子強度雙重作用洗脫適合結(jié)合得比較牢的物質(zhì)。(4)變性劑洗脫：有的蛋白質(zhì)在親和介質(zhì)上結(jié)合得比較牢固，在一定濃度的變性劑中有較好的穩(wěn)定性，這樣可以在洗脫液中加入變性劑，如鹽酸胍，尿素等，有利于蛋白質(zhì)的解離。另外，親和介質(zhì)多次使用后，柱效下降，用變性劑可以將吸附比較牢固的雜質(zhì)洗凈，使親和介質(zhì)再生。(5)化學(xué)斷裂：當一些蛋白質(zhì)與親和吸附劑結(jié)合牢固，上述洗脫方法或用上述方法洗脫被吸附的大分子會發(fā)生不可逆失活時，可以采用專一的化學(xué)方法將配基和載體之間的連接鍵裂解，獲得配基蛋白質(zhì)復(fù)合物。這個方法的缺點是親和吸附劑使用一次后，需要重新與配基偶聯(lián)后，才能再次使用。,17,洗脫方式：親和層析的洗脫方式，原則上與離子交換層析的洗脫方式相似，主要有以下三種方式：(1)一步洗脫：屬于非選擇性洗脫方法，應(yīng)用于高度特異性吸附劑的結(jié)合，經(jīng)過一次洗脫將被吸附物質(zhì)全部洗脫下來，就可得到較純的分離物。非選擇性洗脫主要受洗脫液的pH、離子強度、溫度和介電常數(shù)等因素的影響，有效的洗脫液既能改變被吸附蛋白質(zhì)的構(gòu)象以降低蛋白質(zhì)與配基之間的親和力，又不破壞蛋白質(zhì)和親和吸附劑的穩(wěn)定性。(2)分步洗脫：屬于選擇性洗脫方法，應(yīng)用于基團特異性吸附劑，親和吸附劑上吸附有特異性不盡相同的多組分樣品，用幾種不同的洗脫條件分幾步洗脫，可以將親和力大小不同的組分分開。(3)梯度洗脫：屬于選擇性洗脫方法，利用洗脫液的濃度梯度變化，即解吸附能力逐漸增強，對于吸附性質(zhì)相同、特異性程度不同的酶和同工酶有效地洗脫。梯度洗脫比分步洗脫更有可能得到較純的分離對象。此方法需要有梯度混合儀來實現(xiàn)洗脫液的梯度變化。,18,影響親和層析的主要因素：(1)樣液體積的影響：在平衡條件下分離對象與固定化配基能緊密結(jié)合時，樣品溶液上柱時對體積要求不很嚴格，親和吸附劑的吸附總?cè)萘磕鼙怀浞掷?。與吸附劑結(jié)合力弱的樣品濃度要高，避免和非吸附物質(zhì)一起流掉。(2)流速的影響：發(fā)生親和吸附時配基與生物大分子之間達到結(jié)合反應(yīng)平衡是一個緩慢的過程，因此樣品上柱的流速應(yīng)保證被結(jié)合物與配基之間有足夠的時間達到吸附平衡，尤其是弱的親和吸附劑。如果流速較快，樣品中蛋白質(zhì)濃度又相對高時，往往有少量的待分離樣品和雜蛋白一起流出柱子，所以親和層析上柱樣品濃度大時，如組織勻漿液、腹水等，上柱前可將溶液適度稀釋，降低溶液的粘度并使親和吸附反應(yīng)完全。洗脫時為得到尖銳的洗脫峰、被分離物最小的洗脫體積和最大的回收，一般采用低的洗脫速度。,19,(3)柱長的影響：多數(shù)情況下根據(jù)親和介質(zhì)的吸附容量和待純化樣品的總量確定柱子的大小。如果親和介質(zhì)的吸附容量高，可選擇較短的柱子，用較慢的線性流速，使待分離物質(zhì)得以快速分離；如果親和吸附劑的親和性很低，選擇相對較長的柱子，保證待分離物與親和介質(zhì)有充分接觸的時間，使二者較好地結(jié)合。(4)溫度的影響：溫度效應(yīng)在親和層析中非常重要，親和介質(zhì)的吸附強度隨溫度升高而減小。所以在親和層析中可以利用不同的溫度吸附和洗脫有利于蛋白質(zhì)的親和純化，以得到親和層析最好的結(jié)果。一般選擇在4進行吸附，在不影響生物大分子活性的較高溫度下如25進行洗脫。,20,親和層析法分離GST的試劑,緩沖液A：0.025mol/L磷酸鹽緩沖液，pH7.4，含3mmol/L二硫蘇糖醇（DTT），1mmol/LEDTA，0.2mol/LNaCl緩沖液B：0.025mol/L磷酸鹽緩沖液，pH7.4，含3mmol/LGSH，2mmol/LDTT注：根據(jù)酶的性質(zhì)在分離純化過程中需要加入適量的金屬鰲合劑、還原劑等，以保持酶的活性。,21,親和層析法分離GST操作步驟,1.親和層析介質(zhì)Sepharose4B-GSH的制備：Sepharose4B在堿性條件下，加入環(huán)氧氯丙烷和二氧六環(huán)活化，將GSH偶聯(lián)到載體上，制成專一吸附劑。2.親和層析柱的準備：裝柱，柱床體積約46mL（柱高約23cm），連接蛋白監(jiān)測系統(tǒng)，用BufferA平衡